http://dx.doi.org/10.15446/acag.v63n1.40557

¹Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, Facultad de Ciencias Agropecuarias. ²Facultad de Ciencias, UN-Bogotá Autora para correspondencia: mariaclaulb@gmail.com

En el estudio se evaluó la actividad antimicrobiana de metabolitos de Xenorhabdus bovienii (Enterobacteriaceae), mutualista del nematodo entomoparásito Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) clamidosporas, Cephalobina, Steinernematidae sobre Fusarium spp. y Basillus subtilis. Xenorhabdus bovienii, se extrajo a partir de larvas de Galleria mellonella infectadas con S. feltiae e incubadas en biorreactor. Su crecimiento fue medido en intervalos de 4 h durante 96 h de cultivo, en las cuales se extrajeron metabolitos por las metodologías: compuestos orgánicos, proteínas, indol, metanol, columna para cromatografía y butanol. Se utilizaron cuatro concentracciones de metabolitos de X. bovienii que se probaron contra B. subtillis y Fusarium spp., en semillas de tomate variedad Santa Clara mediante la medición del halo de inhibición (mm) por la presencia de macro y microconidias y clamidosporas. Xenorhabdus bovienii presentó mayor crecimiento y presencia de metabolitos entre 16 y 40 h de incubación. La máxima inhibición ocurrió con concentraciones de 100% durante los primeros muestreos. En Fusarium spp., la inhibición del crecimiento micelial coincidió con menor presencia de macro- y microconidias y clamidosporas. No se encontraron efectos fitotóxicos de los metabolitos probados sobre las plántulas de tomate.

Palabras clave: Bacillus subtillis., control biológico, Fusarium spp., metabolitos secundarios, Xenorhabdus bovienii.

The antimicrobial activity of metabolites of Xenorhabdus bovienii (Enterobacteriaceae) was evaluated, mutualist of the entomoparasite nematode Steinernema feltiae (Filipjev, 1934 Cephalobina, Steinernematidae) over Fusarium spp. and B. subtilis. X.bovieniiwas purified from Galleria mellonella larvae infected with S. feltiae and extracted in a bioreactor. Its growth was sampled at intervals of 4h for 96h of culture, a time on which metabolites were extracted by using six methods: organic compounds, proteins, Indole compounds, methanol, column chromatography and butanol. The metabolites extracted from X.bovienii at four concentrations were faced with B. subtilis and Fusarium spp. in tomato seeds, Santa Clara's variety. The inhibition halo (mm) was assessed for B. subtillis and for Fusarium in the presence of macro, microconidia, and chlamydospores. Phytotoxicity was assessed X. bovienii showed higher growth and the presence of metabolites in the first 16-20 h of incubation up to 40h. The maximum inhibition occurred at concentrations of 100% and early sampling. In Fusarium spp. mycelial growth inhibition coincided with a lower presence of macro, microconidia, and chlamydospores. No phytotoxic effects of the metabolites tested were observed. The potential of X. bovienii was tested for control of Fusarium spp. and B. subtilis as a microorganism sensitive to changes by these metabolites.

Key words: Bacillus subtillis, biological control, Fusarium spp, secondary metabolites, Xenorhabdus bovienii.

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una hortaliza de importancia económica en el Valle del Cauca, Colombia, donde se siembra en monocultivo por pequeños productores, sistema que ha incidido en el aumento de plagas y enfermedades que incrementan considerablemente los costos de producción. Varias especies del género Fusarium causan daños considerables en el tallo y la raíz de la planta de tomate, un hongo cuyas estructuras de resistencia (clamidosporas) pueden permanecer en el suelo durante años. Para el control de patógenos en tomate es frecuente la aplicación no controlada de altas dosis de productos de síntesis química, no obstante aquellos mutan y se adaptan con facilidad a las nuevas condiciones, lo que afecta el medio ambiente (Infoagro, 2011). Por lo anterior, es cada vez más urgente el uso de prácticas de control biológico que, comparadas con el uso de productos de síntesis química, son menos contaminantes del medio ambiente, ya que estos controladores y antagonistas tienen varias estrategias de acción; entre ellas la producción de metabolitos secundarios presentes en los organismos o sus simbiontes, los cuales pueden ser aislados y multiplicados para uso en este tipo de control (Xu, 1998).

