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Acta Agronómica

Print version ISSN 0120-2812

Acta Agron. vol.62 no.1 Palmira Jan./Mar. 2013

 

Evaluación de medios de cultivo para propagación in vitro de semillas y explantes de especies silvestres de Solanum

Evaluation of cultivation media for in vitro propagation of seeds and explants from wild Solanum species

Danita Andrade Díaz1, Mónica Eliana Córdoba Figueroa2, Hernando Criollo Escobar3 y Tulio César Lagos Burbano4

1I.A., Grupo de Investigación en Frutales Andinos; 2I.A., Secretaria de Agricultura del municipio de Ipiales; 3Ph.D, Departamento de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia; 4Ph.D, Departamento de Recursos Naturales y Sistemas Agroforestales, Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia. Autor para correspondencia: tclagosb@udenar.edu.co

Rec.: 21.10.11 Acep.: 08.09.13

Resumen

Se evaluaron los medios de cultivo Hussey-Stacey (A), Hendrix et al. (H), Atkinson et al. (AT) y mitad de Murashyge y Skoog (½MS) para la propagación in vitro de semillas y explantes de Solanum mammosum, S. marginatum, S. hirtum y S. umbellatum. En la fase de propagación sexual se evaluó el porcentaje de germinación, número de raíces, longitud de planta, días a formación de hojas y raíces, días a morfogénesis completa y materia seca. Se determinó el tipo de morfogénesis a través de callos, vástago y plantas totalmente formadas. Se estudiaron el número y longitud de brotes, número de raíces y hojas, producción de materia seca y días a morfogénesis completa. Para S. mammosum el mejor medio de germinación fue ½MS, para el desarrollo de plantas fue A y para propagación vegetativa, A-Nudos (Medio A con explantes tipo nudos). En el mismo orden, para S. marginatum fueron los medios A, H y ½MS y/o H con nudos, mientras que en S. hirtum fueron H,A y H-nudos. Para S. umbellatum no se encontraron diferencias en germinación entre H, ½MS y A. Para la formación de plantas el mejor medio fue ½ MS y para propagación vegetativa fue H-Nudo.

Palabra clave: Cultivo de tejidos, morfogénesis, nudos, propagación in vitro, solanáceas silvestres.

Abstract

Hussey, Stacey (A), Hendrix et al, (H), Atkinson et al, (AT) and half Murashyge and Skoog (½ MS) cultivation media were evaluated for in vitro propagation of seeds and explants of Solanum mammosum, S. marginatum, S. hirtum and S. umbellatum. During the sexual propagation phase the germination percentage, root number, length of plant, days to formation of leaves and roots, complete morphogenesis days and dry matter was evaluated. The morphogenesis type was determinated through callus, stem and fully formed plants. Number and length of shoots, number of roots and leaves, dry matter and morphogenesis days were studied. For S. mammosum the best germination medium was ½ MS, for the development of plants was A and for vegetative propagation, A-KNOTS. In the same order as for S. marginatum are media A, H and ½ MS and/or H knots, while in S. hirtum are H,A, and H-knots. For S. umbellatum there were not significant differences between H, ½ MS and A in germination. For the formation of plants was ½ MS and vegetative propagation H-Knot.

Key words: Knots, morphogenesis, tissue culture, wild solanaceae.

Introducción

Las especies silvestres son de utilidad para el mejoramiento de los cultivos comerciales de importancia económica ya que son fuente de variabilidad genética y constituyen una alternativa para la solución de problemas relacionadas con sanidad vegetal debido a sus características deseables como resistencia a plagas y enfermedades. un ejemplo es el híbrido La Selva, un cultivar mejorado de lulo obtenido del retrocruzamiento interespecífico entre S. hirtum x S. quitoense, el cual muestra resistencia al ataque de Meloidogyne spp. (Bernal et al., 1998).

Solanum quitoense es una especie en proceso de domesticación con bajo nivel de selección, por tanto es susceptible a muchas limitantes de tipo fitosanitario, especialmente relacionadas con el sistema radicular. La variedad de lulo Castilla, la más cultivada en la región alto-andina del sur de Colombia, alcanza un promedio de producción de frutos de 27 t/ha destinada al consumo en fresco. Debido a que dentro de esta variedad no se conocen fuentes de resistencia a problemas radiculares, es necesario involucrar en programas de mejoramiento especies silvestres relacionadas que posean dichas características.

