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INTRODUCCIÓN
En el año 2019 Colombia acopió poco más de tres millones de litros de leche, de los cuales Boyacá produjo 231.275 litros, lo cual corresponde al 7.3% del total nacional (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural 2020). En el país, la leche es principalmente almacenada en tanques de enfriamiento hasta su posterior transporte a través de camiones recolectores que las dirigen hasta las plantas procesadoras o transformadoras (Tarazona et al. 2019). Estos procesos de manipulación pueden generar contaminaciones de la leche con diversos microorganismos como bacterias y hongos, que podrían llegar a generar subproductos tóxicos provenientes de su metabolismo y constituirse como un problema de salud pública (Hajmohammadi et al. 2020).
Otras fuentes de contaminación de la leche con subproductos tóxicos provenientes de hongos, específicamente aquellos producidos por Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius, A.bombycis, A. ochraceoroseus y A. pseudotamari (Nemati et al. 2010), se originan a partir de la contaminación de los alimentos suministrados al ganado en épocas en donde las pasturas se ven altamente afectadas por procesos de sequía, y por tanto los granjeros deben recurrir a alimentos fermentados, balanceados comerciales, pastos y henos, que si no son preparados o almacenados adecuadamente (altas temperaturas, húmedad, composición del sustrato, tiempo de almacenamiento, sitio de almacenamiento y condiciones de almacenamiento) permiten el crecimiento de los mohos y la producción de aflatoxinas, producto de su metabolismo (Battacone et al. 2012; Giovati et al. 2015; Iqbal et al. 2015; Oliveira et al. 2014).
Las aflatoxinas son un grupo de compuestos heterocíclicos y se dividen principalmente en aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2) (De roma et al. 2017; Temamogullari y Kanici, 2014). El consumo de este tipo de toxinas genera en el animal alteraciones de tipo productivo como la reducción en hasta un 25% en la producción de leche y disminución en la ganancia de peso, y alteraciones de tipo reproductivo como disminución en la tasa de concepción, entre otras (Iqbal et al. 2015).
El subproducto tóxico encontrado en la leche derivado de la AFB1 se conoce como aflatoxina M1 (AMF1), y es resultado de la metabolización de la AFB1 a nivel hepático a través de la citocromo p450 (Goncalves et al. 2017; Temamogullari y Kanici, 2014; Zinedine et al. 2007) y se ha demostrado que el rango de transmisión hacia la leche es de entre 1 y 6,2% del total de AFB1 consumido por el animal, porcentaje que depende de factores como la genética, la variación climática, el proceso de ordeño y condiciones medioambientales; sin embargo, en términos generales aparece entre 12 y 24 horas desde el consumo de la AFB1 y puede mantenerse hasta 72 horas (De roma et al. 2017; Fernandes et al. 2012; Skrbic et al. 2014).
Al igual que su predecesor, la AFM1 está clasificada por la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (IARC) en el grupo 1 de agentes carcinogénicos para el ser humano y los animales (IARC, 2002). Además de ello, es una toxina estable frente a procesos térmicos como la ultrapasteurización o la pasteurización y a procesos de transformación como la producción de quesos o yogurt, que aun cuando reducen la cantidad de toxina presente, no la eliminan por completo (Fernandes et al. 2012; Iha et al. 2013; Temamogullari y Kanici 2014).
Considerando los riesgos que representa para la salud humana la presencia de esta toxina en productos como la leche, se ha determinado a nivel mundial diversos límites de tolerancia para su presencia en la leche. En Colombia, la normativa nacional a través de la resolución 4506 del 2013 del ministerio de salud y la protección social, fija el límite máximo para la presencia de este contaminante en 0,5 μg/kg (MSPS 2013). No obstante, hasta la fecha solo se han realizado dos estudios que determinaron la presencia de este contaminante en el país, el primero de ellos, evaluó quesos frescos en el departamento de Casanare (Aranguren y Arguelles 2009) y el segundo, evaluó leche fresca del departamento del Valle del Cauca (Cómbita y Mildenberg 2009); sin embargo, no se ha realizado ningún estudio en muestras de tanques de enfriamiento durante diversos meses abarcando múltiples municipios de un departamento.
