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Introducción
La FAO estima que en los próximos 40 años la población mundial superará los 9 billones de personas, lo que supondrá posiblemente un incremento del 60 % en la demanda de alimentos (Mouël y Forslund, 2017). La agricultura moderna depende del P (Cordell et al., 2009), un elemento que no se encuentra en estado libre en la naturaleza, que es muy reactivo, y que se combina rápidamente con otros elementos como hidrógeno (H) y oxígeno (O). El P es un nutriente que se obtiene a partir de la roca fosfórica, un recurso no renovable cuyas reservas mundiales pueden agotarse en los próximos 50 a 100 años, y no es sustituible (Cordell et al., 2009). A nivel mundial muchos suelos son deficientes en formas solubles de fósforo inorgánico (Pi) (Yang y Finnegan, 2010). Por todo ello, se hace necesario para la agricultura, además de utilizar tecnologías que permitan una mejora de la conservación del P en el suelo, encontrar fuentes de P alternativas. Por ello, en los últimos 20 años se ha estado utilizando una forma reducida de Pi, conocida como Phi, para mejorar las propiedades agronómicas de muchos cultivos (Achary et al., 2017).
Cuando el P se encuentra en su máximo estado de oxidación, la molécula que se forma se denomina fosfato (; Pi), y cuando no lo está, la molécula se denomina fosfito (; Phi), fosfonato o ácido fosforoso (Thao y Yamakawa, 2009). Aunque el uso del Phi en la agricultura puede tener potenciales ventajas en cuanto a fertilización, agotamiento de recursos minerales, contaminación, eutrofización, bioestimulación, control de patógenos como Phytophthora spp. y Pythium spp. (Orbović et al., 2008; Ramallo et al., 2019) y/o el control de malas hierbas (Achary et al., 2017), los ensayos de fertilización con Phi en ocasiones presentan resultados que pueden parecer contradictorios, ya que pueden variar dependiendo del cultivo (especie vegetal), de la técnica de cultivo (hidropónico o en suelo), del modo de aplicación (foliar o radicular), del estado nutricional de planta (deficientes o suficientes en P), del posible efecto combinado (fertilizante y fungicida) o de la relación Pi/Phi suministrada a la planta. Moor et al. (2009) encontraron que cuando se emplea Phi en la fertilización de fresas no se produce una disminución del crecimiento, pero tampoco se produce un aumento del rendimiento con respecto a la fertilización tradicional con Pi. Araujo et al. (2016) señalan que, en frijol común, en condiciones de deficiencia de P, el Phi suministrado con la solución nutritiva ocasiona una disminución de la acumulación de P. Por otra parte, López-Arredondo y Herrera- Estrella (2012) encuentran que plantas transgénicas capaces de expresar el ptxD de Pseudomonas stutzeri precisan entre un 30 y un 50 % menos de P cuando son fertilizadas con Phi que cuando son fertilizadas con Pi. Todo ello ha motivado la realización de este ensayo, donde se ha estudiado el efecto que la presencia (1 mmol L-1) o ausencia de Phi (0 mmol L-1) tiene sobre el crecimiento y la concentración foliar de macro y micronutrientes de plantas de tomate cultivadas con diferentes niveles de Pi (0.05, 1.00 y 2 mmol L-1). De tal manera, el estudio fue realizado en hidroponía, con solución nutritiva recirculante, con iluminación artificial y en condiciones de laboratorio.
