2 Instituto Colombiano de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Instituto de Ciencias de la Salud, CES, Medellín, Colombia.

Institución donde se llevó a cabo el trabajo: Instituto Colombiano de Medicina Tropical.

El diagnóstico de fiebre entérica por Salmonella spp. se basa en el aislamiento de la bacteria en hemocultivos el cual consume tiempo, no siempre está disponible y tiene poca utilidad en pacientes con tratamiento antibiótico previo. Por consiguiente, se hace necesario el desarrollo de una prueba rápida, sensible y específica para el diagnóstico de fiebre entérica. Salmonella spp. utiliza el gen hilA (componente de la isla de patogenicidad I) para invadir células epiteliales y producir infección. Al usar la secuencia de este gen se diseñó una prueba de PCR para detectar la bacteria en sangre y se evaluó su sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo, utilizando la metodología prueba de una prueba. La prueba de oro fue el hemocultivo. Se estudiaron 34 individuos con sintomatología de fiebre entérica con aislamiento de Salmonella serotipo Typhi en hemocultivos; 35 individuos con sepsis por otros bacilos Gram negativos aislados de hemocultivo ( Klebsiella pneumoniae, 9; Serratia marcescens, 5; Escherichia coli, 4; Pseudomonas aeruginosa, 9; Providencia alcalifaciens, 4, y Enterobacter cloacae, 4) y 150 muestras de sangre de voluntarios asintomáticos. La sensibilidad, especificidad, valor pronóstico positivo y valor pronóstico negativo de la PCR fue del 100%. El número mínimo de UFC/ml que la PCR detecta en sangre es de 10.

Palabras clave: PCR, fiebre entérica, gen hilA, Salmonella spp.

Typically, diagnosis of enteric fever due to Salmonella spp. is by bacterial isolation from blood culture; however, the blood culture method is slow, not always available, and not informative in patients with antibiotic treatment. Salmonella spp. uses the hilA gene (component of the pathogenicity island I) to invade epithelial cells and produce infection. Using the hilA gene sequence a PCR test was designed to detect Salmonella in blood samples. The sensitivity (S), specificity (SP), positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the PCR method were obtained by testing the blood samples from 34 patients with suspected of enteric fever. Presence of S. typhi was confirmed by blood culture. Blood samples were also tested from 35 patients with infections due to other non- Salmonella pathogens, again corroborated by blood culture ( Klebsiella pneumoniae, 9; Serratia marcescens, 5; Escherichia coli, 4; Pseudomonas aeruginosa, 9; Providencia alcalifaciens, 4; Enterobacter cloacae, 4). Control samples were obtained from 150 healthy volunteers. The S, SP, PPV and NPV for the PCR method were all 100%. The lowest number of colony forming units/ml detected by PCR in blood samples was 10.

Key words: PCR, enteric fever, hilA gene, Salmonella spp.

La fiebre entérica por Salmonella serotipo Typhi, es un problema de salud pública en países en desarrollo. Globalmente, se reportan más de 21 millones de casos, con más de 700.000 muertes por año (1). En nuestro medio, no se conoce la magnitud del problema, pues el diagnóstico de la fiebre entérica no siempre se apoya en el aislamiento bacteriano; el diagnóstico es eminentemente clínico (2). Sin embargo, es de esperarse que por las características geográficas, económicas y socioculturales de nuestro país, su incidencia y prevalencia sean de consideración, comparables a las encontradas en otros países en desarrollo en los cuales la fiebre entérica permanece endémica.

Las características de crecimiento de Salmonella spp. puede demandar varios días de incubación e identificación. La detección bacteriana por el hemocultivo puede estar influenciada por el medio de cultivo empleado, el número de bacterias circulantes, el tiempo de evolución de la infección, el volumen de sangre inoculado, la respuesta inmune del hospedero y la característica intracelular de esta bacteria (3). Las diferentes técnicas han sido utilizadas para el diagnóstico de fiebre entérica, incluso las de aislamiento de la bacteria como hemocultivo y cultivo de médula ósea y pruebas indirectas que detectan anticuerpos contra antígenos de la bacteria como la prueba de Widal, pruebas inmunoenzimáticas ELISA, dot blot y contrainmunoelectroforesis (4-6).