Según Bernal et al. (2002) y Angulo (2006) existen solanáceas silvestres compatibles para injerto con lulo cultivado, entre estos S. hirtum resistente a Fusarium sp. Algunas especies relacionadas con lulo, como S. sessiliflorum y S. marginatum, son resistentes a F. oxysporum (Betancourt et al., 2006). Solanum umbellatum posee resistencia a nematodos del género Meloidogyne sp., es altamente compatible en injerto con tomate de árbol (Cyphomandra betacea) y tiene resistencia a factores como estrés por sequía y humedad excesiva en el suelo (Nee, 1991). En Colombia aún no se ha evaluado el comportamiento agronómico de injertos de lulo de Castilla con patrones silvestres de la familia Solanaceae, tampoco se conocen trabajos relacionados con la propagación in vitro de especies silvestres como S. mammosum, S. hirtum, S. umbellatum y S. marginatum, que pueden servir como patrones en la producción de injertos de lulo de Castilla (S. quitoense) resistentes a enfermedades radiculares

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar los medios de cultivo Hussey-Stacey (A), Hendrix et al. (H), Atkinson et al. (AT) y mitad de Murashyge y Skoog (½MS). para la propagación in vitro de semillas y explantes de S. mammosum, S. hirtum, S. umbellatum y S. marginatum.

Materiales y métodos

Localización. El estudio se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Universidad de Nariño, Ciudad Universitaria Torobajo, del municipio de Pasto (Colombia), a 2540 msnm., 01° 12'13" N y 77° 15'23" O, a 20 °C, una humedad relativa de 75% y un fotoperiodo de 16 h luz.

Material vegetal. Las semillas de S. hirtum fueron suministradas por el Programa de Producción de Frutales Andinos, adscrito a la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Nariño y las de S. mammosum, S. umbellatum y S. marginatum fueron suministradas por el Banco Nacional de Germoplasma de Recursos Fitogenéticos, a cargo de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica).

Propagación in vitro. En cada especie se realizaron sendos ensayos, con semillas y con explantes. En el primero se evaluaron cuatro tratamientos que correspondieron a los medios de cultivo propuestos por Segovia et al. (2002): Hendrix (H), Atkinson (AT), mitad de Murashige y Skoog (½ MS), Hussey y Stacey (A) (Tabla 1). Cada tratamiento consistía en cinco repeticiones de 100 semillas cada una, obtenidas con 8 días de anticipación y distribuidas en cantidades iguales en cuatro recipientes. Las observaciones se hicieron diariamente durante 60 días y se utilizó el diseño irrestrictamente al azar, siendo la unidad experimental y de muestreo cada uno de los recipientes.

Variables evaluadas. Las variables consistieron en porcentaje de germinación (PG), número de raíces por planta (NR), longitud de planta (LP), días a formación de hojas (DFH), días a formación de raíces (DFR), días a morfogénesis completa (DMC) y producción de materia seca (MS). Los datos del porcentaje de germinación (PG) fueron transformados mediante arcÖ%. Estas variables se sometieron a análisis de varianza (Andeva). Cuando se detectaron diferencias significativas (P < 0.05) entre los tratamientos, se realizó la prueba de comparación de medías por Diferencia Mínima Significativa (DMS).

Como explantes se utilizaron segmentos de 5 mm de largo de hipocotilos, epicotilos y nudos de las especies S. mammosum, S. hirtum, y S. marginatum, y en S. umbellatum hojas cotiledonales de 12 días de formación en lugar de epicotilos, con los mismos medios que en el caso del ensayo con semillas. En ambos ensayos se utilizó un diseño factorial 4 x 3 con cinco repeticiones, donde cada repetición estaba formada por cuatro recipientes y en cada uno se sembraron dos explantes para un total de ocho explantes por repetición.

