DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA, PRUEBAS DE CRECIMIENTO Y EFECTO DE INHIBICIÓN IN VITRO DE Lactobacillus lactis EN Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae Y Escherichia coli

DETERMINATION OF KINETIC, TESTS AND GROWTH INHIBITION EFFECT OF Lactobacillus lactis IN VITRO IN Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae AND Escherichia coli IN HOLSTEIN COWS

H. Jurado-Gámez¹, M. Gúzman-Insuasty², V. Jarrín-Jarrín³

¹Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño.
Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
²Grupo de investigación Fise-Probiotec, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño.
Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
³Programa de Ingenieria Agroindustrial, Facultad de Ingeniería Agroindustrial, Universidad de Nariño.
Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
* Autor para correspondencia: henryjugam@gmail.com

Artículo rebicido: 27 de noviembre de 2014. Aprobado: 14 de abril de 2015

INTRODUCCIÓN

Lactobacillus lactis pertenece al grupo de las bacterias ácido lácticas que son denominadas GRAS (generalmente reconocida como segura). Habitualmente es utilizada en la industria de alimentos fermentados, principalmente en la industria lechera desde hace muchas décadas (Norren et al. 2011). Este microorganismo se encuentra en la leche y algunos productos lácteos y. se caracteriza por producir nisina; la cual tiene efecto antimicrobiano. Debido a esta característica, su aislamiento permite utilizarlo en la conservación de alimentos que tienen compromiso con bacterias patógenas responsables de las EDTA (Zhou et al. 2010).

Durante su evolución, las bacterias han adquirido diversos mecanismos de adaptación que les permiten tener éxito en la competencia por nutrientes y espacio en su hábitat. Estos mecanismos incluyen desde el mejoramiento de los sistemas de quimiotaxis hasta el desarrollo de sistemas de defensa como la producción de péptidos antimicrobianos o bacteriocinas (López et al. 2008). Este tipo de sustancias son importantes para la industria alimentaria dado que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos, catalogados como peligrosos para la salud humana y animal.

Uno de los principales problemas para la industria lechera es la mastitis, para la cual se han reportado más de 100 microorganismos causantes de infección intramamaria. La mayoría de las infecciones, incluidas las de importancia económica, son ocasionadas por especies de estafilococos, estreptococos y bacterias Gram-negativas; estas últimas son esencialmente coliformes. Este tipo de microorganismos causan serias pérdidas a la industria, por lo cual la investigación se encuentra encaminada a la búsqueda de nuevas soluciones (Bedolla y Ponce de León 2008).

La presente investigación determinó la cinética, pruebas de crecimiento y efecto de inhibición in vitro de L. lactis sobre las bacterias patógenas Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli.

MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Pecuarias, de la Universidad de Nariño, ubicada en la ciudad de Pasto (Colombia) con una temperatura promedio de 14°C, a 2540 msnm, 1084 mm de precipitación anual promedio y 76% de humedad relativa.

La cepa láctica usada en la investigación fue Lactobacillus lactis (ATCC 11454). Por su parte, se usaron cepas patógenas aisladas de la zona de estudio y cepas adquiridas mediante casa comercial de referencia: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Streptococcus agalactiae (ATCC 13813) y Escherichia coli (ATCC 25922).

La reconstitución de las cepas comerciales se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (patógenas y láctica). Posteriormente, para la conservación de la bacteria láctica se realizó repique en medio sólido (cajas con agar MRS) cada 5 días y en medio líquido (tubos con caldo MRS) cada 8 días; mientras que para las bacterias patógenas se usó caldo BHI como medio líquido y como medio sólido, agar manitol para Staphylococcus, agar base sangre para Streptococcus y agar McConkey para Escherichia coli. Todos los preservados fueron incubados a 37°C y 24 horas, y llevados a refrigeración (4°C) hasta su utilización.

Para realizar el cultivo del inóculo de L. lactis se tomó un Erlenmeyer con 40 ml de caldo MRS estéril y se depositó una alícuota de la bacteria conservada; enseguida se incubó por un periodo de 24 horas a 35°C, al cabo del cual, se tomaron 4 ml del incubado y se depositaron en otros 40 ml de caldo MRS comercial que a su vez fueron incubados en las condiciones anteriormente mencionadas. Para ajustar el inóculo se tuvo en cuenta la metodología propuesta por Crueger y Crueger (1993) y Jurado-Gámez (2014). Por último, cuando se encontró una población superior a la establecida se adicionó caldo estéril teniendo en cuenta la propuesta de Montes et al. (2003) mostrada en Jurado-Gámez 2014.

