Doi: 10.15446/rfmvz.v63n3.62745

EVALUACIÓN in vitro DE Lactobacillus gasseri CON CARACTERISTICAS PROBIÓTICAS SOBRE Staphylococcus aureus

 IN VITRO evaluation OF Lactobacillus gasseri WITH PROBIOTIC CHARACTERISTICS ON Staphylococcus aureus

H. Jurado-Gámez^{1 *}, I. Fajardo-Argoti¹, A. Rodríguez-Caicedo¹

¹ Grupo de investigación Fise-Probiotec, Programa de Zootecnia, Departamento de Producción y Procesamiento Animal,
Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño. Pasto (Colombia).
^* Autor para correspondencia: henryjugam@gmail.com.

Artículo recibido: 18 de julio de 2016 • Aprobado: 24 de octubre de 2016

RESUMEN

Introducción: Lactobacillus gasseri es una bacteria láctica del tracto digestivo que tiene características probióticas importantes para el control de organismos patógenos mientras Staphylococcus aureus es una cepa patógena importante en la industria alimentaria debido a los problemas sanitarios que produce en varios países. Objetivo: evaluar las características probióticas de L. gasseri sobre S. aureus en condiciones in vitro. Materiales y métodos: se evaluó la susceptibilidad de ambas cepas a diferentes antibióticos; el efecto de inhibición de L. gasseri y su sobrenadante sobre S. aureus; el crecimiento de la cepa láctica a diferentes pH, temperaturas, sales biliares y bilis bovina; se estableció la cinética de fermentación y en ella se determinó conteo de microorganismos viables en placa, pH, consumo de azúcar, consumo de proteína y porcentaje de ácido láctico; mediante HPLC-DAD se determinaron péptidos y ácido láctico; y en el caso de aminoácidos en el sobrenadante, se determinó mediante HPLC-PDA. Resultados: se encontró resistencia de ambas cepas a los antibióticos penicilina, dicloxacilina, cifoxitin y cefalexin. La cepa láctica y el sobrenadante inhibieron el crecimiento de S. aureus. El crecimiento fue adecuado para las diferentes variables con valores entre 1,5 x 108 a 3,0 x 1014 UFC/150 μl. Se observó la fase exponencial a las 9 horas con valores de 33,33 Ln UFC/150 μl. Finalmente se identificaron, a través de HPLC-DAD, el péptido VA L-TIR-VA L, 11,70 g/l de ácido láctico y el aminoácido tirosina. Conclusión: los resultados demuestran que L. gasseri tiene características probióticas sobre S. aureus en condiciones in vitro.

Palabras claves: bacteria láctica, inhibición, cepa patógena, probiótico.

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ABSTRACT

Introduction. Lactobacillus gasseri is a lactic bacteria of the digestive tract which hasprobiotic properties important for the control of pathogenic organisms, and Staphylococcusaureus is an important pathogenic strain in the food industry, due to the healthproblems in several countries. Objective. Evaluate the features probiotic of L. gasseri onS. aureus in conditions in vitro. Materials and methods. We evaluated the susceptibilityof two different antibiotic resistant strains; the effect of inhibition of L. gasseri and itssupernatant on S. aureus; growth of the strain lactic to different pH, temperatures, salts bile and bile bovine; the kinetics of fermentation was also established and she foundcount of viable microorganism in plate, pH, sugar consumption, consumption of proteinand percentage of lactic acid; and using HPLC-DAD determined peptides and lacticacid, and in the case of amino acids in the supernatant was determined by HPLC-PDA. Results. Found both strains resistant to antibiotics penicillin, dicloxacillin, cifoxitin andcefalexin. The strain of lactic and supernatant inhibited the growth of S. aureus. Thegrowth was suitable for the different variables with values between 1.5 x 108 to 3.0 x1014 UFC / 150 μl. The exponential phase was observed at 9:00 with values of 33.33Ln UFC/150 μl. Finally were identified using HPLC-DAD VA L-TIR-VA L peptide,11.70 g/l of lactic acid and the amino acid tyrosine. Conclusion. The results show thatL. gasseri has probiotic properties over S. aureus in conditions in vitro.