Por ello, el objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de AFM1 durante un año en tanques de enfriamiento de leche cruda en cuatro municipios distintos del departamento de Boyacá (Colombia), determinando las diferencias entre temporadas climáticas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo y sitio de estudio
Se realizó un estudio de corte longitudinal, de tipo descriptivo cuantitativo, con muestreo por conveniencia. Se seleccionaron aleatoriamente cuatro municipios del denominado "cordón lechero boyacense" (Tarazona et al. 2019) los cuales fueron: Paipa (Latitud: 5.77894, Longitud: -73.1185 5° 46' 44" Norte, 73° 7' 7" Oeste), Duitama (Latitud: 5.817, Longitud: -73.033 5° 49' 1" Norte, 73° 1' 59" Oeste), Sogamoso (Latitud: 5.717, Longitud: -72.917 5° 43' 1" Norte, 72° 55' 1" Oeste) y San Miguel de Sema (Latitud: 5.517, Longitud: -73.817 5° 31' 1" Norte, 73° 49' 1" Oeste); de cada uno de ellos se seleccionaron cuatro tanques de enfriamiento ubicados en diversos sitios de cada municipio, cada tanque de enfriamiento con una capacidad de 1000 litros, los cuales mantenían la leche a una temperatura entre 4 y 6°C.
Toma de muestras
La recolección de las muestras se realizó durante el período comprendido entre los meses de enero y diciembre del año 2019. Las muestras se tomaron cada quince días de cada uno de los tanques de enfriamiento ubicado en cada uno de los cuatro municipios incluidos en el estudio, en horas de la mañana luego de que el tanque estuviese completamente lleno (Tarazona et al. 2019). De cada tanque se tomó una muestra de 1000 ml directamente del sistema de salida en recipientes plásticos previamente esterilizados (De roma et al. 2017) posteriormente transportada en frío, sin aditivos, a una temperatura igual a la que se mantiene en los tanques (4-6 °C) hasta su arribo al Laboratorio de Análisis de la Calidad de Leche y Control de Mastitis de la Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia en Tunja, Boyacá. Se tomaron 96 muestras por cada uno de los trimestres, para un total de 384 muestras a lo largo de todo el estudio.
Detección de aflatoxina M1
Las muestras fueron procesadas el mismo día de su recolección; para ello, se utilizó un equipo Charm Ez Lite de la compañía analítica Charm Sciences Inc. (EE.UU), a través de la metodología analítica ROSA (Rapid One Step Assay) por sus siglas en inglés. El equipo detecta la AFM1 a partir de 0,5 μg/kg de leche y cuenta con una especificidad del 96% (Villar et al. 2012).
Se siguieron las instrucciones del fabricante, para lo cual, el primer paso fue el calentamiento del equipo a una temperatura de 56°C durante un minuto, posterior a ello, se introdujeron dos tiras estandarizadas por el fabricante para la activación de la detección de AFM1, una como control positivo y la otra como control negativo, con el fin de que el instrumento realizara la detección de la toxina a partir de las muestras inoculadas con la leche evaluada en tiras individuales. Luego de la estandarización, se introdujo una tira posteriormente inoculada con la leche de muestra. La muestra de leche fue homogeneizada través de 25 movimientos manuales en forma de arco durante siete segundos, luego, con una pipeta de 300 μl se tomó una submuestra, teniendo cuidado de no generar burbujas en su interior, y por último, se inoculó la cantidad total tomada en la pipeta en la tira que se encontraba en el equipo, posteriormente se cerró la tapa y se dejó incubar durante 8 minutos.
Determinación de los trimestres
Los trimestres fueron seleccionados de acuerdo con los datos del Instituto Colombiano de Meteorología, Hidrología y Estudios ambientales (IDEAM), quien separa las temporadas climatológicas del país en verano e invierno, cada una con dos periodos durante el año: 1) verano: la cual comprende el primer trimestre de enero a marzo, y un segundo de octubre a diciembre; e 2) invierno: el cual comprende el primer trimestre de abril a junio, y el segundo desde julio hasta septiembre. La principal diferencia entre esos dos periodos es la intensidad de las lluvias (IDEAM 2020).