El complejo S. feltiae - X. bovienii posee un amplio rango de hospederos y habilidades para buscar e introducir sus bacterias mutualistas dentro del cuerpo de los insecto, ocasionando septicemia dentro de 24 a 48 h siguientes y superando las reacciones inmunológicas presentadas en la hemolinfa como defensa celular (Parada et al., 2006; Martínez, 2010).

La cepa Colombia del ciclo de vida del complejo S. feltiae - X. bovieniii ha sido ampliamente documentado por Triviño (2006) y Martínez (2010). La capacidad de control biológico de este complejo se basa en el hecho de que la bacteria produce metabolitos secundarios con capacidad antibiótica, que actúan como alternativas de defensa y comunicación con otras especies. En X. bovienii se distinguen las fases de crecimiento FI y FII, las cuales en medio de cultivo se diferencian por su morfología, fisiología y expresión (Xu, 1998; Triviño, 2006).

En cultivos o en soluciones puras de especies de Xenorhabdus se han encontrado fuentes naturales de antibióticos como indoles, xenorhabdinas y xenocumacinas, que son de uso tanto para el área médica como en agronomía (Xu, 1998). Aunque en Colombia en la última década ha crecido el interés y la demanda por el uso de los nematodos entomoparásitos para el control de estas plagas (Parada et al., 2006), poco se ha explorado la actividad antimicrobiana de las bacterias asociadas con Xenorhabdus sp. y Photorhabdus sp., simbiontes de Steinernema spp. y Heterorhabditis sp., respectivamente. Este trabajo tuvo como objetivo contribuir al desarrollo de esta alternativa de control biológico y evaluar la actividad antimicrobiana de algunos metabolitos secundarios de la bacteria X. bovienii mutualista del nematodo entomoparásito S. feltiae (Filipjev, 1934) sobre aislados de Fusarium spp., habitante de suelo y de la rizosfera del cultivo de tomate.

El trabajo comprendió tres etapas: (1) obtención de cultivos puros de los microorganismos Fusarium spp., X. bovienii y B. subtilis, siendo esta última la bacteria control, dada su alta susceptibilidad a metabolitos de X. bovienii (Xu, 1998); (2) pruebas de patogenicidad para seleccionar los aislamientos de Fusarium spp., altamente patogénicos sobre tomate variedad Santa Clara. En esta misma etapa se determinó la cinética de crecimiento y se obtuvieron los metabolitos secundarios de caldo bacteriano de X. bovienii mediante seis metodologías de extracción; y (3) se evaluó la actividad antimicrobiana de los metabolitos sobre B. subtilis y Fusarium spp., su toxicidad sobre semillas y plántulas de tomate variedad Santa Clara.

Los muestreos de campo se realizaron en 2008, en los municipios de Santa Elena (SE), Guacarí (Gu), Media Canoa (MC), El Bolo (B), y Toro, en el departamento del Valle del Cauca, y en Puerto Tejada (PT) en el departamento del Cauca. Las muestras de suelo, tomadas en los cultivos y consistentes en rizosfera y material vegetal con posibles síntomas de Fusarium fueron analizadas en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. En los aislamientos se identificó Fusarium spp., el cual en forma pura se utilizó para las pruebas de patogenicidad en semillas de tomate variedad Santa Clara (Duarte, 2007). Como indicador se empleó un cultivo puro de B. subtillis, facilitado por la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, y altamente sensible a metabolitos de X. bovienii (Xu, 1998).

La obtención de los metabolitos secundarios de X. bovienii se hizo a partir de larvas de Galleria mellonella infectadas con S. feltiae e incubadas en biorreactor 3L con medio NBTA; posteriormente se estimó la cinética de crecimiento en intervalos de muestreo cada 4 h durante 96 h de cultivo. Del material recolectado se extrajeron metabolitos con los métodos propuestos por Xu (1998): 1. Compuestos orgánicos, 2. Proteínas, 3. Compuestos de indol, 4. Metanol, 5. Columna para cromatografía, y 6. Butanol.

