Introducción

Moringa oleífera es un árbol multipropósito perteneciente a la familia Moringaceae, originario de India y cultivado en diferentes lugares como Pakistán, México, Perú y Paraguay (^{Ribaudo, Povolo y Zagotto, 2019}). Al ser una especie multipropósito con variedad de compuestos fitoquímicos, todas sus partes son utilizadas en diferentes campos como la medicina, la nutrición, la farmacología, la alimentación animal; igualmente, es usado como fuente de biodiesel, agente purificante de agua, fertilizante, y promotor de crecimiento.(^{Braham etal., 2019}; ^{Nouman et al., 2016}).

Por otro lado, el estrés oxidativo es una de las principales causas de la presencia de enfermedades como el cáncer; frente a esto los antioxidantes de origen vegetal pueden mitigar la liberación de radicales libres asociados con esta condición. La capacidad antioxidante de M. oleífera se atribuye, principalmente, al contenido de fenoles que, además, contribuyen a la reducción de la peroxidación de lípidos y del daño en las células, ya que son capaces de neutralizar los radicales libres debido a su estructura química, la cual se caracteriza por tener grupos hidroxilo (^{Lin, Zhang y Chen, 2018})including flavonoids, which are secondary plant metabolites with health-promoting effects, such as prevention of damage to normal cell DNA and promotion of cancer cell apoptosis, thereby reducing the burden of non- communicable diseases (NCDs.

Las hojas de M. oleífera son la estructura con mayor contenido de componentes fitoquímicos (fenoles y flavonoides) y potencial antioxidante, además de nutrientes como vitaminas, minerales y ácidos grasos. Entre los compuestos fenólicos presentes en esta planta se encuentran el ácido gálico, kaempferol, quercetina y astragalina (^{Prabakaran, Kim, Sasireka, Chandrasekaran y Chung, 2018}). Estos compuestos fitoquímicos también le confieren a M. oleífera actividad antiinflamatoria, antifúngica y antimicrobiana (^{Karageorgou, Grigorakis, Lalas y Makris, 2017})Springer-Verlag Berlin Heidelberg. In this study, the extraction of polyphenols from Moringa oleifera leaves was investigated, using a biomolecule-based low-transition temperature mixture (LTTM.

Un aspecto importante que se debe tener en cuenta es que el contenido de compuestos fitoquímicos en la planta depende de factores climáticos, genéticos y agronómicos (^{Nouman et al., 2016}; ^{Rodríguez Pérez et al., 2015})antioxidant activity and contents of selected nutrients in the leaves from seven cultivars of Moringa oleifera (‘Tumu’, ‘Sunyaw’, ‘Kumasi’, ‘Techiman’, ‘China’, ‘Pakistan Black’, and ‘Pakistan White’. Por lo que es necesario evaluar los componentes bioactivos de M. oleifera en las diferentes regiones donde se cultiva. En Colombia no se reportan análisis sobre el extracto de hojas de M. oleifera, por lo que se requiere evaluar el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante del extracto de las hojas en tres estados fenológicos para su posterior uso como antioxidante en procesos de biotecnologías reproductivas.

Materiales y métodos

Análisis preliminar de compuestos fitoquímicos, determinación colorimétrica de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante

La estimación de la presencia de compuestos fitoquímicos en los extractos se realizó en tubos de ensayo con base en pruebas cualitativas (^{Torres et al., 2013}). Se estimó la presencia de esteroides, terpenoides, saponinas, fenoles totales, flavonoides, taninos condensados, taninos hidrolizables, alcaloides, cumarinas y glúcidos cardiotónicos.

Por otra parte, las metodologías utilizadas en la determinación de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante se adecuaron a la implementación de microplaca de 96 pozos (^{Wu, Li, Chen, Wang y Lin, 2020}). Las lecturas se realizaron por espectrofotometría con un lector de microplacas (Biotek Lx800) y el software Gen 5^TM (versión 3.02.1).