Keywords: Lactic bacteria, inhibition, pathogenic, probiotic strain.

INTRODUCCIÓN

Las bacterias ácido lácticas (BAL) previenen problemas digestivos en el organismo huésped ya que inhiben, y de esta manera controlan, el crecimiento de microorganismos patógenos, los cuales generalmente son bacterias Gram Negativas (Belkacem-Hanfi et al. 2014). Las BAL han adquirido diversos mecanismos para mejorar la competitividad con otras bacterias (López et al. 2008); de esta manera, Lactobacillus gasseri es una BAL homofermentadora, la cual se cree que es autóctona del tracto gastrointestinal y por consiguiente muestra múltiples funciones probióticas (Selle y Klaenhammer 2013).

Por otra parte, Staphylococcus aureus es un microorganismo anaerobio facultativo. Algunas características de los estafilococos explican su patogenicidad, que puede asumir varias formas. Crecen relativamente bien en condiciones de presión osmótica elevada y humedad reducida, lo que explica en parte que puedan desarrollarse y sobrevivir en las secreciones nasales y en la piel, y en alimentos poco húmedos. Es probable que el pigmento amarillo que posee le confiera cierta protección ante los efectos antimicrobianos de la luz solar. S. aureus produce varias toxinas que contribuyen a su patogenicidad aumentando su capacidad de invadir el cuerpo o dañar los tejidos. Entre estas encontramos el síndrome del shock toxico, una infección grave caracterizada por fiebre elevada y vómitos que en ocasiones puede provocar la muerte; de igual manera, produce una enterotoxina que al ser ingerida genera náuseas y vómitos, y es una de las causas más comunes de intoxicación alimentaria (Tortora et al. 2007; Nawrotek et al. 2005). El objetivo de este estudio fue determinar el efecto in vitro de L. gasseri sobre S. aureus.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en los laboratorios de microbiología del grupo de investigación Fise-Probiotec y en los laboratorios especializados de la Universidad de Nariño. Se utilizó Lactobacillus gasseri ATCC® 19992 y Staphylococcus aureus ATCC® 13245. La reconstitución de cada cepa se efectuó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y su conservación se realizó mediante repique en medio sólido y líquido cada 5 y 8 días.

La obtención del inóculo se realizó de acuerdo a lo descrito por Jurado-Gámez et al. (2015b). Se evaluó la susceptibilidad de L. gasseri y S. aureus a los antibióticos penicilina, cefalotina, ciprofloxacina, gentamicina, dicloxacilina, ampicilina, cefalexime, cefatoxina, cefoxitin, trimetropim-sulfametoxasol y usando el método de Kirby-Bauer modificado (Bauer et al. 1966; Jurado-Gámez et al. 2015a).

Se determinó la inhibición de L. gasseri sobre S. aureus mediante la metodología de Tagg y McGiven (1971) ajustada y descrita por Jurado-Gámez et al. (2014). Sin embargo, para la presente investigación las concentraciones de la bacteria láctica fueron de 50, 100 y 150 pl. De igual manera, se determinó el efecto del sobrenadante de L. gasseri sobre el crecimiento de S. aureus bajo la misma metodología (Estrada et al. 2005; Jurado-Gámez et al. 2014).

Se evaluó el crecimiento de L. gasseri a concentraciones de 0,5, 1 y 3% de sales biliares bovinas, y 0,5, 1 y 3% de bilis bovina (Cai et al. 1998, Cai et al. 1999; Jurado-Gámez et al. 2014). Se determinó producción de gas por la metodología de Dahl et al. (1989), y la reacción de catalasa mediante la metodología de Cai et al. (1998). Se determinó el crecimiento de la cepa láctica a pH de 2,5, 3,5 y 6 durante 3 horas, con mediciones cada hora; la incubación se realizó en medio MRS comercial a 37°C durante 48 horas y el ajuste del pH se realizó con ácido tartárico. Se evaluó el crecimiento de L. gasseri a 38 y 45°C; para ello, primero se determinó el tiempo necesario para obtener la fase exponencial de crecimiento en la cepa láctica; con esta información se realizó una nueva inoculación, la cual se ajustó a 0,125 en escala de McFarland y se incubó hasta las 9:00 horas (fase exponencial). Enseguida se realizaron diluciones de 10^-1 a 10^-12 con agua peptonada, se sembraron en cajas de petri con azul de anilina y se inició la dilución de 10^-8 hasta 10^-12 a 37°C por 48 horas, para finalmente determinar el recuento de UFC/ml.