En este trabajo se evaluaron los tipos de morfogénesis: sin morfogénesis (SM), callos (C), tallo con hojas o vástago (V) y plantas completamente formadas (P), como porcentajes. Se estudiaron, además, las variables número de brotes (NB), longitud de brotes (LB), número de raíces (NR), número de hojas (NH), producción de materia seca (MS) y días a morfogénesis completa (DMC). Las variables expresadas en porcentajes se transformaron mediante arcÖ%. Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (Andeva). En aquellos casos donde la interacción medio por explante no fue significativa se analizaron los efectos simples para medios y explantes; de lo contrario, se analizó solamente la interacción.

Resultados y discusión

Propagación por semillas

En algunas variables de las especies estudiadas se encontraron diferencias (P < 0.05) entre los medios de cultivo, las cuales se deben, posiblemente, a los cambios en las composiciones especialmente en los reguladores de crecimiento, lo que puede ser de utilidad para obviar efectos de genotipo (Roca et al., 1991).

En general, los porcentajes de germinación (PG) fueron bajos (Tabla 2), excepto en el medio Hendrix (H) para S. hirtum (94.4%) y ½MS para S. mammosum (90.6%). Los PG fueron muy variables, lo que no garantiza un medio óptimo para la germinación de las especies en estudio ni su respuesta consistente en un medio. Debido a la condición silvestre de las especies y al hecho de que los medios no garantizan la presencia de algunos elementos exógenos que influyen en el rompimiento de la latencia de las semillas, los procesos metabólicos y morfogenéticos que influyen en la germinación son afectados por las características y la composición de los medios de cultivo, favoreciendo o limitando la germinación, dependiendo del genotipo. Estos medios pueden promover la pérdida de sustancias inhibidoras de la germinación o la acumulación de sustancias promotoras pero, en general, reajustan el equilibrio hormonal de la semilla o la sensibilidad de sus tejidos frente a las distintas sustancias activas (Azcon-Bieto y Talon, 1993).

Morfogénesis de plántulas obtenidas a partir de semillas.

Las plántulas de S. mammosum en el medio A presentaron los valores (entre paréntesis) siguientes: NR (6 raíces), LP (5.45 cm), NH (4 hojas), DFR (5 días), DMC (9 días) y producción de MS (0.043 g). Para DFH después de 9 días no se observaron diferencias entre los medios A y AT (Tabla 2).

En S. hirtum, las variables LP, DFH, DFR y DMC no variaron entre medios A, H y ½MS. No obstante, en el medio AT se observaron los mejores promedios en NR (4 raíces) y producción de MS (0.034 g). El NH fue similar en los medios A y AT y mayor (P < 0.05) que en H y ½MS. Lentini et al. (2004) encontraron en plantas de S. quitoense sembradas con aireación en medio A un desarrollo radicular más temprano y abundante que en los medios ½MS, H y AT; no obstante en estos últimos las plántulas presentaron mayor expansión de hojas y altura de planta. En los medios evaluados, las plántulas presentaron más de 4 raíces; aunque a los 60 días las plantas en el medio ½MS presentaron raíces más desarrolladas, los valores no fueron diferentes a los obtenidos en el medio A (P >0.05).

Solanum marginatum en medio de cultivo H presentó los mejores resultados en las variables NR (18 raíces) y LP (6.58 cm); mientras que para DFR, DFH y DMC los resultados fueron similares a los obtenidos con el medio ½MS. Para el NH (5 hojas) no se observaron diferencias entre los medios H y A y los mejores valores de producción de MS se encontraron en el medio AT (Tabla 2).

En S. umbellatum los valores de las características morfológicas estudiadas fueron muy variables entre medios, así, la LP (2.05 cm) fue mayor en el medio ½MS y los valores de NR = 11; NH=5 y MS = 0.03 lo fueron en medio ½MS.

Tanto en S. marginatum como en S. umbellatum, Segovia et al. (2002) y Hendrix et al. (1987) observaron comportamientos similares a los de S. quitoense para el NR en ensayos sin aireación con medios ½MS y H; no obstante en el presente estudio se presentaron raíces más abundantes. El ancho de hoja de las plantas fue mayor en medio ½MS que en los medios H y AT, pero la LP fue mayor en estos últimos.

