Doi: 10.15446/rfmvz.v62n2.51992

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA, PRUEBAS DE CRECIMIENTO Y EFECTO DE INHIBICIÓN IN VITRO DE Lactobacillus casei EN Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae Y Escherichia coli

DETERMINATION OF KINETIC, TESTS AND GROWTH INHIBITION EFFECT OF Lactobacillus casei IN VITRO IN Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae AND Escherichia coli

H. Jurado-Gámez*¹, M. Gúzman-Insuasty²

¹Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño.
Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
²Grupo de investigación Fise-Probiotec, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño.
Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
* Autor para correspondencia: henryjugam@gmail.com

Artículo rebicido: 27 de noviembre de 2014. Aprobado: 14 de abril de 2015

INTRODUCCIÓN

La mastitis es considerada la enfermedad infecciosa más costosa de las vacas lecheras, debido a que induce una disminución en la producción de 4 a 30% de leche y baja su calidad, además de incrementar los costos del cuidado de la salud del hato y un desecho prematuro de animales genéticamente mejorados (Bedolla y Ponce de León 2008). Esta es causada más comúnmente por infección intramamaria (patógeno), pero también puede ser causada por una lesión (herida), y menos frecuente, por alergia y neoplasias (Pastor-Guízar y Bedolla-Cedeño 2008).

Lactobacillus casei es una bacteria Gram positiva con forma de bastón que pueden fermentar una mayor variedad de carbohidratos en comparación con la mayoría de Lactobacillus encontrados en las leches fermentadas (Santacruz 2004). De acuerdo con Bouchard et al. (2013) y Parasol et al. (2005), L. casei posee la capacidad de adherirse al epitelio de la glándula mamaria de vacas productoras de leche, sin presentar ningún efecto citotóxico sobre el huésped. La cepa láctica ha mostrado efectividad en el control de microorganismos patógenos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus agalactiae (Ingrassia et al. 2005). Su metabolismo proporciona cualidades organolépticas a diversas leches fermentadas y quesos; además, se ha encontrado viabilidad de la cepa durante el tránsito por el tracto digestivo, lo cual demuestra un adecuado comportamiento en el uso de la cepa como probiótica (Park et al. 2005).

La presente investigación buscó determinar la cinética, pruebas de crecimiento y el efecto de inhibición in vitro de Lactobacillus casei sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la investigación se adquirieron las cepas comerciales Lactobacillus casei ATCC 11456, Staphylococcus aureus ATCC 13245, Staphylococcus epidermidis ATCC 14532, Streptococcus agalactiae ATCC 15678 y Escherichia coli ATCC 2346 y se aislaron cepas de la región mediante técnicas bioquímicas y microbiológicas.

Se reconstituyeron las cepas comerciales para lo cual se siguieron las instrucciones del fabricante. Para conservar las bacterias se realizó repique en medio sólido cada 5 días y en medio líquido cada 8 días. Para la bacteria láctica el medio sólido fue agar MRS y el medio líquido caldo MRS; para las bacterias patógenas se usó como medio líquido caldo BHI, mientras que el medio sólido fue diferente para cada especie: Sthaphylococcus, agar manitol; Streptococcus, agar base sangre y Escherichia coli, agar McConkey. Todas las cepas se incubaron a 37°C durante 24 horas, y luego fueron refrigeradas a 4°C, hasta su utilización.

El inóculo de L. casei se obtuvo de la siguiente manera: en un Erlenmeyer se depositaron 40 ml de caldo MRS estéril y una alícuota de la bacteria láctica conservada, el preparado se incubo a 35°C durante 24 horas, luego se tomaron del Erlenmeyer 4 ml y se trasladaron a otro Erlenmeyer con la misma cantidad de medio y se incubó en las condiciones mencionadas anteriormente. El ajuste del inóculo se realizó por la metodología propuesta por Crueger y Crueger (1993): se tomaron 90 ml de caldo MRS estéril, se adicionaron 10 ml de la bacteria láctica de acuerdo con la regla; al finalizar el periodo de incubación se tomó 1 ml de la muestra y se hizo lectura directa mediante espectrofotómetro a 625 nm. Por último, en los casos donde la población fue superior a la establecida, se adicionó caldo estéril de acuerdo con lo formulado por Montes etal. 2003 indicada en Jurado-Gámez et al. (2014).