Los parámetros cinéticos de L. gasseri se evaluaron en medio MRS comercial. Se tomó un Erlenmeyer con 540 ml de medio y se adicionó 60 ml de inóculo de L. gasseri, el preparado se incubó a 37°C por 24 horas con agitación constante a 100 rpm. No se controló el pH por la resistencia de la cepa a bajos niveles de acidez. Se tomaron muestras y mediciones cada 3 horas para determinar conteo de microorganismos viables en placa (UFC/ml), azúcar consumida, proteína consumida y ácido láctico.

Para determinar el conteo de microorganismos viables en placa se usó la metodología de Lanara (1981) descrita por Jurado-Gámez et al. (2014). Para determinar el pH se utilizó potenciómetro digital (Jenco® VisionPlus). La determinación del consumo de azúcar se realizó por la metodología de DuBois et al. (1956). El consumo de proteína fue determinado por la metodología de Lowry et al. (1951) modificada por Jurado-Gámez et al. (2014). La determinación de producción de ácido láctico se realizó por titulación de hidróxidos de sodio (Jurado-Gámez et al. 2015a). La biomasa se determinó a través del método propuesto por Crueger y Crueger (1993).

Se tomó una muestra de sobrenadante de L. gasseri y por HPLC-DAD se determinó el contenido de péptidos y ácido láctico. Para el caso de los aminoácidos se determinó por HPLC-PDA; este último análisis también se realizó para S. aureus.

RESULTADOS

Los resultados de sensibilidad a los antibióticos se observan en la Tabla 1 y la Figura 1.

Los resultados in vitro de la cepa láctica sobre la bacteria patógena mostró halos de 10, 12 y 5 mm para concentraciones de 50, 100 y 150 pl. Los resultados de inhibición del sobrenadante de L. gasseri sobre S. aureus se pueden observar en la Tabla 2.

Se observaron crecimientos de 2,4 x 10⁸, 1,3 x 10¹⁰ y 1,5 x 10¹⁰ UFC/150 pl a concentraciones de 0,5, 1 y 3% de sales biliares; y 6.6 x10⁹, 2.0 x 10⁸ y 2.0 x 10¹¹ UFC/150 pl a concentraciones de 0,5, 1 y 3% de bilis bovina. Los resultados de producción de gas y reacción de catalasa fueron negativos. De igual (2,5, 3,5 y 6) y valores mínimos de 2,4 x manera, se encontraron crecimientos de 10⁸ y máximos de 3,0 x 10¹⁴ UFC/150pl 3x1o¹¹ UFC/150 pl para todos los pH a temperaturas de 38 y 45°C.

Los resultados para la cinética de fermentación de L. gasseri se pueden observar en la Figura 2. Se encontró la fase exponencial en el tiempo 4 (9:00 horas), con valores de 4,27, 1,16%, 2.15 mg/l y 0,73 mg/l para pH, ácido láctico, consumo de azúcar y consumo de proteína, respectivamente. La información general de la cinética de fermentación se puede observarse en la Tabla 3.

De acuerdo con la Figura 3 se puede observar que el aminoácido que predomina porcentualmente en las muestras y que las relaciona, fue tirosina con 32,3% para L. gasseri y 41,0% para S. aureus, por su parte, en L. gasseri el segundo aminoácido predominante fue serina, con una cantidad relativa porcentual de 8,4%, por su parte S. aureus presentó un segundo aminoácido arginina, cuya cantidad relativa porcentual fue de 5,2%.