Análisis estadístico
Las muestras de leche fueron agrupadas de acuerdo con los trimestres previamente descritos, se determinaron los valores mínimos y máximos, así como la media y la desviación estándar para las concentraciones de la AFM1 de acuerdo con cada trimestre; además, se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) entre cada una de las medias para los trimestres evaluados, con el fin de determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre la concentración de la AFM1 de acuerdo a la temporada climática, determinando un nivel de confianza requerida para la significancia de p < 0,05 con el programa estadístico Statgraphics® centurión versión Windows 10 (EE.UU) (Xiong et al. 2013).
TABLA 1 Detección de aflatoxina M1 en muestras de leche cruda de tanques de enfriamiento en diferentes temporadas en el departamento de Boyacá.
| Temporada | Positivos* % (n) " | Concentración de AFM1 (ug/kg) | ||
|---|---|---|---|---|
| Mínimo | Máximo | Promedio ± DS | ||
| Verano 1 | 32,40 (35) | 0,6 | 1,8 | 1,12 ± 0,38b |
| Invierno 1 | 14,81 (16) | 0,5 | 0,9 | 0,70 ± 0,15a |
| Invierno 2 | 11,11 (12) | 0,5 | 1,1 | 0,88 ± 0,22a |
| Verano 2 | 41,66 (45) | 0,7 | 2,0 | 1,47 ± 0,39c |
| Total | 28,12(108) | 0,5 | 2,0 | 1,18 ± 0,44 |
* Las muestras positivas son aquellas en las que las concentraciones de la AFM1 en la leche cruda excede el límite de cuantificación del equipo de 0,5μl/l. Los valores entre paréntesis corresponden al número de casos (n) encontrados positivos por temporada, y el porcentaje de cada trimestre se entiende tomando como 100% los 108 casos positivos. Las letras en superíndices indican la pertenencia a un mismo grupo estadístico, aquellos valores con letras distintas corresponden a grupos estadísticamente diferentes con un nivel de confianza del 95%.
RESULTADOS
Se determinaron 108 muestras positivas totales durante los 12 meses del estudio, lo cual corresponde al 28,12% del total de las muestras tomadas durante la investigación. El 74,06% de las muestras positivas se detectaron en los trimestres de verano. Así mismo, se determinaron diferencias estadísticamente significativas para el promedio de la concentración de AFM1 entre los trimestres de verano e inverno, los mayores valores fueron detectados en los trimestres de verano llegando hasta 2,0 μg/ kg de leche (Tabla 1). Por otro lado, las menores concentraciones se detectaron en los trimestres de invierno sin diferencias estadísticas entre estos dos trimestres. Así mismo, el mayor porcentaje de casos se determinó en el verano (Tabla 1).
Los municipios que presentaron la mayor cantidad de casos positivos durante todo el año, principalmente en los trimestres de verano y en el segundo trimestre de invierno fueron: Paipa y San Miguel de Sema. Contrario a esto, en el primer trimestre de invierno los municipios con mayor número de casos positivos fueron Duitama y Sogamoso (Figura 1).
DISCUSIÓN
Según la normativa colombiana, dictada por la resolución 4506 de 2013 del Ministerio de Salud y Protección Social, el nivel máximo de la concentración de AFM1 en leche debe ser de 0,5 μg/kg, los resultados positivos obtenidos en este estudio incumplirían este precepto, debido a que todas las muestras positivas tenían concentraciones superiores al valor de referencia de la norma. De igual forma, la leche no cumplió con la normativa de los Estados Unidos, ni con la de la Unión Europea debido a que el valor máximo determinado en estas dos normativas es de 0,05 μg/kg (Barahona 2012).
En Latinoamérica se han realizado diversos estudios para la detección de esta toxina en leche destinada al consumo humano. Al respecto, en Brasil Picinin et al. (2013) evidenciaron un comportamiento de la concentración de AFM1 similar al reportado en este estudio, en donde el periodo de verano o período seco se determinó la mayor concentración de la aflatoxina, con un valor de 0,0359 μg/ kg, mientras que los menores valores se determinaron, al igual que en el presente estudio, para la temporada de lluvias con un valor de 0,0055 μg/kg. Por su parte, Fernandes et al. (2010), en su estudio desarrollado en el estado de São Paulo, detectaron la toxina en el 36,7% de las muestras de leche evaluadas, resultado superior al reportado en la presente investigación. Además, la concentración de la toxina osciló entre 0,010 a 0,645 μg/kg, rango inferior a los determinados en esta investigación.