Por su parte, las cepas patógenas aisladas fueron obtenidas de vacas con mastitis. Para ello, se tomaron muestras de leche con mastitis subclínica de fincas de la vereda Victoria, Municipio de San Juan de Pasto (Colombia), caracterizada por una temperatura promedio de 10°C, altura de 3000 msnm, precipitación media anual de 1200 mm. Las muestras fueron seleccionadas a través del California Mastitis Test (CMT) (Valencia et al. 2003), tomando únicamente muestras con grado 2 o 3 y cumpliendo con el protocolo de toma de muestras dado por el laboratorio de la Clínica Veterinaria de la Universidad de Nariño.

Posteriormente, el aislamiento de las cepas se determinó mediante el protocolo de aislamiento basado en el manual de procedimientos microbiológicos del laboratorio de la Clínica Veterinaria de la Universidad de Nariño para aislamientos de cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos (Rodríguez et al. 2009).

Entretanto, se evaluó el crecimiento de L. casei a concentraciones de 0,5; 1 y 2% de sales biliares bovinas y concentraciones de 1 y 1,2% de bilis bovina. Para ello, primero se cultivó la bacteria en caldo MRS por 24 horas; luego de lo cual, de este cultivo se tomaron muestras y se depositaron en tubos con MRS y las diferentes concentraciones a evaluar, enseguida se tomaron muestras para cultivar en agar MRS con azul de anilina y se cultivaron a 32°C durante 48 horas, al final se realizó recuento de bacterias de cada muestra.

Más adelante, se determinó si hubo producción de gas (Dahl et al. 1989) y reacción de catalasa (Cai et al. 1999) en la bacteria láctica y se si la cepa era viable a diferentes niveles de pH, para lo cual se midió el crecimiento a pH 2,5; 4,5 y 7; se evaluó por un periodo de 3 horas, con toma de información cada hora. Para ello, se usó medio MRS comercial y el pH fue ajustado con ácido tartárico, las condiciones de incubación fueron de 32°C durante 48 horas.

Seguidamente, se usaron dos medios de cultivo para evaluar los parámetros cinéticos de L. casei: el primer medio fue el MRS comercial y el segundo el Pro, este último compuesto por 10 g/l de azúcar blanco, 8 g/l de extracto de carne y 4 g/l de extracto de levadura (Jurado-Gámez 2010). Para determinar la cinética de crecimiento se tomó un Erlenmeyer por cada medio, se adicionaron 60 ml de inóculo de L. casei y 540 ml de medio, se llevaron a incubación en incubadora Shaker® con agitación constante a 32°C y 100 rpm, no se controló el pH debido a las características de la cepa que resiste niveles bajos. Posteriormente, se evaluó la cepa durante 24 horas, realizando mediciones cada 2 h 24 min. En cada medición se determinó conteo de microorganismos viables en placa (UFC/ml), pH, azúcar total, producción de ácido láctico y proteína.

El conteo de microorganismos viables en placa se determinó mediante la disolución de 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1%, se realizaron diluciones decimales que fueron transferidas a cajas de Petri, que contenían medio MRS con azul de anilina (0,1 ml) para siembra en superficie. Las cajas fueron incubadas a 32°C y se observaron entre 24 y 48 horas. Se tuvo en cuenta únicamente las cajas de Petri con conteos entre 30 y 300 colonias. El número de colonias fue multiplicado por el inverso de la dilución y por 10 para obtener UFC/ml (Lanara 1981).

Para determinar el pH se tomó una muestra del medio y se midió con pH-metro digital (Jenco® VisionPlus). Por su parte, el azúcar total se determinó mediante el método de Dubois (1956), para lo cual, se prepararon diferentes concentraciones de glucosa para crear una curva patrón mediante los valores obtenidos de la observación de las muestras a una densidad óptica de 625 nm. Los datos se graficaron contra la concentración en mg/l y finalmente se obtuvieron los valores de la línea recta.

El nivel de ácido láctico fue determinado mediante titulación con hidróxido de sodio (1N) (Negri 2005) y el de biomasa con los métodos de Crueger y Crueger (1993) y Rodríguez-León et al. (2003), para ello se estableció la velocidad máxima de crecimiento mediante la siguiente ecuación: 

El nivel de proteína se determinó con el método de Lowry et al. (1951), con modificación de Malara y Charra (1972); se obtuvo una curva patrón a partir de seroalbúmina bovina, luego se midió la absorbencia en espectrofotómetro a 625 nm. La concentración fue graficada contra los valores para obtener la ecuación de la línea recta.