El hemocultivo es positivo en la primera semana de la infección, pero su sensibilidad está restringida al bajo número de bacterias que pueden causar una enfermedad grave, el cual puede ser de 10 UFC/ml (3). Los hemocultivos pueden detectar entre 40% y 45% de los casos y aun si no se ha suministrado tratamiento antibiótico, la tasa de detección no es mayor del 70% (3).

Las técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) detectan directamente el ADN del patógeno, lo cual permite un diagnóstico temprano de la enfermedad, con alta sensibilidad y especificidad (7).

El gen hilA ( hiperinvasive locus) se encuentra ubicado en la isla de patogenicidad I de Salmonella spp., la cual se encarga de la regulación del sistema de secreción tipo III que está relacionado con el proceso de invasión de la bacteria a las células epiteliales no fagocíticas del intestino delgado que son la puerta de entrada al sistema reticuloendotelial, a la sangre y a la médula ósea (8).

El diagnóstico de fiebre entérica por Salmonella sppl. en nuestro medio mejoraría de manera sustancial al tener una prueba que detecte la bacteria en forma rápida, sensible y específica, mediante la amplificación del gen hilA directamente de muestras de sangre.

La muestra para probar la sensibilidad (S), la especificidad (E), el valor pronóstico positivo (VPP) y el valor pronóstico negativo (VPN) de la PCR se calculó teniendo como base la prevalencia de salmonelosis, la cual es de 0,01% para la región de Urabá (datos locales del Hospital Antonio Roldán Betancur, Apartadó, Antioquia, 2000), con una confiabilidad del 90% y un error máximo de 0,05. Según el diseño muestral calculado para determinar S, E, VPP y VPN de la prueba (9,10), seleccionaron tres grupos de individuos, cada uno de ellos con características diferentes, a saber:

Grupo 1: muestras de sangre de 34 individuos de cualquier edad y sexo, con sintomatología de fiebre entérica y con aislamiento por hemocultivos de Salmonella serotipo Typhi.

Grupo 2: 35 individuos de cualquier edad y sexo con sepsis por otros bacilos Gram negativos aislados por hemocultivo ( Klebsiella pneumoniae, 9; Serratia marcescens, 5; Escherichia coli, 4; Pseudomonas aeruginosa, 9; Providencia alcalifaciens, 4, y Enterobacter cloacae, 4).

Grupo 3: 150 individuos voluntarios asintomáticos, de cualquier edad y sexo.

Todos los individuos del estudio firmaron un consentimiento informado que cumple con los lineamientos de la Resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia.

De cada individuo, en el momento de la admisión, se obtuvo una muestra de sangre en tubo con anticoagulante EDTA para realizar la PCR y se le tomó otra muestra para hemocultivo, de acuerdo con los métodos estándar (11).

Para determinar el número de UFC/ml que la PCR puede detectar en sangre, se contaminaron 10 muestras de sangre de voluntarios sanos con inóculos de concentración conocida.

Se inoculó una colonia de S. Typhi S008 de un cultivo en agar nutritivo incubado a 37°C por 12-18 horas en 1 ml de caldo infusión de cerebrocorazón BHI (Becton Dickinson); se incubó a 37°C por 2 horas y, luego, se diluyó 1:10 en solución salina al 0,85%. Se leyó la concentración de la dilución en espectrofotómetro a 640 nm (densidad óptica, DO: 0,08 a 1) la cual fue la base para reproducir inóculos de concentración similar. Se realizaron diluciones seriadas del inóculo desde 1:10 a 1:10-8; el número de UFC/ml de cada dilución se determinó sembrando 100 µl en agar nutritivo e incubando por 12-18 horas a 37°C para realizar el recuento. Se inocularon 5 ml de sangre fresca con 1 ml de la dilución correspondiente a 5-50 UFC/ml.