En Guatemala, Barahona (2012) determinó que el 65% de la leche fresca colectada en la ciudad de Chiquimula fue positiva a la AFM1, resultado superior al determinado en este estudio. Por otro lado, en México Gutiérrez et al. (2013) determinaron que el 23,3% de las muestras de leche evaluadas no cumplía con la normativa mexicana, cuyo valor máximo para la concentración de la AFM1 es igual al colombiano. Además, demostraron que la concentración de la toxina era mayor en los meses de época seca con una concentración promedio de 3,53± 0,55 μg/ kg mientras que en la época de lluvias este valor fue de 0,17 ± 0,13 μg/kg. Estos resultados son similares a los reportados en el presente estudio y corroboran lo que se determinó con respecto al comportamiento de la concentración de la toxina en la leche para la temporada seca.
Por su parte, Capelli et al. (2019) determinaron en Uruguay que el 100% de las muestras (18, cada una en una granja productora distinta) presentaron contaminación con la AFM1 con 0,005 a 0,08 μg/kg, valores inferiores a lo que dicta la normativa uruguaya y colombiana de 0,5 μg/kg como valor máximo. Así mismo, estos resultados son inferiores a lo reportado en este estudio para cualquiera trimestre.
Algunos investigadores han asociado incluso una mayor concentración de la AFM1 con una mayor concentración de solidos no grasos en la leche, debido a la capacidad de unión que tiene la toxina con las proteínas de la leche (Granados 2016; Hajmohammadi et al. 2020).
En un estudio colombiano que evaluó leche fresca se determinó que el 20% de las muestras analizadas mostraron valores superiores (0,5-0,72 μg/kg) al valor de referencia de la normatividad nacional de 0,5 μg/kg (Cómbita y Mildenberg 2009), éstos resultados son similares a los reportados en este estudio para los trimestres de invierno, pero menores a los reportados en los trimestres de verano.
Por otro lado, estudios en Irán (Hajmohammadi et al. 2020; Nemati et al. 2010) mostraron la presencia de la AFM1 hasta en el 100% de las muestras evaluadas, resultados muy superiores a lo determinado en esta investigación en donde el porcentaje total de muestras contaminadas fue de 28,12%. Tal porcentaje pudo verse principalmente afectado por el método de análisis usado en dichos estudios (ELISA) ya que el límite mínimo para determinar la toxina en esa prueba es de 5 nanogramos/l (ng) (0,005 μg/kg), lo cual permite un mayor rango de detección, comparado con el instrumento usado en el presente trabajo cuyo valor mínimo es 0,5 μg/kg. La concentración máxima de la toxina en el estudio de Hajmohammadi et al. (2020) fue de 0,24 μg/kg (240 μg), mientras que en el de Nemati et al. (2010) la concentración máxima fue de 0,085 μg/kg, valores mucho menores comparados con el detectado en este estudio de 2 μg/kg. Adicionalmente, el límite máximo fijado en la norma Iraní para la AFM1 es de 50 ng/l, valor superado en el primer estudio por el 40% del total de las muestras y en el 33% de las muestras del segundo. Por otro lado, en este estudio el 100% de los casos positivos superaron la normativa nacional.
Otros estudios también de Irán muestran una concentración de esta toxina en valores que oscilan entre 10-410 ng/l (0,01- 0,41 μg/kg) (Ghiasian et al. 2007), y 12-198 ng/l (0,012- 0,198 μg/kg) (Fallah et al. 2016). En Serbia se detectó una concentración de 300 ng/l (0,3 μg/kg) (Skrbic et al. 2014), valor inferior a lo reportado en este estudio (2 μg/kg). De otra parte, en un estudio en Pakistán (Yunus et al. 2019) se determinó una concentración de AFM1 de 939 ng/l (0,9 μl/l), valor similar a lo reportado en este estudio para todos los trimestres evaluados. En Pakistán el 76,3% de las muestras evaluadas en 36 distritos diferentes productores de leche fueron positivos a la presencia de AFM1 (Sadia et al. 2012), valor superior a lo reportado en este estudio por casi el 50%.