Los metabolitos de X. bovienii fueron evaluados contra B. subtillis y Fusarium spp., en cuatro concentraciones (100, 75, 50 y 25%) para cada metodología de extracción, en donde se utilizaron sensidiscos (papel filtro, Wathman) durante 40 segundos, durante los cuales se observó la formación de halos de inhibición (mm), que fueron medidos 24 h después de sembrados e incubados con ambos microorganismos. Además, se observó la presencia de macro y microconidias y clamidosporas presentes en los medios de cultivo CLA (Carnation Leafpiece- Agar) y SNA (Spezielller Nahorstoffarer Agar) (Lara et al., 2010).

Para el estudio de la fitotoxicidad de estos metabolitos sobre los patógenos, las semillas de tomate impregnadas con cada solución se dividieron en cuatro grupos que fueron colocados en cajas de Petri con cada una de las cuatro diluciones, según las horas de cada tratamiento. Al finalizar este periodo fueron sembradas en suelo estéril y llevadas a cámara de crecimiento controlado. El monitoreo se hizo durante diez días hasta la obtención de plántulas de 10 cm de longitud, aproximadamente, teniendo en cuenta la formación de zonas decoloradas y la presencia de manchas. Los tratamientos se dispusieron en un diseño completamente al azar, los datos se analizaron con el programa SAS^® 9.2 y las comparaciones entre medias por la prueba de Duncan (P < 0.05).

Aislamiento de los microorganismos

De acuerdo con la escala de daño propuesta por Duarte (2007) - 0 = semilla sana; 1 = daño de una porción de la semilla en contacto con el micelio; 2 = tegumento de la semilla invadido por micelio y esclerocios, pero la plántula aparenta estar sana; 3 = tegumento de la semilla libre del hongo, pero la plántula infectada; 4 = Tegumento de la semilla y plántula infectadas; 5 = Semilla infectada y no germinada - en este estudio de trece aislamientos, seis presentaron una severa incidencia de patógenos.

Los aislamientos de Fusarium spp., obtenidos en los muestreos efectuados en el departamento del Valle del Cauca mostraron la mayor ocurrencia, siendo más incidentes A12 (SETM1M4), A1 (GUM1R2), A13 (SETMF1M6), A4 (GUM5R2), A5 (GUM6R1) y A7 (BTa1). el grado de incidencia sobre estos tres últimos fue similar (P > 0.05). Por su parte B. subtilis fue identificada como Cepa C-4. (Figura 1).

Cinética de crecimiento y extracción de metabolitos de X. bovienii

El cultivo puro de X. bovienii obtenido en biorreactor presentó un crecimiento diferente durante las 96 h de evaluación. En la curva de crecimiento la mayor pendiente ocurrió entre 16 y 20 h seguido por una fase de crecimiento con pendiente constante hasta 32 h, a partir de este punto y hasta 72 h sucedió una atenuación de crecimiento para estabilizarse hasta 96 h. Después del secado en rotavapor al final de 36 h se obtuvo 1 ml de un líquido de consistencia aceitosa y color ámbar, el cual aumentó hasta un promedio máximo de 1.5 ml, para lograr finalmente un concentrado máximo de 500 µl.

Actividad antimicrobiana de los metabolitos secundarios sobre Bacillus subtillis.

El método de extracción del metabolito, las concentraciones evaluadas y el tiempo de exposición, así como la interacción de estos últimos mostraron diferencias (P < 0.05) (Cuadro 1)

Con excepción de las proteínas (Vela, 2009), los metabolitos extraídos por las cinco metodologías utilizadas disminuyeron significativamente el crecimiento de esta bacteria (Cuadro 2). La mayor inhibición ocurrió cuando el metabolito se utilizó puro sin dilución (100%) y la mayor antibiosis sobre B. subtillis se presentó cuando los metabolitos de X. bovienii se extrajeron entre 8 y 12h.

Sobre Fusarium spp.

El método de extracción y la concentración de los metabolitos de X. bovienii así como el tiempo de exposición mostraron diferencias (P < 0.05) en los halos de inhibición (Cuadro 3). Al igual que en B. subtilis, los halos de inhibición de los aislamientos mostraron mayor efecto cuando se aplicó la concentración 100% y extracciones entre 0 y 40 h.

Esporulación y formación de estructuras de aislamientos de Fusarium spp.

Se encontraron diferencias (P < 0.05) entre aislamientos y medios de cultivo (CLA y SNA) para la expresión de macro y microconidias, no así para clamidosporas, en las cuales sólo se detectaron cambios entre medios de cultivo. El tiempo de incubación durante el cual se extrajeron los metabolitos secundarios afectó significativamente estas tres estructuras.