Los resultados para HPLC-DAD de L. gasseri encontraron el péptido VAL-TIR-VAL con una concentración de 0,70 mg/ml; 11,70 g/l de ácido láctico y el aminoácido tirosina; en S. aureus se halló el aminoácido tirosina.

DISCUSIÓN

Los resultados frente a los antibióticos muestran la importancia del manejo adecuado de estos en el control de los microorganismos patógenos. Al respecto Charteris et al. (1998) y Coppola et al. (2005) indican que estas bacterias parecen ser resistentes a la mayoría de los inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos, tales como enoxacina, pefloxacina, norfloxacino, ácido nalidíxico, trimetroprim y metronidazol, coincidiendo con los resultados encontrados en este trabajo. En este sentido, la susceptibilidad reportada muestra que L. gasseri, es una cepa potencialmente segura. Para el caso de S. aureus, Cavelieri et al. (2005) reportan resultados similares en cuanto susceptibilidad a la gentamicina, a pesar de que este antibiótico no es reportado en forma rutinaria porque los aminoglucósidos no se consideran agentes de primera línea contra estafilococos; igualmente lo anterior se observa en el antibiótico trimetoprim-sulfametoxasol. Lo anterior demuestra que el manejo de las cepas patógenas es vital para no crear resistencia a los antibióticos utilizados (Torres et al. 2012). Sin embargo, se debe tener en cuenta que algunas resistencias no son transmisibles y que para su determinación se debe realizar otro tipo de pruebas que no fueron realizadas en esta investigación.

Los resultados de inhibición muestran un efecto sólido de la BAL. Ello indica que existe una importante producción de sustancias inhibitorias, entre las que se encuentran la producción de ácidos orgánicos, peróxidos de hidrógeno y bacteriocinas, entre otras. Ello permite la creación de un ambiente poco favorable para el crecimiento de la bacteria patógena beneficiando la colonización de la cepa láctica (Fernández 2013).

El crecimiento bajo las diferentes condiciones de sales biliares, bilis bovina, pH y temperatura demuestran que la cepa L. gasseri está en condiciones para resistir a muchos de los ambientes presentes en el tracto digestivo de animales; lo cual es importante para considerar esta cepa como probiótica. Este atributo garantiza la colonización de diferentes regiones del tracto gastrointestinal donde expresa sus capacidades de inhibición contra otros microorganismos (Yanagibashi et al. 2009; Harata et al. 2009).

Los valores de la cinética de fermentación corroboran algunos de los aspectos encontrados en la inhibición de la cepa, ya que las condiciones de crecimiento en el medio MRS fueron adecuadas, el uso de los nutrientes le permitió este crecimiento y, al parecer, generó compuestos necesarios para la inhibición de la bacteria patógena como bacteriocinas, reducción del pH y producción de ácidos orgánicos (Orozco-Murillo y Solarte 2003).

Los resultados de HPLC-DAD muestran una adecuada concentración de ácido láctico (Waldir et al. 2007); en este sentido, el péptido encontrado es posible esté relacionado con las bacteriocinas de L. gasseri, ligada a gassericin A; en este mismo contexto, los aminoácidos encontrados, siguen el mismo fundamento.

Se concluye que los ensayos de inhibición in vitro demostraron que L. gasseri pueden inhibir a S. aureus por acción de las bacterias y de su sobrenadante. Además demostró permanecer estable en diferentes condiciones gastrointestinales in vitro, por lo que puede ser propuesta para su evaluación in vivo debido a la capacidad de resistir múltiples condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, así como también por su habilidad de crecer en ambientes difíciles. De esta manera, partiendo que S.aureus en uno de los principales causales de la mastitis subclínica que afecta a las producciones, es fundamental el resultado significativo de inhibición que tuvo L. gasseri sobre este patógeno, finalmente, este hecho representa un factor importante sobre el control de microorganismos patógenos responsables de toxiinfecciones alimentarias, por lo que la aplicación de las BAL es un pun importante en la industria alimentaria.

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