El contenido total de fenoles (CTF) se determinó de acuerdo con la metodología de ^{Oboh, Olubode, Oyetomi y Adewuni (2018)} modificada y empleando el reactivo Folin-Ciocalteu. La mezcla de 60 µL de muestra, 60 µL de reactivo Folin-Ciocalteu y 180 µL de disolución de carbonato de sodio se incubó a 60° C durante 45 min. La absorbancia fue leída a 750 nm y los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra seca (mg EAG/g MS).

El contenido total de flavonoides (CTFl) se evaluó con base en la metodología de ^{Braham et al. (2019)}. Se utilizaron 100 µL de muestra y 100 µL de solución de tricloruro de aluminio. La absorbancia fue leída a 405 nm y los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de rutina por gramo de muestra seca (mg ER/g MS).

El contenido total de catequinas (CTC) se determinó de acuerdo con el método de vainillina (^{Cádiz-Gurrea, Fernández-Arroyo y Segura-Carretero, 2014})vegetables, spices, grains and herbs. For this reason, there has been increasing interest in identifying plant extract compounds. Polymeric tannins and monomeric flavonoids, such as catechin and epicatechin, in pine bark and green tea extracts could be responsible for the higher antioxidant activities of these extracts. The aim of the present study was to characterize the phenolic compounds in pine bark and green tea concentrated extracts using high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry (HPLC- ESI-QTOF-MS. Se utilizaron 100 µL de muestra, mezclada con 100 µL de vainillina y 100 µL de ácido sulfúrico. La mezcla se incubó a 30° C por 10 min y la lectura se realizó a 515 nm. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de hidrato de catequina por gramo de muestra seca (mg EHC/g MS).

Por otro lado, la determinación de la capacidad antioxidante (CA) se realizó utilizando tres métodos:

Método radical libre DPPH (1.1-difenil-2-picril hidracilo)

Este método se realizó según ^{Vázquez-León et al. (2017)} con algunas modificaciones. Se utilizaron 60 µL de muestra, se le adicionaron 140 µL de dilución de DPPH a una concentración de 100 ppm, se incubó durante 30 min en la oscuridad y se leyó a 515 nm. El resultado se expresó como micromoles equivalentes de trolox por gramo de muestra seca (µmol ET/g MS) y como porcentaje de eliminación de radicales libres (% ERL) DPPH (ecuación 1).

Ecuación 1. Porcentaje de eliminación de radicales libres DPPH

(Ec.1)

Dónde: Ab= absorbancia de DPPH control, Am= absorbancia de DPPH con muestra.

Método potencial antioxidante reductor férrico (FRAP)

Este método se realizó con modificaciones al propuesto por ^{Braham et al. (2019)}. Se utilizaron 60 µL de muestra, se agregaron 180 µL de agua destilada y 60 µL de reactivo FRAP, la mezcla se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad por 30 min y se realizó la lectura a 630 nm. Los resultados se expresaron como micromoles de ion ferroso por gramo de muestra seca (µmolFe²⁺/g MS).

Método ABTS (ácido 2, 2-azinobis, 3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)

Para esta determinación se utilizó la metodología modificada a la reportada por ^{Farooq y Koul (2019)}. Se utilizaron 60 µL de muestra y 240 µL de solución ABTS. La lectura se realizó a 750 nm y los resultados se expresaron en µmol ET/g MS y como porcentaje de la capacidad antioxidante (CA) (ecuación 2).

Ecuación 2. Cálculo del porcentaje de la capacidad antioxidante

(Ec.2)

Dónde: Ab= absorbancia del catión radical ABTS control, Am= absorbancia del catión radical ABTS con muestra.

Resultados

Análisis preliminar de compuestos fitoquímicos

En el estudio preliminar de compuestos fitoquímicos se encontró que las hojas de M. oleífera, en los tres estados fenológicos, contenían terpenoides, esteroles, fenoles, flavonoides, cumarinas y glúcidos cardiotónicos (Tabla 1).

