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Acta Agronómica

Print version ISSN 0120-2812

Acta Agron. vol.64 no.2 Palmira Apr./June 2015

http://dx.doi.org/10.15446/acag.v64n2.42964 


doi: http://dx.doi.org/10.15446/acag.v64n2.42964 e-ISSN 2323-0118


Actividad inhibitoria del aceite esencial de Lippia origanoides H.B.K sobre el crecimiento de Phytophthora infestans

Antifungal activity of essential oil of Lippia origanoides H.B.K on the growth of Phytophthora infestans

Óscar Arango Bedoya*, Andrés Mauricio Hurtado Benavides, Diana Pantoja Daza y Lorena Santacruz Chazatar

Grupo de Investigación Tecnologías Emergentes en Agroindustria (TEA), Facultad de Ingeniería Agroindustrial, Universidad de Nariño. Ciudad Universitaria Torobajo, San Juan de Pasto, Nariño, Colombia. Autor para correspondencia: oscar769@hotmail.com

Rec.: 07.04.2014 Acep.: 09.29.2014

Resumen

Phytophthora infestans (Mont.) de Bary es el fitopatógeno más perjudicial de la papa (Solanum tuberosum) al causar la enfermedad conocida como ‘gota o tizón tardío’. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad in vitro del aceite esencial obtenido de una especie de orégano silvestre (Lippia origanoides H.B.K.) sobre Phytophthora infestans. Para el efecto se evaluaron diferentes concentraciones de este aceite esencial (10, 50, 100, 150, 200, 250 µg/ml) y de un fungicida comercial usado como testigo. La actividad antifúngica se determinó con base en la evaluación del crecimiento del micelio mediante el método de dilución en agar tomate. A partir de una concentración de aceite de 150 µg/ml se inhibió completamente el crecimiento del patógeno, por lo que ésta fue considerada como la concentración letal. Este estudio demostró que el aceite esencial de orégano silvestre del Alto Patía, Colombia, es un potencial agente antifúngico que podría ser usado en sistemas de control integrado de P. infestans.

Palabras clave:Aceite esencial, orégano, Lippia origanoides, actividad antifúngica, Phytophthora infestans.

Abstract

Phytophthora infestans is the most damaging agent for potato crops in the humid areas of the world, causing the disease known as ‘drop or late blight’. In vitro activity of an essential oil obtained from a wild oregano specie (Lippia origanoides) was investigated. Different concentrations of the essential oil (10, 50, 100, 150, 200, 250 µg/mL) and a commercial fungicide used as control were evaluated. The antifungal activity was determined based on the assessment of mycelial growth by the agar tomato dilution method. From a concentration of 150 µg/mL the patogen’s growth was completely inhibited, therefore it was considered the lethal concentration. This study showed that essential oil of wild oregano from Alto Patía region, Cauca Department, Colombia, could be a potential antifungal agent to use in P. infestans integrated control systems.

Key words: Essential oil, oregano, Lippia origanoides, antifungical activity, Phytophthora infestans.

Introducción

La reducción en el uso de fungicidas sintéticos en la agricultura es cada vez mayor, mientras que el uso de productos naturales es considerado como una alternativa interesante debido a sus bajos impactos negativos en el medio ambiente. Phytophthora infestants (Mont.) de Bary es el patógeno que causa el tizón tardío o gota de la papa, una enfermedad que ocasiona enormes pérdidas en las cosechas de este tubérculo, siendo los costos anuales de control y daño en Europa superiores a 1 billón de euros (Erwin y Ribeiro, 1996; Haverkort et al., 2008). En Colombia, P. infestants es reconocido como el limitante de mayor incidencia en el cultivo de la papa debido, principalmente, a las condiciones climáticas favorables para su desarrollo y a la siembra de materiales altamente susceptibles (Lagos, 2002).

El tizón tardío es controlado mediante aplicaciones periódicas de pesticidas químicos, lo cual no sólo es altamente costoso sino además muy perjudicial para el ambiente, debido a la presencia de residuos del producto en el ambiente que causan resistencias en los microorganismos y afectan la salud humana debido a su lenta biodegradación (Murillo et al., 2012; Isman, 2000). La reducción en la eficiencia, el elevado costo y el incremento de los daños colaterales sobre el ambiente de los fungicidas sintéticos, han generado la necesidad de desarrollar métodos de control y protección de los cultivos alternativos al uso de fungicidas y plaguicidas convencionales.