Para las clamidosporas, el medio de cultivo más favorable fue CLA, ya que carece de fuentes de carbohidratos, lo que estimula la formación de estructuras de resistencia durante las primeras 20 h. Para las macro y microconidias, las interacciones no presentaron diferencias (P > 0.05) lo que indica que la presencia y expresión de estas estructuras sólo fueron dependientes del medio de cultivo y del tiempo de extracción del metabolito (Cuadro 4 y Cuadro 5).

Fitotoxicidad de los metabolitos

Los metabolitos aplicados en concentraciones entre 25% y 100% no afectaron el desarrollo del cultivo de tomate variedad Santa Elena. Según Xu (1998) en el ciclo de vida de X. bovienii en simbiosis con el nematodo S. feltiae, una vez la bacteria es liberada por el nematodo, su población se multiplica rápidamente y produce varios metabolitos que superan el sistema inmunológico del insecto que les sirve como hospedero, ocasionándole la muerte por septicemia dentro de las 24 a 48 h siguientes. La respuesta inhibitoria a los metabolitos extraídos de X. bovienii en todas las metodologías probadas sobre B. subtillis y los aislamientos de Fusarium spp. (con excepción de proteínas) fue alta especialmente en las primeras horas de incubación (4, 8, 12, 16, 20 h).

Xenorhabdus bovienii digiere rápidamente el insecto hospedero y lo hace disponible para ser utilizado como alimento del nematodo S. feltiae, además, produce metabolitos secundarios que evitan la infección y proliferación de organismos oportunistas (hongos, bacterias e inclusive otros nematodos) en el cadáver de la larva parasitada. No obstante, la presencia de estos compuestos antimicrobianos depende de las horas de muestreo y de los métodos de extracción, identificando algunos metabolitos como xenorhabdinas, nematophinas y xenocumacinas, entre otros (Xu, 1998).

Los resultados en este estudio muestran potencialidades de biocontrol de Fusarium spp., por parte de X. bovienii considerando, posiblemente, no sólo metabolitos aislados sino el medio de cultivo en su conjunto (compuestos integrantes del medio ricos en nutrientes, metabolitos secretados por la bacteria e inclusive, las poblaciones de X. bovienii).

• Con una probabilidad de 95% se puede asegurar que B. subtillis es altamente sensible a la actividad antibiótica de X. bovienii y fue válido utilizar esta bacteria como microorganismo indicador.
• Se observó la efectividad de los metabolitos secundarios obtenidos sobre el hongo Fusarium spp., afectando sus estructuras de resistencia.
• No obstante este hongo se sigue presentando como un limitante en diversos cultivos incluyendo tomate. Se requiere, por tanto, desarrollar nuevas alternativas de control biológico con otros organismos que puedan sustituir o complementar los controladores de síntesis química, tal como la planteada en este trabajo.
• Los metabolitos secundarios de la bacteria X. bovienii no presentaron actividad fitotóxica en semillas ni en plántulas de tomate variedad Santa Clara.
• Independiente del método de extracción, la mayor antibiosis sobre B. subtillis se presentó cuando los metabolitos de X. bovienii se extrajeron entre 8 y 12 h, tiempo en el cual ocurre la fase I de crecimiento de la bacteria y se expresa la mayor cantidad de metabolitos secundarios con propiedades antibióticas.

A Colciencias por la financiación del Macroproyecto Escalado y Formulación Industrial de Steinernemafeltiae (Cephalobina: Steinernematidae) Cepa Colombiana y su Bacteria Simbionte Xenorhabdus bovienii (Enterobacteriaceae) para el Control de Insectos y Fitopatógenos, que dio origen y apoyo parcial a esta investigación. A la Dirección de Investigaciones - UN Palmira (DIPAL), a los empleados del Laboratorio de Microbiología (Facultad de Ciencias Agropecuarias- Palmira), Biología (Facultad de Ciencias -Bogotá) y Malherbología (Facultad de Agronomía-Bogotá), por el apoyo en infraestructura, conocimiento y calidad humana. A Rosa Cristina Martínez por su colaboración en la revisión y estructuración del documento.

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