El método para la extracción del ADN en muestras de los pacientes y en las muestras contaminadas artificialmente fue el de solución tamponada de lisis descrito por Haque et al. (12) al que se le introdujeron las modificaciones que se describen a continuación. Brevemente, se realizó la extracción de ADN a 1 ml de la sangre artificialmente contaminada y a 1 ml de la muestra del paciente. Cada muestra se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente para separar el plasma y el medio de cultivo, respectivamente. Se adicionó al sedimento un ml de solución tampón de lisis (0,2% Triton X 100 en tris HCL más EDTA, pH 8,0). La mezcla se aspiró suavemente varias veces para efectuar hemólisis, se centrifugó a 12.000 rpm a temperatura ambiente por 6 minutos; se descartó el sobrenadante y el procedimiento se repitió nuevamente. El sedimento se lavó una vez con agua destilada estéril y se centrifugó a 12.000 rpm a temperatura ambiente durante 1 minuto. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 30 ml de agua destilada estéril; los tubos se sellaron, e pusieron en agua en ebullición por 20 minutos y se dejaron enfriar a emperatura ambiente antes de realizar la PCR.

Los iniciadores se diseñaron teniendo en cuenta la secuencia del gen hilA (www.genome.ad.jp). La secuencia de los iniciadores es la siguiente:

Iniciador US: 5´-GCATGGATCCCCGCCGGCGA GATTGTG-3´

Iniciador DS: 5´-CGGAACGTTATTTGCGCCATGCTGAGGTAG-3´

El producto de amplificación correspondiente al gen hil A es de 854 bp.

Para la PCR, se trabajó con una mezcla de amplificación de 50 ml de volumen total compuesta de 1,5 ml de cada iniciador a una concentración 20 mM, 10 ml de muestra de ADN, 3 µl de Taq polimerasa a una concentración de 0,5 U/µl (Promega Corp., Madison, WI, USA), 5 ml de solución tampón 10X (Promega), 6 ml de MgCl₂ a una concentración de 20 mM, 0,1ml de cada dinucleótido a una concentración de 20 mM y 22,6 ml de agua destilada para completar el volumen de reacción.

Se utilizó un termociclador PTC 100 (M.J. Research, Inc., Peltier-effect cycling) para amplificar el ADN sometiendo la muestra al protocolo de amplicación ya descrito (12): ciclo 1, desnaturalización inicial a 94°C por 5 minutos; ciclo 2, paso 1 a 94 °C por 1 minuto; ciclo 2, paso 2 a una temperatura de 65 °C por 1 minuto; ciclo 2, paso 3, a 72 °C por 1 minuto; el ciclo dos se repite 30 veces; ciclo 3, extensión final, a 72°C por 10 minutos, finalización a 4 °C. Cada muestra fue amplificada por duplicado. En cada PCR se corrió un control positivo y dos controles negativos, uno inicial y otro final que no incluían ADN.

En un gel de agarosa al 1%, se fraccionaron por electroforesis12 µl del producto de amplificación a 100 V por 2 horas, que contenían 10 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). En las muestras positivas para Salmonella serotipo Typhi se observó una banda correspondiente a 854 bp.

Grupo 1: de las 34 muestras positivas por cultivo para Salmonella serotipo Typhi, 34 fueron positivas para PCR.

Grupo 2: las 35 muestras contaminadas con otros bacilos Gram negativos fueron PCR negativas, no se observó ninguna banda, ni se presentaron reacciones inespecíficas.

Grupo 3: las 150 muestras provenientes de voluntarios sanos con hemocultivo negativo fueron PCR negativas. No se observó ninguna banda inespecífica.

Con base en estos datos, la PCR evaluada como prueba de diagnóstico, comparada con el hemocultivo (prueba de oro), mostró S, E, VPP y VPN del 100%, respectivamente. El número mínimo de UFC/ml que la PCR puede detectar fue de 10.