Por su parte, para la obtención de bacterias patógenas aisladas, se tomaron varias muestras de leche con mastitis subclínica en la vereda Victoria, corregimiento de Catambuco, Municipio de San Juan de Pasto (Colombia) con temperatura promedio de 10°C, 3000 msnm y precipitación promedio anual de 1200 mm. Las muestras con grado 2 o 3 según el test de CMT (California Mastitis Test) (Valencia, et al. 2003) fueron llevadas al laboratorio para el aislamiento y caracterización.

Posteriormente, el aislamiento de las cepas patógenas Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli presentes en leche de vacas con mastitis subclínica se realizó mediante el protocolo propuesto por la Clínica Veterinaria de la Universidad de Nariño para aislamiento de cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos (Rodríguez 2009).

Por otro lado, se determinó el crecimiento de la cepa láctica a concentraciones de 0,5; 1 y 2% de sales biliares bovinas y concentraciones de 1 y 1,2% de bilis bovina. Para ello, previamente la cepa se cultivó en caldo MRS durante 24 horas luego de lo cual, de este cultivo se realizó una nueva inoculación en caldo MRS con las diferentes concentraciones de sales biliares y bilis bovina de manera separada, luego se tomaron muestras y se cultivaron en agar MRS con azul de anilina, permaneciendo 48 horas a 32°C.

Más adelante, se realizaron pruebas de producción de gas (Dahl et al. 1989) y catalasa (Cai et al. 1999) a la bacteria láctica; también se evaluó el crecimiento de la cepa a tres niveles de pH (2; 4,5 y 7), registro realizado durante tres horas, con toma de muestras cada hora. Para ello, la cepa fue sembrada en medio MRS comercial y el pH se ajustó con la adición de ácido tartárico, para inhibir el efecto de la producción de ácido láctico. Las condiciones de incubación fueron de 32°C por 48 h.

Por otro lado, se evaluó la cinética de fermentación de L. lactis en dos medios de cultivo (MRS y Pro) (Jurado-Gámez 2010), para cada medio se tomó un Erlenmeyer al cual se le adicionaron 540 ml de medio y 60 ml de inóculo, luego se llevó a incubación (incubadora Shaker®) en agitación constante a 32°C y 100 rpm, el pH no fue controlado dada la resistencia de las cepas a niveles bajos. Durante la cinética se evaluó: conteo de microorganismos viables en placa (UFC/ml), determinación de pH, determinación de azúcar total y determinación de producción de ácido láctico. Las mediciones se realizaron cada 2:24 horas durante 24 horas.

El conteo de microorganismos viables en placa se determinó mediante la disolución de 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1%, se realizaron diluciones decimales que fueron transferidas a cajas de Petri, que contenían medio MRS con azul de anilina (0,1 ml) para siembra en superficie. Las cajas fueron incubadas a 32°C y se observaron entre 24 y 48 horas. Se tuvo en cuenta únicamente las cajas de Petri con conteos entre 30 y 300 colonias. El número de colonias fue multiplicado por el inverso de la dilución y por 10 para obtener UFC/ml (Lanara 1981).

Para determinar el pH se tomó una muestra del medio y se midió con pH-metro digital (JENCO® VisionPlus). Por su parte, el azúcar total se determinó mediante el método de Dubois (1956), para lo cual, se prepararon diferentes concentraciones de glucosa para crear una curva patrón mediante los valores obtenidos de la observación de las muestras a una densidad óptica de 625 nm. Los datos se graficaron contra la concentración en mg/l y finalmente se obtuvieron los valores de la línea recta.

El nivel de ácido láctico fue determinado mediante titulación con hidróxido de sodio (1N) (Negri 2005) y el de biomasa con los métodos de Crueger y Crueger (1993) y Rodríguez-León et al. (2003), para ello se estableció la velocidad máxima de crecimiento mediante la siguiente ecuación:

El nivel de proteína se determinó con el método de Lowry etal. (1951), con modificación de Malara y Charra (1972), se realizó una curva de calibración mediante seroalbúmina bovina y se cuantificó la absorbancia en espectrofotómetro a 625 nm. Los valores obtenidos fueron graficados contra la concentración para obtener la ecuación de la línea recta.