Materiales y métodos
Cultivo
El ensayo se realizó en España, en la Escuela Politécnica Superior de Ingeniería (Sección de Ingeniería Agraria) de la ULL (28º28’44’’N, 16º19’07’’O) en San Cristóbal de La Laguna (544 m s. n. m.). Durante el tiempo que duró la experiencia la temperatura se mantuvo entre 22 y 25º C y la humedad relativa entre el 60 y el 65 %. Se cultivaron plántulas de tomate (Solanum lycopersicum L. var. Marmande) en un sistema hidropónico con solución nutritiva recirculante, suministrada a los correspondientes recipientes de cultivo a intervalos de 30 min (de 06.00 h a 24.00 h) y 60 min (de 0.00 h a 06.00 h) por subirrigación. Los recipientes utilizados fueron macetas plásticas (PE) de 1000 mL de capacidad, que se llenaron con arena de sílice de entre 1 y 2 mm Ø, lavada previamente con agua corriente, desinfectada con hipoclorito de sodio (NaClO al 5 %) durante 60 min y aclarada finalmente con agua desionizada (CE25ºC < 4 µS cm1). El sistema de iluminación estaba formado por tubos Grolux Sylvania T8 (36W, 120 cm, Ø 26 mm) suspendidos a una distancia de 20 cm sobre el cultivo, y se fueron elevando a medida que las plantas crecieron; además proporcionaron una radiación PAR alrededor de 200 µmol de fotones cm-² s-1. El fotoperiodo aplicado fue de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (16/8). La solución nutritiva aportada a cada tratamiento fue esencialmente la indicada por Hoagland y Arnon (1950), con modificaciones puntuales de las concentraciones de K y S dependiendo de los niveles de Pi (0.05, 1.00 y 2.00 mmol L1) y Phi (0.00 y 1.00 mmol L-1) establecidos para cada tratamiento (Tabla 1). La concentración de macronutrientes de cada una de ellas varió en función de los tratamientos aplicados (TI, TII, TIII, TIV TV y TVI), y fue, respectivamente de: 5.00, 5.00, 5.00, 5.00, 5.00, 5.00 mmol L-1 de Ca(NO3)2·4H2O; 2.00, 2.00, 2.00, 2.00, 2.00, 2.00 mmol L-1 de MgSO4·7H2O; 0.475, 0.475, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00 mmol L-1 de K2SO4; 5.00, 5.00, 5.00, 5.00, 5.00, 5.00 mmol L-1 de KNO3; 0.05, 0.05, 1.00, 1.00, 2.00, 2.00 mol L1 de KH2PO4; y 0.00, 1.00, 0.00, 1.00, 0.00, 1.00 mmol L1 de H3PO4 (Tabla 2). La concentración de micronutrientes fue igual en todos los casos: 46.253 µmol L-1 de B, 9.102 µmol L-1 de Mn, 0.764 µmol L-1 de Zn, 0.314 µmol L-1 de Cu y 0.104 µmol L-1 de Mo. El Fe se aportó en forma Fe- EDDHA (Sequestrene 138 Fe®, Syngenta) a razón de 3.61 g L-1 de producto comercial (4.525 mmol L-1 de Fe). Salvo en el caso del Fe, las sales utilizadas fueron de calidad analítica (PA) de Panreac® o Merck®. La concentración deseada de Phi de las disoluciones que contenían Phi se consiguió mediante la adición de 1 mL L-1 de disolución concentrada (1 M) de H3PO3 (82 g L-1), neutralizada previamente con KOH. Las disoluciones estaban contenidas en depósitos plásticos (PE) de 5 L de capacidad y fueron renovadas completamente cada 3 o 6 días dependiendo del estado de desarrollo de las plántulas. Antes de ser suministradas al cultivo, el pH se ajustó a 6.4 con KOH 1 M. La siembra se realizó el 3/05/18 colocando 5 semillas de tomate en cada maceta y directamente en la arena, a una profundidad de entre 5 y 10 mm. Durante el periodo de germinación, que duró 8 días, las semillas se regaron con agua desionizada (CE25ºC < 4 µS cm1) y después, una vez que las plántulas tuvieron una o dos hojas verdaderas, con las soluciones nutritivas correspondientes a cada tratamiento. A los 12 días de la siembra se procedió a retirar las plántulas innecesarias dejando una sola por contenedor, procurando que el cultivo presentara la mayor uniformidad posible. Durante el tiempo que duró el ensayo se tomaron medidas diarias de la CE (conductímetro WTW inoLab Cond level 1) y del pH (pH-metro Meterlab PHM 210), y se realizaron controles periódicos del volumen de sn consumida.