Tabla 1 Análisis preliminar de compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de hojas de Moringa oleífera en tres estados fenológicos 

Determinación colorimétrica de compuestos fenólicos

Los resultados para la determinación colorimétrica de compuestos fenólicos no mostraron diferencia estadística para el contenido de fenoles totales, ni el contenido total de catequinas (Tabla 2). En contraste, el contenido de flavonoides totales presentó diferencia significativa, ya que la hoja joven y la madura fueron las de mayores contenidos.

Tabla 2 Determinación colorimétrica de CTF, CTFl, CTC presentes en los extractos de hojas de Moringa oleífera 

J: Hoja joven, M: Hoja madura, A: Hoja adulta. Los resultados están expresados como media ± DE. Diferente letra indica diferencia significativa entre las muestras.

Determinación de la capacidad antioxidante (CA)

La CA de M. oleífera presentó diferencia significativa (p<0.05) para los ensayos FRAP y ABTS, en los que se obtuvieron valores más altos para las hojas jóvenes y maduras (Tabla 3).

Tabla 3 Capacidad antioxidante (DPPH, FRAP, ABTS) del extracto de Moringa oleífera en tres estados fenológicos 

J: Hoja joven, M: Hoja madura, A: Hoja adulta, %: porcentaje de eliminación de radicales. Los resultados están expresados como media ± DE. Diferente letra indica diferencia significativa entre las muestras.

Discusión

Los compuestos fenólicos derivados de plantas son metabolitos secundarios sintetizados a partir del aminoácido fenilalanina o tirosina. Algunos de estos compuestos son los flavonoides, taninos, cumarinas, quinonas y antocianinas. Estos compuestos tienen diversas estructuras, algunas simples, donde hay presencia de solo un anillo aromático y en otros se presentan formas poliméricas complejas (^{Mbemya, Vieira, Canafistula, Pessoa y Rodrigues, 2017}). Estas moléculas mitigan la formación de radicales libres e inhiben los daños que estos generan, por ejemplo, la peroxidación lipídica y la oxidación de proteínas al donar electrones o átomos de hidrógeno e interrumpir la propagación de los radicales (^{Lin et al., 2018})including flavonoids, which are secondary plant metabolites with health-promoting effects, such as prevention of damage to normal cell DNA and promotion of cancer cell apoptosis, thereby reducing the burden of non-communicable diseases (NCDs.

El tipo y cantidad de metabolitos presentes en las plantas es altamente variable y depende en gran medida de las condiciones ambientales donde se desarrolle el cultivo. Estas condiciones comprenden clima, tipo de suelo y manejo del cultivo, entre otras (^{Vats y Gupta, 2017}). Además, las concentraciones de los compuestos también dependen de la edad de la planta y los métodos de extracción, conservación y análisis (^{Akorede et al., 2020})given distilled water (2 ml/kg.

El presente estudio preliminar de compuestos fitoquímicos arrojó la presencia de fenoles, flavonoides y otras estructuras como terpenoides, esteroles y cumarinas. Este resultado concuerda con otras investigaciones realizadas en la misma especie y en especies del mismo género en otros países, las cuales además reportan la presencia de otros compuestos como saponinas y alcaloides (^{Oladeji, Odelade y Oloke, 2019}; ^{Al-Owaisi, Al-Hadiwi y Khan, 2014}).

Una vez se corroboró la presencia de compuestos fenólicos en el extracto de M. oleífera se procedió a realizar las evaluaciones complementarias con el objetivo de conocer las concentraciones totales de fenoles, flavonoides, catequinas y la capacidad antioxidante. En este estudio se encontró que entre la hoja joven y madura no hubo diferencias significativas en ninguno de los parámetros evaluados. En contraste, la hoja adulta presentó concentraciones significativamente menores de flavonoides totales y catequinas totales, además mostró una CA menor en los métodos FRAP y ABTS. Estos resultados concuerdan parcialmente con los estudios realizados por ^{Sreelatha y Padma (2009)}, quienes evaluaron la capacidad antioxidante y el contenido total de fenoles de las hojas de M. oleífera y obtuvieron mayor contenido de fenoles totales en la hoja madura (45.81±0.02 mg EAG/g MS). Sin embargo, en este estudio sí se obtuvieron diferencias significativas con respecto a la hoja joven.