Posteriormente, se evaluó la viabilidad de L. lactis a dos temperaturas 38 y 45°C, tomando como referencia la fase exponencial de crecimiento encontrada en la cinética de fermentación. El procedimiento se basó en lo propuesto por Crueger y Crueger (1993), para ello, se ajustó el inóculo de acuerdo con la escala de MacFarland a 0,125; la incubación duró 14:24 horas luego de iniciada la prueba, luego de lo cual se realizaron diluciones de 10^-1 hasta 10^-12 en agua peptonada y se sembraron en cajas de Petri con azul de anilina comenzando en la disolución de 10^-8 hasta la máxima disolución, las cajas se incubaron por 48 horas a 37°C para determinar el recuento de colonias en UFC/ml.

Paso seguido, para determinar el contenido de péptidos presentes en el sobrenadante de L. lactis, se tomó una muestra y se identificaron los péptidos mediante espectrofotometría de alta eficiencia. Para ello, se tomaron 25 ml de sobrenadante que fueron centrifugados a 18000 rpm por un periodo de 30 min y 4°C, a continuación se pasaron por jeringas de filtrar 0,25 micras (2 ml) y finalmente se hizo la lectura en el espectrofotómetro y se obtuvieron los valores correspondientes.

El análisis de producción de ácidos orgánicos se realizó por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) (Brizuela 2003). Se tomó una alícuota de caldo de crecimiento y fue centrifugado a 8500 rpm, enseguida se filtró el sobrenadante con membrana 0,45 pm y se realizó la lectura por HPLC. Los ácidos orgánicos fueron determinados por HPLC así: solvente de fase móvil, ácido sulfúrico a pH 1,5; presión, 800-900 PSI; volumen inyectado, 20 L; temperatura del horno, 65°C; columna BIORAD aminex HPX87 H con soporte de resina trasplantada H+ (copolímero de estireno y bisulfato dedivinilbenzeno).

Posteriormente, con las cepas patógenas (aisladas y de referencia) y la bacteria láctica, se determinó la inhibición producida por los antibióticos: Gentamicina (CN 10 pg), Penicilina (P 10 IU), Ciprofloxacina (CIP 5 pg), Dicloxacilina (DCX 1 pg), Cefepime (FEP 30 pg), Cefalotina (KF 30 pg), Trimetropin Sulfa (25 pg) y Ampicilina (AM 10 pg) mediante la técnica de Bauer et al. (1966); para ello se tomaron alícuotas de las bacterias y se depositaron cada una en un tubo con 1 ml de agua destilada, luego los tubos fueron incubados a 35°C, hasta alcanzar la turbidez ópticamente comparable con el estándar 0,5 de MacFarland; después de ajustada la turbidez se transfirió cada cepa a cajas de Petri con agar Müller Hilton, distribuyéndose sobre este con un hisopo de algodón. Posteriormente, se tomaron, con pinza estéril, discos impregnados con los antibióticos y se depositaron sobre el agar, realizando ligera presión para que se adhieran al medio, enseguida se invirtieron las cajas de Petri para evitar acumulación excesiva de humedad y se incubaron a 35°C por 18 horas; transcurrido este tiempo, se midió el halo formado entre el borde del disco y el borde máximo de inhibición.

Adicionalmente, se evaluó la inhibición producida por L. lactis sobre las bacterias patógenas (aisladas y de referencia), mediante la metodología de Tagg y McGiven (1971). Se tomó una alícuota de L. lactis y se ajustó a 0,5 en la escala McFarland, para sembrar en cajas de Petri con agar MRS y azul de anilina a cantidades de 25, 50 y 100 µl que se incubaron a 32°C por 24 horas. Por su parte, las bacterias patógenas también fueron ajustadas a escala MacFarland 0,5 pero sembradas en cajas de Petri con agar Müeller Hilton y agar TSA (Triptona Soya Agar). Del agar MRS incubado con la bacteria láctica se tomaron discos y se colocaron en las cajas de Petri con las bacterias patógenas (aisladas y de referencia), enseguida se incubaron a 32°C por 12 horas; luego de transcurrido este tiempo se procedió a medir los halos de inhibición, se determinó susceptibilidad de las cepas patógenas cuando el halo fue igual o superior a 2 mm (Estrada et al. 2005).