Los metabolitos secundarios de las plantas juegan un importante papel en su resistencia contra las plagas y enfermedades, por lo que las investigaciones sobre las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales permiten descubrir nuevos agentes para el control de fitopatógenos (Kordali et al., 2007; Lee, 2007). Los compuestos químicos presentes en los aceites esenciales frecuentemente son activos contra un limitado número de especies microbianas, son productos biodegradables, no tóxicos y pueden ser utilizados en sistemas de manejo integrado de cultivos, por tanto constituyen una nueva clase de agentes seguros para el control de enfermedades en plantas (Mine et al., 2006). Los pesticidas de origen botánico resultan apropiados para la producción de alimentos orgánicos y juegan un papel importante en la producción y protección poscosecha de productos alimenticios en los países en desarrollo, razón por la cual la investigación científica sobre este tipo de productos es cada vez mayor (Gurjar et al., 2012).

En la zona sur-occidente de Colombia, entre los departamentos de Cauca y Nariño, se encuentra la región del Alto Patía, caracterizada por un clima tropical muy seco, en la que crece de forma silvestre una especie conocida popularmente como ‘orégano de monte’ (Lippia origanoides H.B.K), planta perteneciente a la familia Verbenáceae que alcanza 3 m de altura, posee hojas verdes ovaladas muy aromáticas e inflorescencias en racimo, axilares y blancas. En Colombia esta planta se observa con frecuencia en los departamentos de Guajira, Magdalena, Cundinamarca, Norte de Santander y Santander (García-Barriga, 1992). La especie es nativa de algunos países de Centroamérica (México, Guatemala, Cuba) y Sudamérica (Colombia, Venezuela, Brasil) (Pascual et al., 2001).

No obstante que en varios estudios se ha demostrado la actividad antimicrobiana de L. origanoides (Oliveira et al., 2007; Dos Santos et al., 2004) se conocen pocas investigaciones respecto a su efecto sobre hongos fitopatógenos. Bolivar et al. (2007) investigaron el efecto inhibitorio de extractos etanólicos de L. origanoides sobre el crecimiento micelial de Colletotrichum gloesporioides, encontrando un 100% de inhibición cuando aplicaron 2.5% del extracto en el medio de cultivo. Ospina et al. (2011). Evaluaron in vitro la actividad inhibitoria de aceites esenciales de L. origanoides sobre el desarrollo micelial y la formación de esclerocios de Sclerotium cepivorum, patógeno causante de la pudrición blanca en cebolla, encontrando que los aceites obtenidos a partir del quimiotipo I (timol 45%, g-terpineno 13.5%, p-cimeno 10%) presentaron el mayor poder inhibitorio en el crecimiento del micelio y en la formación de esclerocios. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antifúngica del aceite esencial de orégano de monte (AEO) (L. origanoides) de la región del Alto Patía contra P. infestans, agente causante de la enfermedad conocida como tizón tardío de la papa.

Materiales y métodos

Material vegetal. Para el estudio, se recolectaron en forma manual hojas de L. origanoides en la zona del Alto Patía, municipio de Taminango, en límites entre los departamentos de Nariño y Cauca, al suroccidente de Colombia, las cuales fueron identificadas por su taxonomía en el Herbario de la Universidad de Nariño. La microrregión del estudio se caracteriza por un clima tropical seco, con temperatura promedio de 24ºC, suelos semiáridos, baja precipitación (700 - 900 mm/año) y vegetación típica de un enclave subxerofítico. La recolección de las hojas se realizó en la época inmediatamente posterior al periodo de lluvias, entre julio y agosto del 2011. Las hojas se separaron de los materiales extraños, se pesaron y después se secaron a la sombra a temperatura ambiente (18ºC) durante 8 días, hasta alcanzar una humedad aproximada de 12%, para proceder a su conservación en sacos de polietileno que fueron cuidados en un lugar limpio y libre de humedad hasta su procesamiento.