De acuerdo con Gamborg et al. (1975) el éxito en cultivo de tejidos depende de la selección del medio, incluyendo su composición química y su forma física. En los medios evaluados se utilizaron sales del medio basal MS, excepto en ½MS que contenía 50% de la concentración de elementos inorgánicos manteniendo el nivel de hormonas propuesto por Segovia et al. (2002). Teniendo en cuenta que las hormonas en diferentes combinaciones determinan el crecimiento de los órganos en la planta (López, 1993) e interactúan con otros factores como el genotipo, la temperatura y la luz, es difícil hallar un medio que sea eficiente en la producción de plantas a partir de semillas en especies silvestres (Roca, 1991).

Propagación in vitro de explantes

En S. mammosum la interacción medio por explante no fue significativa (P > 0.05) para todas las variables evaluadas, excepto para SM, lo que indica que los niveles del medio no afectaron de manera diferencial al explante y que estos no necesitaron un medio específico para su desarrollo. Esta especie no mostró variación en características como C, P, NB, LB, NH y DMC ni entre los medios AT, H y ½MS, excepto para C (Tabla 3). Con el medio A se presentaron los mejores valores (P < 0.05) para P (59.3%), en NB (2 brotes) y NH (3 hojas). En este caso no se observaron diferencias (P > 0.05) en longitud de planta entre los medios A (0.63 cm), H (0.37 cm) y ½MS (0.41 cm). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Segovia et al. (2002) en variedades de S. quitoense.

Los mayores beneficios del medio A fueron debidos a la presencia de vitaminas esenciales como pantotenato de calcio y a la alta concentración de ácido nicotínico. El requerimiento de vitaminas varía de acuerdo con los tipos de planta y de cultivo (Morel, 1946); Linsmaier y Skoog (1965) encontraron que la supresión de algunas vitaminas favorece el desarrollo de las plantas. El pantotenato de calcio es poco utilizado, pero se ha demostrado su papel importante en el cultivo de algunos tejidos (George, 1993).

En los explantes de S. mammosum cultivados in vitro se observó que la siembra de nudos presenta los mejores valores en las variables evaluadas, excepto para la formación de callo. Este cultivo de nudos resultó ser el más apropiado para la producción de plantas alcanza 73.3% de plantas formadas, superando ampliamente a los cultivos de hipocotilos y epicotilos, que son adecuados para la producción de callos (Tabla 4).

En S. marginatum la interacción medio de cultivo por explante fue significativa (P < 0.05) en todas las variables evaluadas (Tabla 5). En P (plantas formadas) no se presentaron diferencias (P > 0.05) entre los tratamientos A-Hipo, A-Nudo, H-Nudo y ½MSNudo, obteniéndose con ellos el mayor número de plantas (41 – 42.2%). Para el NB los mejores resultados se obtuvieron con los tratamientos A-Nudo y ½MS-Nudo. El tratamiento H-Nudo presentó los mejores resultados en LB (1.94 cm), NR (3 raíces) y NH (3 hojas). Para la producción de MS los mejores tratamientos fueron AT-Nudo (30 mg) y ½MS-Nudo (40 mg) y para DMC fue H-EPI.

En S. umbellatum la interacción medio de cultivo por explante fue significativa para SM y C, con mayor porcentaje de callos en AT-Coti, AT-Hipo, H-Coti, H-Hipo, ½MS-Coti y ½MS-Hipo entre 54% y 56.2%. El efecto entre medios de cultivo fue diferente (P < 0.05) en P, V, NB, NR, NH y DMC y el explante en P, V, NB, LB, NR, NH y DMC. La interacción medio de cultivo por explante, así como entre medios y entre explantes no fueron significativas para MS. El cultivo de nudos presentó los mejores resultados en las variables analizadas, excepto para DMC; cuando se compara con el uso de hipocotilos y epicotilos (ver Tabla 4). Los resultados muestran una respuesta diferencial entre las especies, dependiente del genotipo. Algunas respuestas genotipo-dependientes son causadas por la interacción entre la planta y el medio de cultivo o la hormona utilizada (George, 1993).