A partir de L. lactis, se extrajeron las biocinas presentes en el sobrenadante; para ello se ajustó la concentración de la bacteria a 3,0 x 10⁸ UFC/ml (1 en la escala McFarland; 625 nm). De esta se tomaron varias muestras de 1,5 ml y se depositaron en tubos Eppendorf® para centrifugar a una temperatura de 4°C con 15000 rpm durante 15 min. Se tomó el sobrenadante de dos formas, la primera sin filtrar y la segunda filtrado, para esta última se usó papel filtro de 0,45 pm. Cada muestra se refrigeró a 4°C para posterior análisis. Paso seguido, los sobrenadantes, se evaluaron mediante la metodología de Bauer et al. (1966) modificada; el sobrenadante se colocó de dos formas: el primero, mediante papel pads, sobre el cual se depositaron concentraciones de 50, 75 y 100 µl y el segundo, mediante cilindros estériles de 6 mm de diámetro, sobre los cuales se depositaron las mismas concentraciones (los cilindros fueron obtenidos de puntas de pipeta estériles). Los discos y cilindros fueron colocados en cajas de Petri con las bacterias patógenas y se realizó el mismo procedimiento para determinar la inhibición de L. lactis.

Los datos fueron evaluados mediante el paquete estadístico SAS 9.1 (2004). Para realizar la comparación de cinética de crecimiento entre los medios MRS y PRO se usaron medidas repetidas en el tiempo, con el procedimiento PROC MIXED.

RESULTADOS

Las cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli de leche de vaca con mastitis subclínica fueron identificadas y aisladas para su posterior uso.

La cepa láctica presentó dificultades al 1% de bilis bovina, ya que no presentó crecimiento a esta concentración; sin embargo, a una mayor concentración (1.2%) presentó buen comportamiento, ya que se obtuvo un valor de 5 x 10⁹ UFC/ml. En el caso de las sales biliares se encontró crecimiento únicamente a la más baja concentración (0,5%) con valor de 5 x 10⁸ UFC/ml.

Las pruebas de catalasa y producción de gas fueron negativas. Mientras que la prueba de pH (tres niveles) indicó crecimientos de 1,4 x 10¹²; 6,4 x 10¹¹ y 7,5 x 10¹¹ para pH 2; 4,5 y 7 respectivamente. La temperatura mostró valores de 2,8 x 10¹² y 3,1 x 10¹² UFC/ml para 38 y 45°C.

En la Figura 1, se puede observar la cinética de crecimiento de L. lactis comparada con las variables pH, acidez, azúcar y proteína. Se encontró que la fase de crecimiento exponencial en el medio MRS se desarrolló a las 14:24 horas de iniciado el proceso de incubación, con un valor de 2 x 10¹¹ UFC/ml.

Se observó un descenso del pH de 0,23 unidades, con un valor inicial de 6,14 y un valor final de 3,91; se observó un pH de 4,29 durante la fase exponencial. Por consiguiente, se evidenció un incremento de la acidez del medio de 0,73%, durante toda la cinética de evaluación; con un valor de 0,62% de acidez en la fase exponencial. De otro lado, se obtuvo un consumo de azúcar de 5,82 ml/l durante todo el periodo de evaluación, con un consumo de 3,67 ml/l hasta la fase exponencial. Por su parte, el análisis de proteína mostró un valor de 0,28 y 0,169 ml/L al inicio y final de la fermentación, respectivamente.

La comparación entre los medios MRS y Pro determinó diferencias estadísticas entre los medios (p < 0,05), para lo cual, la prueba de Tukey mostró un mayor crecimiento de L. lactis en el medio Pro, por lo tanto se puede argumentar que el medio puede ser usado para determinar la cinética de crecimiento in vitro de las bacterias en evaluación. Por otra parte, no se encontró efecto del tiempo en el análisis (p > 0,05), por lo cual solo se tuvo en cuenta únicamente el efecto de los medios. En la Tabla 1 se resumen los datos encontrados en la cinética del medio MRS.

A su vez, se encontró correlación de las variables pH, acidez y azúcar con referencia a la variable UFC/ml. El análisis de regresión indicó que las pendientes de la recta fueron de -0,182; 0,028; -0,29 y 0,001para pH, acidez y azúcar, respectivamente (p < 0,05). Para la proteína el análisis no indicó correlación (p > 0,05).

Los resultados de HPLC efectuados al sobrenadante de L. lactis se pueden observar en la Figura 2. La comparación de los picos del sobrenadante con el estándar muestra que durante el tiempo 11,842 (aprox. 12), el pico número 8 del sobrenadante presenta un tiempo de retención similar; al respecto, se puede determinar la existencia de una cadena de aminoácidos VAL-TIR-VAL, con una concentración de 0,66 mg/ml de muestra.