Extracción del aceite esencial. El proceso de extracción del AEO se realizó en la Planta Piloto de la Facultad de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad de Nariño, utilizando la técnica de arrastre con vapor. Las condiciones de operación del equipo de extracción fueron: tiempo 2 h, densidad de lecho 80 g/lt y presión de vapor de 0.32 psig. El rendimiento de extracción se calculó dividiendo el peso de aceite extraído entre el peso de muestra seca depositada en el equipo de extracción expresado en porcentaje. Análisis de la composición del aceite esencial. Se utilizó un cromatógrafo de gases Shimadzu GC17A versión 3, equipado con un inyector split/splitless a temperatura de 250 °C, relación split 1:100 y un detector de ionización en llama (FID) (280 °C). Para la separación de mezclas se empleó una columna apolar DB-5 (JyW) de 30 m x 0.25 mm D.I. y 0.25 µm de una fase estacionaria de 5% fenil-polietilsiloxano. La temperatura del horno fue programada a 40°C (5 min) hasta 250°C a 5°C/min. El volumen de los extractos inyectado fue de 1.0 µl. Los espectros de masas se obtuvieron en modo SCAN en un intervalo de masas entre 38 y 450 m/z. Para la identificación de los compuestos por medio de índices de Kovats se utilizó como referencia la mezcla de parafinas de C6- C32. Para confirmar la identificación de los metabolitos secundarios del aceite esencial se realizó un análisis por GC-MS en el Laboratorio de Cromatografía de la Universidad Industrial de Santander, utilizando un cromatógrafo de gases Agilent Tecnologies 6890N acoplado a un detector selectivo de masas (MSD) Agilent Tecnologies 5975 Inert, operado en el modo barrido completo (full scan) de radiofrecuencia. La columna empleada en dicho análisis fue DB-WAX (J y W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.). La identificación de los compuestos químicos se basó en sus índices de retención y comparación de sus espectros de masas con aquellos de las librerías de Wiley y Adams.

Obtención del patógeno. Para obtener el patógeno se recolectaron muestras de tejido infectado en un lote experimental de papa, en el cual no se hicieron aplicaciones de productos químicos para el control de la enfermedad. El material fue llevado al Laboratorio de Fitopatología de la Universidad de Nariño, donde se cortó en trozos de 5 x 5 mm, se desinfectó con hipoclorito de sodio al 3% por 2 min y se enjuagó con agua destilada durante 1 min (Zapata et al., 2003).

Este material, consistente en cuatro trozos de hojas, fue sembrado en cajas Petri con medio de cultivo agar-tomate, adicionando una solución de Rifampicina® de 300 mg disuelta en 50 ml de etanol al 96% para evitar el crecimiento de bacterias, luego se incubaron durante 3 días. El patógeno se purificó por transferencia continua a nuevas cajas Petri hasta obtener una colonia pura de P. infestans. La identificación se realizó mediante el uso de claves taxonómicas, según se describe en el trabajo de Jaramillo (2003).

Inoculación en el medio de cultivo. El medio de cultivo esterilizado se sirvió en las cajas Petri enmendado con aceite esencial de orégano o con Ridomil Gold® (Metalaxyl-M 4% + Mancozeb 64%) según el diseño experimental que se describe más adelante. Este fungicida se eligió por ser el producto químico más comúnmente usado por los agricultores para el control del patógeno. Cuando el medio solidificó se inoculó con un disco del patógeno de micelio de 1.1 cm de diámetro, el cual se sembró en el centro de cada caja. En el caso de los tratamientos con aceite esencial de orégano se utilizó Tween-20 como agente emulsificante, en una relación 1:1 Tween-20: aceite de orégano.

Diseño experimental. Se empleó un diseño completamente al azar, en arreglo factorial con dos factores: el factor A consistió en los tratamientos con aceite esencial de orégano y un fungicida comercial como control (Ridomil Gold®); el factor B correspondió a las concentraciones (10, 50, 100, 150, 200, 250 µg/ml) de aceite esencial y Ridomil. El intervalo de concentraciones evaluado para el aceite esencial se determinó mediante ensayos previos, excluyendo concentraciones mayores en las cuales no se observó crecimiento del patógeno. Se incluyeron dos testigos, uno absoluto, es decir, únicamente con el medio de cultivo, el cual sirvió como control de posible contaminación durante el proceso de inoculación y otro, aplicando Tween-20 al medio de cultivo, en las mismas concentraciones que los tratamientos con aceite esencial. Por cada ensayo se sembraron porciones de hojas en cinco cajas Petri.