Tabla 1 Concentraciones de Pi (mmol L-1) y de Phi (mmol L-1) de las soluciones nutritivas suministradas a las plantas de seis tratamientos (TI, TII, TIII, TIV, TV y TVI)
* TI, TII, TIII, TIV, TV, TVI: tratamientos aplicados.
Toma de muestras y determinaciones analíticas
La toma de muestras se realizó a los 61 días de la siembra, de una sola vez, tratamiento por tratamiento. Las plantas se extrajeron de sus contenedores con el cepellón, que se introdujo brevemente en un recipiente con agua desionizada para facilitar el desprendimiento de los restos de arena y se extendió sobre láminas de papel de filtro para absorber el exceso de humedad. Cada planta se seccionó separando raíces, tallos y hojas. Cada órgano se midió (diámetro y longitud del tallo, área foliar, longitud radicular), se pesó y se introdujo en bolsas de malla plástica, que se pusieron a secar en una estufa de aire forzado (Selecta) a 65º C durante 48 h. Las muestras secas se pasaron a un desecador, se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se pesaron nuevamente y se molieron con un molino de hojas (Culatti) provisto de un tamiz de 1 mm de luz de malla. Se pesaron entre 1 y 2 g de muestra seca (con aproximación de ± 1 mg) en crisoles de porcelana, se calcinaron a 480º C durante 5 h en un horno mufla (CSF 1100 Carbolite Furnaces), se atacaron con HCl 6 M, se filtraron y se diluyeron a un volumen adecuado (Jones et al., 1991). En el mineralizado obtenido se determinaron Na, K, por fotometría de emisión (espectrofotómetro Corning), Ca, Mg, Fe, Zn, Cu y Mn por espectrometría de absorción atómica (EAA Thermo Series) y P, por espectrofotometría UV/ VIS (espectrofotómetro Perkin-Elmer 551S) según el método del molibdato-vanadato amónico. El N se determinó por el método Kjeldahl (Digestionn unit Block Digest Selecta, Distillation unit 2100 Kjeltec FOSS).
Diseño experimental y tratamiento estadístico de los datos
El ensayo consistió en un diseño de bloques completos al azar con seis tratamientos y cinco repeticiones. Los tratamientos se distribuyeron siguiendo un diseño factorial con dos factores (3 niveles de Pi x 2 niveles de Phi), en el que cada unidad experimental estaba constituida por una sola planta. Los resultados obtenidos se organizaron en varias hojas de cálculo (Microsoft Excel 2013). Las posibles diferencias entre los valores que tomó cada variable en los distintos tratamientos se estableció mediante análisis de la varianza (ANOVA), habiéndose comprobado previamente los supuestos de normalidad (Test de Kolmogorv- Smirnov) y homocedasticidad de las varianzas (Test de Levenne) y, en los casos necesarios, haciendo las transformaciones oportunas. En los casos en que se apreciaron diferencias significativas entre tratamientos se procedió a hacer la separación de las medias a través los Tests de Duncan (alfa = 0.05) y Tukey (alfa = 0.05) (IBM SPSS Statistics 20).
Resultados
Concentración foliar de P
La concentración foliar de P analizada en las plantas de tomate varió dependiendo de la concentración de Pi () y de Phi () de las soluciones nutritivas (sn) suministradas al cultivo. Estuvo comprendida entre 1.54 g kg-1 sobre materia seca (ms) en plantas cultivadas con 0.05 mmol L1 de Pi y 0.00 mmol L-1 de Phi, y 2.11 g kg-1 ms en plantas cultivadas con 1 mmol L1 de Pi y 1.00 mmol L-1 de Phi (Figura 1). Las plantas cultivadas con 0.05 mmol L1 de Pi presentaron niveles foliares de P (1.72 g kg1 ms) más bajos (P< 0.01) que las cultivadas con 1 y 2 mmol L1 de Pi (1.98 y 2.01 g kg1 ms respectivamente) (P> 0.05) (Tabla 3), y las cultivadas en ausencia de Phi, arrojaron concentraciones foliares de P (1.75 g kg1 ms) inferiores (P< 0.01) a las cultivadas en presencia de Phi (2.05 g kg1 ms) (Tabla 3). En los tratamientos sin Phi se encontró una elevada correlación entre la concentración de Pi de la solución nutritiva y la concentración foliar de P (r = 0.91, P< 0.05), que se pudo expresar mediante una función cuadrática (P = 0.130Pi2 + 0.469Pi + 1.518; R2 = 0.913) (Basirat et al., 2011; Martins et al., 2017).