En la Tabla 2 se observa los resultados obtenidos en la determinación de ácidos orgánicos.

La cepa láctica mostró resistencia a Dicloxacilina, Cefepima y Cefalotina, con sensibilidad a Ciprofloxacina, Gentamicina, Penicinila, Trimetropim Sulfa y Ampicilina (Tabla 3 y Figura 3).

Los resultados sobre las cepas de S. aureus mostraron que la cepa de referencia fue sensible a los antibióticos Dicloxacilina, Cefepima, Cefalotina, Penicinila, Trimetropim Sulfa y Ampicilina y la cepa aislada presentó resistencia a los mismos. Por su parte, la cepa de referencia de S. epidermidis fue resistente únicamente a la penicilina, mientras que la cepa aislada fue resistente a la Dicloxacilina, Cefepima, Penicilina, y Trimetropim Sulfa. En cuanto a las cepas aislada y de referencia de Streptococcus agalactiae, mostraron sensibilidad a los antibióticos Dicloxacilina, Cefepima, Cefalotina, Penicilina, Trimetropim Sulfa y Ampicilina. A su vez, la cepa de E. coli de referencia presentó sensibilidad a todos los antibióticos evaluados (Cefepima, Cefalotina, Ciprofloxacina, Gentamicina, Trimetropim Sulfa y Ampicilina), mientras que la cepa aislada mostró resistencia a la Gentamicina (Tabla 3). Ahora bien, se observó que la cepa de referencia de S. aureus fue resistente a la bacteria láctica, a diferencia de la aislada. Las cepas de S. agalactiae presentaron resistencia a concentraciones de 25 y 50 µl; y 50 µl, para la cepa aislada y de referencia, respectivamente. S. epidermidis mostró susceptibilidad a L. lactis. Las cepas de E. coli fueron sensibles a la bacteria láctica (Figura 4 y 5a).

En las Figuras 6 y 7 se puede observar que S. aureus aislado, presenta resistencia a las tres concentraciones del sobrenadante de Lactobacillus, mientras que la cepa de referencia mostró susceptibilidad; los resultados fueron similares para la toma del sobrenadante (con y sin filtro). De igual forma, se observa que S. agalactiae aislado presenta resistencia al sobrenadante, sin embargo, la cepa de referencia presenta sensibilidad a una concentración de 75 µl; los resultados fueron iguales con filtro y sin filtro. En cuanto a las cepas de S. epidermidis, fueron resistentes al sobrenadante filtrado (aislada y referencia), sin embargo, se observó susceptibilidad de la cepa de referencia al sobrenadante sin filtrar. Finalmente, la cepa aislada de E. coli mostró resistencia al sobrenadante filtrado y sin filtrar, mientras que la cepa de referencia mostró sensibilidad a 50pl y las tres concentraciones para el sobrenadante filtrado y sin filtrar, respectivamente.

Se encontró un coeficiente de correlación de 0,1385 entre el método de sensidisco y el método de cilindro, por ello se argumenta que no existe relación entre metodologías.

DISCUSIÓN

Las pruebas que simulan las condiciones gastrointestinales in vitro (pH, temperatura) muestran adecuado comportamiento de la cepa láctica. Sin embargo, la prueba de sales biliares y bilis bovina indicaron que la cepa no tolera las concentraciones evaluadas, dado que no presentó crecimiento en estas condiciones. Al respecto, Iniguez-Palomares et al. (2007) y Carr et al. (2002), mencionan que para considerar una cepa microbiana como probiótica debe tener la capacidad de adherirse, crecer y colonizar el tracto digestivo del animal huésped; para ello, debe resistir las diversas condiciones que presenta el sistema digestivo de los animales como son el pH y la temperatura.

La fase exponencial de la cepa láctica mostró un crecimiento adecuado. Con ello se consiguió el tiempo necesario para obtener el valor máximo; es importante determinar la capacidad de desarrollo de la bacteria probiótica, con el fin de establecer su capacidad de producir inóculo (Zamudio y Zabaleta 2003). Además, un el crecimiento adecuado es un indicador de la inhibición que posee sobre otros microorganismos, ya que el uso de nutrientes del medio no será una limitante (Pérez-Luyo 2008).