Posteriormente, se determinó la viabilidad de L. casei a dos temperaturas (38 y 45°C), el tiempo de evaluación se llevó hasta la fase exponencial encontrada en la cinética de fermentación en el medio MRS (16 h 48 min). Se usó el procedimiento descrito por Crueger y Crueger (1993), ajustando el inóculo a 0,125 en escala de McFarland y se incubó hasta las 16 h 48 min, luego se hicieron diluciones de 10^-1 hasta 10^-12 con agua peptonada, se sembró en cajas de petri con azul de anilina y se inició en la dilución 10^-8 hasta 10^-12 a 37°C y 48 horas para determinar el recuento de UFC/ml.

Paso seguido, se tomó una muestra de sobrenadante de L. casei y se determinó el contenido de péptidos mediante espec-trofotometría de alta densidad (HPLC), para ello, se usó una alícuota de 25 ml de sobrenadante, la cual fue centrifugada a 18000 rpm durante30 minutos y 4 °C; luego se condujeron 2 ml en jeringa de filtrar (0,25 micras) y finalmente se hizo la lectura en el espectrofotómetro a 650 nm y se obtuvieron los resultados.

Para determinar la producción de ácidos orgánicos se tomó una alícuota de caldo de crecimiento y se centrifugó a 8500 rpm, enseguida se filtró en membrana de 0,25 pm y se determinó la producción mediante HPLC de la siguiente manera: solvente de fase móvil, ácido sulfúrico a pH 1,5; presión, 800-900 PSI; volumen inyectado, 20 L; temperatura del horno, 65°C; columna BIORAD aminex HPX87 H con soporte de resina trasplantada H+ (copolímero de estireno y bisulfato de divinilbenzeno), (Brizuela 2003).

Posteriormente, se efectuó prueba de sensibilidad a los antibióticos sobre las bacterias (patógenas y láctica) con la técnica de Bauer (1966). Los antibióticos evaluados fueron: Gentamicina (CN 10 pg), Penicilina (P 10 IU), Ciprofloxacina (CIP 5 pg), Dicloxacilina (DCX 1 pg), Cefepime (FEP 30 pg), Cefalotina (KF 30 pg), Trimetropin Sulfa (25 pg) y Ampicilina (AM 10 pg).

Para conocer el efecto inhibitorio de L. casei sobre las otras bacterias, se utilizó la metodología de Tagg y McGiven (1971), modificada por Jurado-Gámez etal. 2014.

Por otro lado, se determinó el efecto del sobrenadante de L. casei sobre las bacterias patógenas. Para ello, primero se ajustó la bacteria láctica a 1 en la escala de McFarland (3,0 x 10⁸ UFC/ml), luego se tomaron muestras de 1,5 ml, se depositaron en tubos Eppendorf® y se centrifugaron a 15000 rpm y 4°C de temperatura, durante 15 minutos. Luego de esto, se tomó el sobrenadante, el cual fue evaluado de dos maneras, el primero, filtrado en papel filtro de 0,45 pm y el segundo, sin filtrar; posteriormente, las muestras se conservaron refrigeradas a 4°C hasta su análisis.

Para evaluar el efecto del sobrenadante de L. casei se usó la metodología de Bauer (1966) modificada por Jurado-Gámez et al. 2014. Se usaron dos procedimientos el primero, discos de papel pads y el segundo, cilindros de punta de pipeta estéril con 6 mm de diámetro, para ambos métodos se usaron tres concentraciones (50, 75 y 100pl de sobrenadante).

Para realizar la evaluación estadística se usó el paquete SAS 9.1 (2004). La evaluación de la cinética de fermentación de los medios MRS y PRO se realizó a través de un análisis de medidas repetidas en el tiempo, con el uso del procedimiento PROC MIXED.

RESULTADOS

Se logró identificar las bacterias patógenas Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli en las muestras de leche de vacas con mastitis subclínica y aislarlas para su posterior uso.

Las pruebas de sales biliares bovinas y bilis bovina mostraron crecimientos superiores a 10⁹ UFC/ml. Las pruebas de producción de gas y catalasa fueron negativas y la viabilidad a diferentes valores de pH mostró un crecimiento de 1,1 x 10¹¹; 2,0 x 10¹⁰ y 1,0 x 10¹⁰ UFC/ml para 2; 4,5 y 7, respectivamente.