Determinación de la sensibilidad del patógeno. El comportamiento in vitro de los aislamientos fue evaluado en relación con el crecimiento radial de las colonias de P. infestans en los diferentes tratamientos. Cada unidad experimental fue evaluada mediante el programa gráfico Tpsdig2® después de un periodo de incubación de 8 días a temperatura de 18 ºC (García et al., 2008). El porcentaje de crecimiento fue determinado según la relación propuesta por Riveros et al. (2003):

donde, PC = porcentaje de crecimiento, DMCM = diámetro medio de la colonia creciendo en tratamiento; 1.1 cm = diámetro del cilindro con micelio, DMCA = diámetro medio de la colonia inoculada en el control con Tween-20. Finalmente se determinó la sensibilidad de los aislamientos evaluados mediante la escala propuesta por Shattock (1988) que se presenta en el Cuadro 1.

Resultados y discusión

Composición del aceite esencial

Con la técnica de arrastre por vapor se encontró un rendimiento de extracción de aceite esencial de orégano de 3.27% (g/g -aceite esencial/materia seca) el cual se puede considerar alto, si se compara con el de otras especies comerciales como menta (1.1 - 2.2%), limoncillo (0.02 - 0.19%), albahaca (1.3 – 2.1%) y manzanilla (0.03–0.3%) (Cannon et al., 2013; Gawde et al., 2014). Los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial utilizado en este estudio fueron en su orden: timol (73.7%), r-cimeno (10.5%), mirceno (3.1%) y g-terpineno (2.9%). En trabajos previos los autores del presente estudio encontraron que la composición del aceite esencial de L. origanoides puede ser afectada por el método de extracción (Arango et al., 2012a) y por factores ambientales (Arango et al., 2012b). Según los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial, se han encontrado diferentes quimiotipos de L. origanoides en Colombia, Brasil y Venezuela. Por lo menos se han diferenciado tres quimiotipos, dos de ellos cuyos principales componentes son carvacrol y timol y un tercero, menos común, caracterizado por la ausencia o muy bajo contenido de estos compuestos (Stashenko et al., 2010). Estas diferencias químicas pueden estar relacionadas con las características de los suelos, las condiciones climáticas y con variaciones genéticas intraespecíficas.

De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, el aceite esencial del orégano silvestre del Alto Patía corresponde a un quimiotipo muy rico en timol, lo que resalta el gran potencial de aprovechamiento industrial que podría tener esta especie, ya que este compuesto fenólico ha sido tema de numerosos estudios por su actividad antioxidante (Ramos et al., 2014; Quiroga et al., 2014; Arango et al., 2012c; Wojdylo et al., 2007) y antimicrobiana (Ramos et al., 2012; Guarda et al., 2011; Michiels et al., 2007; Falcone et al., 2007; Bagamboula et al., 2004).

Evaluación de la capacidad antifúngica del aceite de orégano

En la Foto 1 se observa que el Tween-20 no presentó efecto como inhibidor del crecimiento del patógeno, por el contrario, el Ridomil® inhibió completamente el crecimiento del patógeno a partir de la mínima concentración (10 µg/ml). Con el aceite de orégano la acción antifúngica fue evidente ya que se redujeron los porcentajes de crecimiento micelial del patógeno con el aumento de las concentraciones evaluadas. (Cuadro 2).

Como se observa en el Cuadro 2 el aceite esencial de orégano inhibió el patógeno P. infestans in vitro, causando una reducción media de crecimiento de 52.5% con una dosis de 50 µg/ml y una clasificación ‘intermedio’ en la escala de sensibilidad, con un crecimiento entre 10 y 60% con respecto al testigo absoluto. Cuando el medio de cultivo fue enmendado con una concentración igual o superior que 150 µg/ml de AEO se inhibió completamente el crecimiento micelial del patógeno, por tanto el inóculo se llevó a cajas Petri con medio sin aceite esencial de orégano y se incubó durante otros 16 días, con el fin de evaluar si en estas concentraciones el aceite presenta efecto fungicida o fungistático. Después de este tiempo no se observó crecimiento, por tanto se deduce que en dichas concentraciones el aceite de orégano tiene actividad fungicida.