Por otra parte, el pH encontrado durante la fase de crecimiento exponencial indica que la cepa posee características adecuadas para resistir ambientes con niveles bajos de pH; esta capacidad es importante para un probiótico, dado que le permitirá sobrevivir con crecimientos adecuados. Una cepa que no puede adecuarse a los diferentes ambientes del tracto digestivo, difícilmente podrá llegar a considerarse como un probiótico (Prescott et al. 2002). La capacidad de L. lactis de crecer en medios ácidos se debe a que los mecanismos celulares de bomba de extracción de protones le permiten tener valores próximos a la neutralidad (Godward et al. 2000).

En otro sentido, la determinación de producción de ácidos orgánicos mostró que la cepa láctica es homofermentativa, dado que se encontró un porcentaje superior al 80% de ácido láctico en la muestra analizada. Esta es una buena característica, dado que el ácido láctico es el ácido con mayor poder de inhibición reportado en la literatura (Mishra y Lambert 1996).

La evaluación de la bacteria láctica mostró que no es resistente en condiciones in vivo, cuando el organismo huésped, se encuentre tratado con los antibióticos evaluados. A diferencia de otras especies bacterianas, la cepa comercial no ha creado resistencia, debido posiblemente a que no es un agente patógeno y por consiguiente no es tratado en el control de enfermedades bacterianas (Aarestrup 2000).

En otro sentido, se observa diferencia entre las cepas patógenas aisladas y de referencia, ya que las primeras presentan mayor resistencia a los antibióticos evaluados. A pesar de ser este un fenómeno natural de los microorganismos, el proceso puede ser acelerado por diversos factores, entre los que se encuentran un inadecuado uso de los antibióticos en el control de enfermedades como la mastitis o residuos antibióticos en los alimentos, entre otros (Martínez-Pacheco et al. 2013). Las bacterias que presentan mayor evidencia de este proceso son S. aureus y S. epidermidis, posiblemente porque al ser los principales agentes de la causa de la mastitis en la región, su control se realice de forma inadecuada. En cuanto a las cepas de S. agalactiae y E. coli presentan un comportamiento similar entre microorganismos aislados y de referencia, por lo cual se determina que estos agentes tienen baja incidencia en la zona.

L. lactis resultó ser un buen candidato como agente reductor de la población patógena evaluada con cepas obtenidas de vacas con mastitis subclínica en la región. Al respecto, Fernández (2005), menciona que las bacteriocinas producidas por bacterias probióticas pueden servir como barreras antimicrobianas y ayudar a reducir los niveles de microorganismos patógenos, efecto observado en la presente investigación. Sin embargo, se debe notar que los mayores halos de inhibición se producen en las cepas de referencia, por lo cual se infiere que las cepas aisladas presentan un cierto grado de resistencia a la bacteria láctica que pueden afectar los resultados cuando se evalué en condiciones in vivo. Un caso particular se da en la cepa de referencia de E. coli, ya que presenta resistencia, a diferencia de la cepa aislada.

El caso del sobrenadante de L. lactis muestra resistencia de las cepas aisladas, por lo cual se infiere que el sobrenadante no es efectivo en el control de estos microorganismos. Sin embargo, los resultados encontrados con el uso de la cepa son opuestos. Esto hace suponer que el sobrenadante usado en la evaluación no presentó un adecuado nivel de sustancias inhibidoras, los cuales generaron los resultados encontrados.

La metodología modificada de Bauer et al. (1966) indica que no se pueden hacer comparaciones entre las dos formas de colocar el sobrenadante (disco de papel pads y cilindro plástico), ya que los resultados no son correlacionados (p> 0,05; corr: 0,08). Se necesita mejorar la técnica de cilindros y aumentar el número de mediciones para determinar con mayor precisión los halos de inhibición. Estos resultados son diferentes a los encontrados por Jurado-Gámez et al. (2013), donde las dos formas registraron resultados similares.

Finalmente, se concluye que la cepa de Lactobacillus lactis representa una buena alternativa para ser evaluada en condiciones in vivo, aunque se debe tener en cuenta que presenta dificultades con las secreciones biliares. Sin embargo, se necesita continuar con la investigación en esta área para determinar la eficiencia de la cepa láctica sobre el control de bacterias patógenas en la región de Nariño.

REFERENCIAS

Article citation:

Jurado-Gámez H, Gúzman-Insuasty M, Jarrín-Jarrín V. 2015. Determinación de la cinética, pruebas de crecimiento y efecto de inhibición in vitro de Lactobacillus lactis en Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli [Determination of kinetic, tests and growth inhibition effect of Lactobacillus lactis in vitro in Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli in holstein cows]. Rev Med Vet Zoot. 62(2): 40-56. Doi: 10.15446/rfmvz.v62n2.51993.