Se encontró la fase exponencial de crecimiento a las 16 h 48 min con un crecimiento de 3,3 x 10¹⁰ UFC/ml. El pH incial fue de 6,1; de 4,94 durante la fase exponencial y de 4,32 en la fase final; en el análisis de regresión se observó un descenso del pH de -0,117 (r² 0,63 p < 0,05) (Figura 1). Por su parte, el azúcar mostró un valor inicial de 5,98 mg/l, de 2,87 mg/l durante la fase exponencial y de 1,79 mg/l en la fase final (Figura 2); el análisis de regresión determinó un descenso de -0,289 mg/l (r² 0,763 p < 0,05).

En cuanto a la variable acidez, esta mostró un valor de 0,49% en la fase inicial, de 0,88% en la fase exponecial y de 1,23% en la final (Figura 1); la regresión indicó una pendiente de 0,037% (r² 0,872 p < 0,05). A su vez, la variable producción de proteína mostró un valor inicial, exponencial y final de 0,73; 0,68 y 0,36 mg/l, respectivamente (Figura 3); el análisis de regresión determinó que la variable no posee una tendencia cuando se compara con la cinética de crecimiento (r² 0,002 p > 0,05).

Por otro lado, la evaluación de los medios mostró que existieron diferencias significativas entre ellos, con un mayor crecimiento de la bacteria láctica en el medio Pro (p < 0,05). El resumen de datos de la cinética de crecimiento en el medio MRS se puede ver en la Tabla 1.

Los resultados del sobrenadante para determinar las cadenas pépticas se observan en la Figura 4. Se encontró una cadena de péptidos determinada por VAL-TIR-VAL en el pico 8, con un tiempo de retención de 12,15 minutos y una concentración de 0,55 mg/ml (Tabla 2).

En la Tabla 3 se muestra los resultados del análisis de HPLC para determinación de ácidos orgánicos.

La prueba de antibióticos indica que L. casei presenta resistencia a los antibióticos Dicloxacilina, Cefepima, Cefalotina, Gentamicina, Penicilina y Trimetropim sulfa (Tabla 4 y Figura 5). Por su parte, la cepa de S. aureus de referencia fue sensible a Dicloxacilina, Cefepima, Cefalotina, Penicilina, Trimetropim Sulfa y Ampicilina, mientras que la cepa aislada mostró resistencia (Tabla 4). A su vez, la cepa de S. epidermidis de referencia presentó resistencia a la penicilina y la cepa aislada fue resistente a Dicloxacilina, Cefepime, Penicilina y Trimetropin Sulfa. En cuanto a las cepas de S. agalactiae, las dos fueron sensibles a todos los antibióticos. Finalmente, de las cepas de E. coli, únicamente la aislada mostró resistencia a la gentamicina, siendo sensible a los demás antibióticos.

En la Figura 6 se puede observar que las cepas de referencia fueron susceptibles a la bacteria láctica, sin embargo, entre las bacterias aisladas se encontró resistencia de E. coli a todas las concentraciones y resistencia de S. epidermidis a concentraciones de 25 y 100 μl.

En las Figuras 7 y 8 se observa la inhibición del sobrenadante de L. casei sobre las bacterias patógenas.

No se encontró relación entre los métodos evaluados para el sobrenadante, ya que el análisis de correlación fue bajo (0,12 p > 0,05), por consiguiente las metodología observadas en la presente investigación necesitan evaluarse de mejor manera.

DISCUSIÓN

La cepa láctica mostró un crecimiento adecuado en los diversos ambientes evaluados (temperatura, pH, sales biliares, bilis). Su crecimiento se encuentra por encima de los reportados como aceptables (< 10⁹) para una adecuada colonización del tracto digestivo. En este sentido, uno de los factores de mayor importancia en la selección de cepas probióticas es la viabilidad a diferentes valores de pH (Salvatierra et al. 2004; Tuomola etal. 2001). En su caso, el crecimiento a niveles bajos de pH permite la colonización de lugares difíciles como el estómago, lo cual trae como beneficio el bloqueo de los sitios de adhesión para bacterias patógenas y la producción de metabolitos antimicrobianos (Shiva-Ramayoni 2007). A su vez, las pruebas de bilis y sales biliares mostraron resistencia de la cepa láctica al estrés producido por estas sustancias, factor de importancia si se considera que para una correcta colonización del sistema digestivo de los animales la cepa administrada de forma oral, debe tener la capacidad de crecer en las diferentes condiciones presentes en el huésped. (Melgar-Lalane et al. 2014). 