En su estudio, Daou et al. 2019 determinaron para leche cruda de tanques de enfriamiento una concentración de AFM1 que osciló entre 0,011-0,440 μg/kg en el 58,8% de las muestras tomadas (701 muestras), valores que son menores a los reportados en este estudio con respecto a la concentración, pero la presencia de la toxina fue mayor en dicho estudio.
Debido a las condiciones tropicales de Colombia las comparaciones con las variaciones climatológicas realizadas en otros países a nivel mundial generalmente tienden a variar, sobre todo en aquellos en donde existen las cuatro estaciones; sin embargo, las decisiones zootécnicas de alimentación con productos fermentados derivados principalmente del maíz, la soya, avena y otros granos, así como de alimentos balanceados comerciales y henolajes, en las temporadas en donde la disponibilidad de las pasturas está disminuida y su calidad decrece considerablemente, es similar. Para el caso colombiano, estas temporadas corresponden a los trimestres de verano, en donde se detectaron no solo el mayor número de casos de positividad, sino también la mayor concentración de la AFM1 en muestras de leche cruda.
Tomasevic et al. (2015) reportaron variaciones en la concentración de la AFM1 en Serbia a lo largo de dos años de estudio en un total de 678 muestras de leche cruda, determinando en ese caso un aumento de casos durante el invierno además de las mayores concentraciones, asociándolo a los cambios a nivel de alimentación de los animales, sobre todo de la calidad debida al almacenamiento de las materias primas utilizadas para la fabricación de los alimentos fermentados.
De igual manera, en Marruecos El Marsini et al. (2012) determinaron variaciones en la AFM1 debido a la temporada, encontrándola en mayor frecuencia y en concentraciones superiores en los meses de invierno. Estos resultados están en concordancia con lo reportado por (Ismaiel et al. 2020), en donde se determinaron variaciones en la concentración de AFM1 en muestras de leche cruda en Egipto a lo largo de dos años de estudio (2016 y 2017), determinando las mayores concentraciones de la toxina en el otoño; además, en el 2016 determinaron un porcentaje de positividad total de muestras del 21,6%, mientras que para el 2017 este porcentaje fue de 18,3%, resultados que son similares, pero inferiores a lo reportado en este estudio.
Debido a la estabilidad química de la toxina ésta puede estar presente en subproductos lácteos, como leches sometidas a tratamientos térmicos e incluso en quesos. En lo concerniente a productos sometidos a procesos térmicos para su sanitación como las leches pasteurizadas y ultrapasteurizadas Dos Santos et al. (2015) determinaron que el 100% de las muestras evaluadas fueron positivas a la presencia de la AFM1 en un rango de 0,01 hasta 0,81 μg/kg. En Turquía Aydemir et al. (2010) determinaron que el porcentaje de muestras UHT positivas a la presencia de la micotoxina fue de 59%, por su parte, Daou et al. (2019) determinaron una posibilidad en el 90,9% de las muestras evaluadas. Estos resultados demuestran la importancia del monitoreo constante de la leche cruda almacenada y que será destinada a procesos de transformación para el consumo humano debido al riesgo latente que tiene en la salud pública.
CONCLUSIONES
Se evaluaron las concentraciones de AFM1 en muestras de leche cruda de tanques de enfriamiento en el departamento de Boyacá a lo largo de un año, determinando las mayores concentraciones y el mayor número de casos para los trimestres de verano, asociando estos a la alimentación de los animales con alimentos contaminados con mohos productores de micotoxinas. Todas las muestras de leche positivas superaron los valores máximos postulados por la normatividad nacional, por lo cual no serían aptas para el consumo humano. Debido a la estabilidad térmica de la toxina, estos estudios en campo deben realizarse de forma rutinaria para evaluar procesos de alimentación de los animales y disminuir el riesgo en salud pública que representa la presencia de la toxina en leches destinadas a consumo humano.