En un estudio realizado en Ecuador, se evaluó la variabilidad del contenido de flavonoides y fenoles del extracto de hojas de M. oleífera de acuerdo con la edad y altura de las hojas, encontrando concentraciones menores en las hojas con mayor edad (flavonoides: 13.99; fenoles: 9.10 mg/g, respectivamente) (^{Cabrera et al., 2017}). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el presente estudio. De igual forma, en aquel estudio se reportó el mismo comportamiento de las hojas más jóvenes e intermedias, las cuales no fueron diferentes significativamente y arrojaron concentraciones promedio de fenoles de 13.3 mg EAG/g MS (^{Cabrera et al., 2017}). Por otro lado, se reportan valores para flavonoides de 2.3±0.09 mg ER/g MS (^{Vats y Gupta, 2017}), valores menores a los encontrados en este estudio, cuyo valor más bajo fue 4.83±0.33 mg ER/g MS. Para contenido total de catequinas no se encontraron estudios comparativos en la especie.

Con respecto a la CA, M. oleífera presentó mejores resultados con los extractos de hoja joven y madura, los cuales tuvieron diferencia significativa en los ensayos FRAP y ABTS. El método FRAP consiste en la reacción redox que ocurre entre la sustancia antioxidante y los iones Fe³+ a través de la trasferencia de electrones en los que el ion se reduce a Fe²+ y se determina de acuerdo con el cambio de color (^{Martins et al., 2013}). Mientras que el método ABTS determina la actividad de reducción de los radicales ABTS a través de la transferencia de electrones o átomos de hidrógeno y se determina por decoloración (^{Mwamatope, Tembo, Chikowe, Kampira y Nyirenda, 2020}). Es decir, que los compuestos del extracto de M. oleífera pueden actuar como mecanismos de transferencia de electrones (SET) y átomos de hidrogeno (HAT), además, pueden tener mayor afinidad por los iones hierro y radicales estructuralmente similares al catión ABTS (^{Wang et al., 2020}; ^{Sreelatha y Padma, 2009}). Así mismo, se reportan resultados para DPPH de 530 µmol ET/g MS (^{Braham et al., 2019}), para FRAP 643 µmol FeSO4/g MS y para ABTS 330 µmol ET/g MS, valores mayores a los encontrados por ^{Rizi (2016)}.

De acuerdo con los resultados obtenidos, de los tres estados fenológicos evaluados, la hoja joven y madura de M. oleífera poseen mayores contenidos de compuestos que le brindan una capacidad antioxidante cercana al 90 %, por lo que podrían brindar estabilidad redox a las células y ofrecer beneficios en las nuevas biotecnologías reproductivas, por ejemplo, en la mitigación de especies reactivas de oxígeno (EROs) cuando se utiliza el extracto como suplemento en los medios de cultivo en la producción ín vítro de embriones.

Conclusión

Las hojas de M. oleífera son estructuras que presentan alto contenido de compuestos con potencial antioxidante, sin embargo, este contenido puede verse afectado por las condiciones agronómicas, las zonas de cultivo y las técnicas de extracción. Según los resultados obtenidos en este estudio, entre la hoja joven y madura no existen diferencias significativas y además presentan los contenidos más altos de flavonoides y de capacidad antioxidante en los métodos FRAP y ABTS, por lo que el extracto obtenido de las hojas en estas etapas podría presentar un mayor potencial como antioxidante para uso como suplemento en los medios utilizados en la producción ín vítro de embriones.