El valor CE50, es decir, la concentración de AEO que permite una inhibición en el crecimiento del patógeno de 50%, fue 20.53 µg/ml; mientras que el valor CE50 encontrado para el fungicida comercial Ridomil® fue 4.73 µg/ml, siendo similar al valor citado en la literatura para este producto (García et al., 2008). Como era de esperar, el CE50 para Ridomil® fue inferior al del AEO, debido a que éste es un fungicida de síntesis química que bloquea la transcripción del RNA, no obstante, la utilización prolongada, y en ocasiones exagerada de este tipo de productos puede ocasionar, no solo el desarrollo de cepas resistentes (Pomerantz et al., 2014) sino además afectar el suelo y los ecosistemas (Smalling et al., 2013), en consecuencia, el uso de sustancias de origen natural, como el AEO, es una alternativa posible para el control de fitopatógenos.

En el Cuadro 3 se presenta el análisis de varianza para los resultados entre los tratamientos vs. porcentajes de crecimiento del patógeno. Se observan diferencias (P < 0.05) entre los productos, lo que fue comprobado mediante la prueba de rangos múltiples de Tukey. En las cajas Petri enmendadas con AEO, el patógeno P. infestans tuvo un crecimiento promedio de 35.95% respecto al crecimiento del testigo absoluto; en las cajas con Ridomil el crecimiento medio fue de 14.28% y en las cajas con Tween-20 fue 87.37%, lo que indica que este último no presentó inhibición sobre la P. infestans y que la inhibición observada en los ensayos con AEO se debe únicamente a la acción de sus componentes.

En varios estudios se ha demostrado la actividad antimicrobiana de especies del género Lippia, que se caracterizan por ser ricas en compuestos fenólicos como timol y carvacrol, entre ellas L. graveolens (Salgueiro et al., 2003) y L. origanoides (Dos Santos et al., 2004). En el presente estudio, el efecto inhibidor que presenta el aceite esencial de orégano silvestre del Alto Patía sobre P. infestans se puede atribuir principalmente a su alto contenido de timol (73%), ya que este compuesto tiene una comprobada acción antifúngica (Braga et al., 2007). Krolow et al. (2006) evaluaron la actividad antifúngica de aceite esencial de Origanum vulgare contra el patógeno P. infestans y encontraron que a una concentración de 100 µg/ml se redujo el crecimiento en 59.84%, valor similar al encontrado en el presente estudio. En México (Gamboa et al., 2002) evaluaron el efecto de extractos metanólicos de O. mejorana sobre el crecimiento micelial de P. infestans, encontrando un efecto inhibidor de 100% con dosis de 8000 ppm, siendo muy superior a las del AEO del presente estudio, lo que puede ser debido a que en los extractos acuosos o metanólicos los componentes activos están muy diluidos y suelen ser diferentes a los de los aceites esenciales.

Los mecanismos de la actividad antifúngica de los monoterpenos, como timol y carvacrol, aún no han sido completamente explicados; no obstante Marei et al. (2012) consideran que, como agentes lipolíticos, estos ejercen una acción sobre la membrana y las enzimas presentes en ella. Estos investigadores encontraron que el timol es un potencial inhibidor de la pectin metil esterasa, enzima que modifica el grado de metil-esterificación de las pectinas, que son los principales componentes de las paredes celulares de los hongos, lo que conlleva cambios en la adhesión celular, la plasticidad, el pH y el contenido ionico de esta pared celular, e influye en la permeabilidad e integridad de la membrana. Numpaque et al. (2011) consideran que el carvacrol (isómero del timol) puede actuar como intercambiador de protones, al reducir el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática, lo que ocasiona un colapso en la fuerza motriz de protones y la muerte celular. Si bien los resultados de la actividad in vitro del AEO sobre P. infestans resultan prometedores, es necesario realizar estudios que permitan evaluar su comportamiento y efectividad en campo, además de otros aspectos como su residualidad, fitotoxicidad e interacción con el medioambiente.

Conclusiones

  • En condiciones in vitro el aceite esencial de orégano de monte (Lippia origanoides) de la región del Alto Patía, Colombia, presenta un efecto fungicida sobre el fitopatógeno Phytophthora infestans.
  • La concentración de aceite de orégano que permitió una inhibición en el crecimiento del patógeno de 50% (CE50) fue de 20.53 µg/ml. Por tanto, este aceite esencial podría ser incorporado dentro de un programa de manejo integral de la enfermedad del tizón tardío de la papa, con el fin de reducir la aplicación de productos químicos.

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de Nariño, por el financiamiento de esta investigación.

Referencias

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