El valor obtenido durante la fase exponencial muestra que la cepa láctica posee características adecuadas de crecimiento en el medio MRS, además, el nivel de crecimiento es bueno para la producción de inóculos con miras a la obtención de probióticos (Pérez-Luyo 2008). Los resultados obtenidos a las 16 h 48 min indican que la cepa alcanza niveles de crecimiento adecuados para colonizar la mucosa intestinal; así mismo, el tiempo necesario para alcanzar la fase exponencial fue superior a lo reportado por Jurado-Gámez (2010) en L. plantarum. Así pues, con este nivel de crecimiento la bacteria láctica tendrá la capacidad de competir con bacterias patógenas, con beneficios en el huésped, reduciendo la translocación y la inflamación intestinal (Adawi et al 1997); además, estimula la producción de musina en el epitelio celular (Mack et al 2003; Pérez-Luyo 2008).

Los resultados de pH encontrados muestran que L. casei favorece procesos de fermentación cuando se produce un inóculo; de esta manera, se observa un crecimiento a niveles pabjos de pH, condición adecuada para resistir el ambiente estomacal de los animales (Prescott et al. 2002); lo anterior demuestra que la cepa láctica es acidúrica, con crecimiento a pH inferior a 5 (Ben Ounis et al. 2008), esta capacidad de resistencia se logra a través de mecanismos celulares que mantienen el pH cerca de la neutralidad. A su vez los valores encontrados para azúcar total muestran una adecuada fermentación de los nutrientes presentes en el medio, lo que favorece su crecimiento. De esta manera, el medio posee las condiciones necesarias para producir inóculos a nivel industrial (Pyo et al. 2005), al respecto Ben et al. (2008) mencionan que las bacterias lácticas utilizan diferentes oligosacaridos entre los que se encuentran estaquiosa y rafinosa durante la cinética de fermentación.

De otra parte, la resistencia de las cepas aisladas a los antibióticos evaluados puede deberse a una mala administración de medicamentos a los animales afectados, sin realización de un previo diagnóstico que identifique el microorganismo causante de la enfermedad (Montes et al. 2003). En efecto, las bacterias patógenas poseen varios mecanismos de resistencia a los antibióticos como: modificación enzimática del antibiótico, bombas de expulsión, cambios en la permeabilidad de la membrana externa y alteraciones del sitio de acción, que dificultan el manejo terapéutico de las enfermedades producidas por estos microorganismos (Tafur et al. 2008). Esta característica se ha convertido en un problema para el productor, dado que las cepas al ser más resistentes a los antibióticos, dificultan el control de enfermedades importantes para el adecuado desarrollo de la industria lechera (Bedolla y Ponce de León 2008).

Entre tanto, la cepa láctica mostró efectividad en el control de S. aureus, S. epidermidis y S. agalactiae, pero no fue efectiva con E. coli. Esto permite inferir que la bacteria es un buen competidor contra las bacterias patógenas susceptibles, presentándose como una alternativa para el manejo de mastitis ocasionada por estos microorganismos. Al respecto, Soleimani et al. 2010 encontraron resultados similares al evaluar L. casei con S. aureus aislada de vacas con mastitis. Los resultados del sobrenadante muestran el mismo comportamiento de la cepa láctica.

Las anteriores características muestran el potencial de L. casei como probiótico para la industria lechera. Sin embargo, se debe evaluar la cepa en condiciones in vivo, para determinar si su comportamiento se encuentra o no afectado por otras condiciones no evaluadas en la presente investigación. El uso de probióticos permite sustituir los antibióticos en el manejo de enfermedades animales, ya que son métodos menos agresivos y no tiene efectos secundarios con impacto en la salud del ser humano. Además, evaluar cepas que tengan la capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos propios de una región, permite mejorar el control de los mismos, ya que se han encontrado cambios en el grado de efectividad de cepas que han sido evaluadas en lugares diferentes al de su aplicación final (Frizzo et al. 2002).

Finalmente, el resultado obtenido para producción de ácidos orgánicos muestra una efectiva producción de ácido láctico por parte de la bacteria lo cual es indicativo de que la bacteria láctica puede alterar el medio donde se encuentra, favoreciendo la inhibición de otros microorganimos (Helander 1997), la producción del metabolito se debe a la fermentación de hexosas usando la vía de Embden-Meyerhoff y como producto final se obtiene además de ácido láctico, también ácido acético, etanol y ácido fórmico (Zhan et al. 2006).

CONCLUSIONES

Se concluye que Lactobacillus lactis presenta características adecuadas como agente inhibidor de bacterias patógenas causantes de mastitis subclínica en la región de Nariño (Colombia).

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