Figura 1 Efecto de la ausencia (0.00 mmol L-1) o presencia (1.00 mmol L-1) de Phi sobre la concentración de foliar de P en plantas de tomate cultivadas con diferentes niveles de Pi (0.05, 1.00 y 2.00 mmol L-1). Las barras de error corresponden al error típico (n=3). Sobre cada barra, y para cada nivel de Pi, letras diferentes señalan diferencias significativas (P< 0.05) entre tratamientos (+ Phi, - Phi). Las líneas horizontales discontinuas limitan el rango de suficiencia para los niveles foliares de P.
Tabla 3 Concentración foliar media y error típico de la media de N, P, K, Ca y Mg (g kg1 ms) analizados en plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) cultivadas con diferentes niveles de Pi (mmol L1) y Phi (mmol L1)
Por columnas, valores seguidos de distintas letras indican diferencias significativas (P< 0.05).*Diferencias significativas (P< 0.05).† P en forma de ortofosfato (PO4 H2-).‡ P en forma de fosfito (PO3H2-)
Parámetros fisiológicos
El crecimiento (pesos secos) de raíces, tallos y hojas estuvo condicionado por la concentración de Pi (P< 0.05) y de Phi (P< 0.05) de la sn (Tabla 4). En el caso de las raíces, y debido posiblemente a la amplia variabilidad de los pesos obtenidos, aunque se observaron diferencias entre algunos tratamientos, estas no fueron significativas (P> 0.05). Tampoco fue significativa, para ningún órgano, la posible interacción Pi_x_Phi (P> 0.05). Es interesante mencionar que, cuando la concentración de Pi aumentó de 0.05 mmol L-1 a 2 mmol L-1, el peso seco medio de la parte aérea (PSA) se incrementó en un 49 %, pero cuando la concentración de Phi aumentó de 0 mmol L1 a 1 mmol L1, el PSA disminuyó en un 28 % (Tabla 4). Para concentraciones de Pi en la sn de 0.05 mmol L-1 y ausencia de Phi, el PSA fue de 2.47 g, mientras que para la misma concentración de Pi y presencia de Phi este PSA fue de tan solo 1.95 g.
Tabla 4 Valores medios y error típico de la media de algunos parámetros fisiológicos determinados en plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) cultivadas con diferentes niveles de Pi (mmol L1) y de Phi (mmol L1): peso seco de la raíz (PSR), peso seco del tallo (PST), peso seco foliar (PSH), peso seco de la parte aérea (PSA) y relación raíz-parte aérea (RRA), PSR, PST, PSH y PSA (g)
Por columnas, valores seguidos de distintas letras indican diferencias significativas (P< 0.05).*Diferencias significativas (P< 0.05).† P en forma de ortofosfato (PO H -).‡ P en forma de fosfito (PO H -)
Un efecto similar, pero mucho más acusado, se observó para concentraciones de 1 y 2 mmol L-1 de Pi en la sn y ausencia (0 mmol L1) o presencia de Phi (1 mmol L1) (Figura 2). La relación raíz/parte aérea (RRA) tomó valores comprendidos entre 0.083 y 0.103 y no se vio afectada por los niveles de Pi en la sn ni por la presencia o ausencia de Phi, lo que mostró, en ambos casos, pequeñas diferencias que no fueron significativas (P> 0.05) (Tabla 4). En el ensayo se midieron otros parámetros como la longitud de la raíz (LR), el diámetro del tallo (DT) o la longitud de la parte aérea (LA). En los tratamientos con Pi, la LR tomó valores comprendidos entre 27.7 y 30.5 cm, el DT entre 0.80 y 0.86 cm, y la LA entre 54.6 y 62.3 cm. En los tratamientos con Phi, la LR tomó valores de 28.8 y 31.2 cm, el DT de 0.82 y 0.86 cm, y la LA de 53.8 y 62.3 cm. De estas variables, la única que mostró diferencias significativas entre los tratamientos fue la longitud de la planta, que fue inferior en los que se aportó Phi (F=6.455, P< 0.05).