Para S. hirtum los resultados muestran que la interacción medio de cultivo por explante fue significativa (P < 0.05) en SM, C, LB, NR y MS. Por otra parte, se observaron diferencias entre medios para P, V, NB, NH y DMC, y de explantes en P, V, NB, NH y DMC. El mayor número de C se obtuvo con AT-EPI, AT-Hipo, H-Epi, H-Hipo, ½MS-Epi Y ½MS-Hipo con porcentajes que varían entre 53.7% y 57%. En LB y NR el mejor promedio se obtuvo con H-Nudo (5.39 cm y 6 raíces). Para MS no hubo diferencias entre AT-Nudo (40 mg), H-Nudo (28mg) y ½MSNudo (26 mg) (ver Tabla 4). Para medios de cultivo (ver Tabla 3) el mayor porcentaje de P se obtuvo con el medio H (40.7%). Para V y NB los mejores resultados se obtuvieron con el medio A; en NH no se encontraron diferencias entre los medios A y H y para DMC los medios A, AT y ½MS (3 días) fueron similares.

Con explantes, el cultivo de nudos presentó los mejores resultados para P (48.4%), V (35%), NB (2 brotes) y NH (4 hojas); mientras que para DMC no se encontraron diferencias entre hipocotilos y epicotilos (2 días, Tabla 4). Es frecuente que en iguales condiciones de medio y ambiente, la respuesta in vitro del cultivo de un explante sea diferente a la del cultivar empleado (Litz et al., 1984); no obstante estudios previos indican que es posible regenerar in vitro especies de Solanum a partir de diferentes explantes, incluyendo hojas, tallo, ápice e hipocótilo (Medina et al., 2008).

En la Foto 1 se observa que la organogénesis ocurrió principalmente con el cultivo de nudos el cual presenta grandes ventajas ya que está compuesto por células meristemáticas, un sitio de crecimiento activo que en un medio de cultivo compuesto por una auxina o citoquinina estimula el desarrollo de brotes y yemas hasta procesar individuos completos (Cheng, 1975; Evans et al., 1983).

La respuesta de los explantes cultivados in vitro puede variar con el estado de desarrollo, el factor genético y la edad ontogénica (Murashige, 1974). El cultivo de nudos involucra el aislamiento de una yema, lo que favorece la obtención de un nuevo individuo; por tanto, ha sido un tipo de explante bastante utilizado en la propagación de papa, yuca, tomate, pepino, pera y rosa (López, 1993). Además, los estímulos de yemas son más frecuentes en la rizogénesis; sin embargo, el origen del explante puede tener una influencia determinante, lo que sugiere que los efectos de los tratamientos pueden ser diferentes en cada especie (Mateo y Urbano, 1988).

En los estudios de Evans y Sharp (Evans et al.,1983) se demostró que la regeneración de especies como S. laciniatum y S. khasianum depende de las relaciones entre concentraciones altas de citocininas y bajas de auxina. En el caso del presente estudio es posible afirmar que S. mammosum no requiere reguladores de crecimiento para formar plantas completas a partir de explantes tipo nudo; mientras que para S. marginatum, S. umbellatum y S. hirtum es necesaria una relación auxina:citocinina igual a 1. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Yaguache y Armijos (2010) en la propagación de S. cajanumensis y Botero et al. (2011) en la regeneración de S. lycopersicum, quienes utilizaron relaciones de auxina/citocinina cercanas a 1.

Conclusiones

  • Los porcentajes de germinación de las semillas de las especies de Solanum utilizadas en este estudio fueron diferentes entre especies, siendo esta variable afectada principalmente por el medio de cultivo.
  • En S. mammosum el mayor porcentaje de germinación se obtuvo en el medio ½MS, mientras que para S. marginatum ocurrió con el medio Hussey-Stacey (A), para S. hirtum con el medio Hendrix (H) y para S. umbellatum en los medios H, ½MS y A.
  • La producción de plantas in vitro de S. mammosum fue mayor en el medio Hussey- Stacey (A), mientras que el medio Hendrix (H) fue mejor para S. marginatum, S. umbellatum y S. hirtum. Para explantes los mejores resultados en propagación vegetativa se obtuvieron con el cultivo de nudos.

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