Niveles foliares de macro y micronutrientes
Los niveles foliares medios de N estuvieron comprendidos entre 60.3 y 62.9 g kg-1 de ms, los de K entre 19.62 y 20.51 g kg-1 de ms, los de Ca entre 27.40 y 30.77 g kg-1 de ms y los de Mg entre 6.18 y 7.16 g kg-1 de ms (Tabla 3). En los tratamientos con Phi, las concentraciones foliares medias de N, K, Ca y Mg fueron de 60.8, 20.35, 29.35 y 7.5 g kg-1 de ms respectivamente, mientras que en los tratamientos sin Phi fueron de 61.7, 19.86, 28.50 y 6.70 g kg-1 de ms (Tabla 3). En cualquier caso, las pequeñas diferencias que se aprecian no fueron significativas (P> 0.05). Los niveles foliares medios de Fe, Zn, Cu y Mn se muestran en la Tabla 5. Igualmente, se constató que, cuando la concentración de Pi de la sn aumenta, los niveles foliares de Zn, Cu y Mn disminuyen (P< 0.05). Por otra parte, los niveles foliares de Fe y Na no se vieron afectados ni por la concentración de Pi, ni por la de Phi de la sn. Únicamente en el caso del Zn, la interacción Pi x Phi fue significativa (P< 0.05).
Tabla 5 Concentración foliar media (g kg1 sobre materia seca) y error típico de la media obtenidos para Fe, Zn, Cu, Mn (mg kg-1 ms) y Na (g kg-1 ms), analizados en plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) según los niveles de Pi (mmol L1) y Phi (mmol L1) suministrados a las plantas
Por columnas, valores seguidos de distintas letras indican diferencias significativas (P< 0.05). ** Diferencias muy significativas (P< 0.01). * Diferencias significativas (P< 0.05).† P en forma de ortofosfato (PO4 H2-). ‡ P en forma de fosfito (PO3H2-)
Discusión
Los niveles foliares de P analizados en plantas de todos los tratamientos fueron ligeramente superiores a los señalados por Basirat et al. (2011), similares (1.86-2.15 g kg-1 ms) a los indicados por Cole et al. (2016) e inferiores (3.304.15 g kg1 ms) a los señalados por Habibzadeh y Moosavi (2014), y en ningún caso se apreciaron síntomas de deficiencia (Figura 1). Se observó que las plantas cultivadas con 0.05 mmol L-1 de Pi presentaron niveles foliares de P inferiores (P< 0.05) a las cultivadas con 1 y 2 mmol L-1 de Pi y que, en ambos casos, las que no recibieron Phi presentaron niveles foliares de P inferiores a las que sí lo recibieron (Förster et al., 1998). Comparando los pesos secos medios de los órganos analizados tratamiento por tratamiento (Figura 2), se comprueba que la adición de 1 mmol L-1 de Phi a las soluciones nutritivas deficientes en Pi (0.05 mmol L1) no tuvo un efecto favorable sobre el crecimiento de las plantas, y tampoco lo tuvo cuando se añadió a las soluciones nutritivas con una concentración suficiente (1.00 mmol L1) y alta (2.00 mmol L-1) de Pi. En general, el P suministrado al cultivo en forma de Pi tuvo un efecto favorable sobre el crecimiento de todos los órganos, mientras que el suministrado en forma de Phi no lo tuvo o fue desfavorable. Estos resultados son similares a los señalados por Ávila et al. (2012) en un ensayo con fríjol común en suelo (Oxisol) y difieren de los señalados por Araujo et al. (2016), también en un ensayo con fríjol común, pero en cultivo hidropónico. La presencia o ausencia de Phi en la sn afectó la concentración foliar de P, pero no la del resto de macronutrientes (P> 0.05). El N tomó valores superiores a los señalados por Cole et al. (2016) y por Snyder (1992), el K algo inferiores (30.635.2 g kg1 ms), y el Ca y el Mg se mantuvieron dentro del rango considerado adecuado (Snyder, 1992); tampoco afectó la concentración foliar de micronutrientes. Los niveles foliares de Fe, Zn y Cu fueron superiores a los señalados por Rodríguez- Martin et al. (2016) y, en el caso del Zn, fueron muy superiores a los señalados por Cole et al. (2016). El Zn es el único elemento de los analizados en que se observó una interacción significativa entre los niveles de Pi y de Phi (P< 0.05) suministrados a las sn. En este ensayo se ha puesto de manifiesto una vez más la estrecha relación entre la concentración de Pi de la sn y la concentración foliar de P, Zn (Drissi et al., 2015), Mn (Kleiber, 2015) y Cu (Tabla 6), aunque solamente en los tratamientos sin Phi (Tabla 6). En muchos cultivos se ha observado la interacción antagónica entre el P y el Zn, si bien parece que es más del P con el Zn, que del Zn con el P (Kabata-Pendias, 2010; Soltangheisi et al., 2014).
Tabla 6 Coeficientes de correlación (r) entre las variables: concentración de Zn, Cu, Mn, P (foliar) y Pi (sn). Solo se consideran los tratamientos con Phi=0 (mmol L-1)
**La correlación es significativa al nivel 0.01 (bilateral); *La correlación es significante al nivel 0.05 (bilateral); † Zn, Cu, Mn y P: concentraciones foliares (mg kg-1 ms); Pi: concentración en la solución nutritiva (mmol L-1).
Lo anterior muestra que la presencia de Phi en las soluciones nutritivas provocó un incremento en la concentración foliar de P, pero no afectó la concentración foliar de otros macro o micronutrientes.
Tampoco alteró la relación parte aérea/raíz, que se mantuvo constante e independiente de los tratamientos aplicados (PFR = 2.51 + 0.150·PFA; R2 = 0.882). Se constata que las plantas fueron capaces de tomar Phi de la sn pero que no fueron capaces de metabolizarlo (Schachtman et al., 1998), y por ello, el aporte de Phi no supuso un aumento de biomasa. El efecto negativo que la presencia de Phi en las soluciones nutritivas tuvo sobre el crecimiento de las plantas no se puede atribuir a sinergismos o antagonismos con otros nutrientes distintos del Pi, sino a la capacidad que mostraron las plantas para tomar ambas formas de P, y de hacerlo de un modo poco o nada selectivo, con lo cual, la absorción de cierta cantidad de Phi fue en detrimento de la absorción de cierta cantidad de Pi, ocasionando un aumento de la concentración foliar de P, al tiempo que una disminución de la concentración foliar de Pi (Varadarajan et al., 2002). Cabe señalar que algunos datos de carácter genético apuntan claramente a que son las señales originadas en los brotes las que controlan la absorción de P por parte de las raíces (Raghothama, 2000).
Conclusiones
Se determinó que la presencia o ausencia de Phi en la sn (0.00-1.00 mmol L-1) influye sobre el crecimiento de las plantas y sobre la concentración foliar de P, pero no sobre la concentración foliar de los macronutrientes N, K, Ca y Mg, de los micronutrientes Fe, Zn, Cu y Mn, o del Na. Aunque en los tratamientos con Phi la concentración foliar de P aumenta con respecto los tratamientos sin Phi, el crecimiento de las plantas no se ve favorecido, por el contrario, se reduce. Con todo ello, consideramos necesario realizar nuevos ensayos, tanto en hidroponía como en suelo, que permitan confirmar estos resultados y extender las conclusiones.
