Andrés Augusto Arias ¹ , Mary C. Dinauer ² , Jiabin Ding ³ , Juan David Matute ¹ , Pablo Javier Patiño ¹

1 Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Corporación Biogénesis, Universidad de Antioquia, Medellín, Antioquia, Colombia.

Aunque dichas especies reactivas de oxígeno son importantes en la respuesta microbicida, cuando se generan en cantidades elevadas pueden producir daño en los tejidos del hospedero, lo cual ha llevado a establecer su participación en la patogénesis de enfermedades asociadas con inflamación crónica y aguda tales como la artritis reumatoidea (8), el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (9) y el choque séptico (10).

Por lo tanto, su producción debe estar altamente regulada para asegurar que se produzcan en el sitio adecuado y en el momento en que sean requeridos (1,5).

La forma más común de enfermedad granulomatosa crónica es la ligada al cromosoma X, que se presenta en ~65% de todos los casos y es causada por una mutación en el gen CYBB que codifica para la gp91 ^phox (17,18). Los casos restantes de enfermedad granulomatosa crónica se heredan de forma autosómica recesiva y son causadas por defectos en los genes CYA (p22 ^phox), NCF-1(p47 phox ) y NCF-2 (p67 ^phox ). La enfermedad granulomatosa crónica por deficiencia de p67 ^phox es una forma rara de la enfermedad y se presenta en 6%, aproximadamente, de los pacientes.

Hasta la fecha se han descrito aproximadamente quince mutaciones en el gen NCF-2 y todas ellas dan como resultado una ausencia total del producto proteico (19-23). De la misma manera, se han reportado varios candidatos para polimorfismos en el gen NCF-2 (24,25).

La p67 ^phox es una proteína levemente ácida (pI~6) con 526 aminoácidos y una masa de 60,9 kd, la cual está codificada por el gen NCF2 que está ubicado en el cromosoma 1q25; éste tiene una longitud de 40 kb y contiene 16 exones que generan un mARN de 2,4 kb (26). En esta proteína se han descrito diferentes tipos de dominios estructurales que tienen un papel importante para su función. En la región amino terminal posee cuatro dominios conocidos como repeticiones tetratricopeptídicas (TPR); tres de ellos se encuentran continuos y el cuarto se encuentra

separado de los tres primeros por una secuencia de 16 aminoácidos (27-32). Juntos, estos cuatro dominios hacen de la región amino terminal de p67 ^phox un dominio funcional (residuos 1-246) que permite la activación del sistema oxidasa en sistemas libres de células (33) y se une a la proteína Rac (28,29,31,32).

Una de las características más importantes de las proteínas citosólicas del sistema NADPH oxidasa es la presencia de los denominados dominios de homología 3 con Src (SH3) que se encuentran en una gran variedad de proteínas de señalización intracelular que se desplazan entre el citosol y la membrana o en complejos relacionados con el citoesqueleto (1,34,35). Los dominios SH3 se unen en forma no covalente a regiones ricas en prolinas que se encuentran ubicadas en las proteínas blanco. Tanto la p67 ^phox como la p47 ^phox contienen dos dominios SH3 y una región rica en prolinas; por su parte, la proteína p40 ^phox posee un dominio SH3 (36-38). La presencia de estos dominios en p67 ^phox le permite interactuar y formar complejos con p47 ^phox y p40 ^phox.

El papel exacto de p67 ^phox y las demás proteínas phox citosólicas es desconocido; sin embargo, es claro que p67 phox es absolutamente requerida para la generación del anión superóxido en células intactas y en sistemas libres de células.

En el presente trabajo se presenta una aproximación al estudio del sistema NADPH oxidasa basada en los hallazgos del análisis de tres mutaciones distintas que se habían identificado previamente en el gen de p67 ^phox de individuos sanos (25). Debido a que la enfermedad granulomatosa crónica por deficiencia de p67 phox es un rasgo autosómico recesivo y que dichos cambios se detectaron en individuos sanos heterocigóticos, no era posible saber si estos individuos eran portadores de mutaciones que alteraban la expresión de la p67 ^phox o simplemente correspondían a polimorfismos de dicha proteína.

Con el objetivo de determinar el efecto de estas mutaciones sobre el sistema NADPH oxidasa, se generaron mutaciones en el cADN de p67 ^phox y se expresaron en el sistema de células COS ^phox , un modelo recientemente desarrollado basado en células COS-7, originarias del riñón del mono verde africano (39). Las células COS91/22/47/67 (COS ^phox ) exhiben un alto nivel de actividad del sistema NADPH oxidasa cuando son activadas con acetato de forbol miristato ( phorbol myristate acetate, PMA) o ácido araquidónico, que son dos estimulantes solubles comúnmente usados para activar el sistema NADPH oxidasa de los neutrófilos. Estas células son fácilmente transfectables y expresan constitutivamente la proteína Rac1.

El cADN de p67 phox utilizado se encontraba clonado en el vector pVL1393 (Pharmingen, San Diego, CA) en los sitios XbaI y PstI. El diseño de los oligonucleótidos, el mapa de restricción y la secuencia de nucleótidos después de la reacción de obtención de secuencias se basó en la secuencia del ARNm de p67 phox publicada en el GenBank (Accession # NM_000433). El tamaño total del inserto era de 2,4 kb constituido por una secuencia de 1581 pb que codifica para p67 ^phox y una secuencia de 819 pb correspondiente a parte de la región 3' no traducida del ARNm.

La mutagénesis sitio dirigida para introducir mutaciones específicas en el gen de la proteína p67 ^phox se realizó con el producto comercial GeneEditor...in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega, Madison, WI). Las mutantes obtenidas a partir del cADN de p67 ^phox clonado en el vector pVL1393 fueron las siguientes: Sust G ₄₉₆ .A, Sust C ₉₈₅ .T y Sust C ₁₁₆₇ .A que generaron un cambio en los aminoácidos V166I, P329S y H389Q, respectivamente.

Subclonación de las diferentes mutantes de p67 ^phox en el vector pcADN3.1/zeo(+)

Los cADN de p67 ^phox tipo silvestre y mutantes obtenidos por mutagénesis sitio dirigida se subclonaron en el vector pcADN3.1/zeo(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando las enzimas de restricción BamHI y PstI (Promega). Para la subclonación se realizó una digestión parcial, ya que el cADN de p67 ^phox contiene un sitio de corte interno para BamHI en el nucleótido 966 corriente arriba del codón de iniciación. En cada uno de los plásmidos obtenidos se verificó la inserción correcta y la presencia del cADN de p67 ^phox por medio de una digestión con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Los nuevos vectores obtenidos se denominaron como pcADN-G ₄₉₆ .A, pcADN-C ₉₈₅ .T, pcADN-C ₁₁₆₇ .A y pcADN-67WT.

Con el fin de verificar la inserción correcta de los diferentes cADN de p67 ^phox clonados en el vector pcADN3.1/zeo(+), así como la presencia de las mutaciones generadas por mutagénesis sitio dirigida, se obtuvo la secuencia del cADN de p67 ^phox en un secuenciador ABI 310 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) con el estuche comercial BigDye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer Applied Biosystems), el oligonucleótido universal del promotor de T7 y un oligonucleótido en dirección sentido que forma híbridos con los nucleótidos 813 al 831 del cDNA de p67 ^phox .

Para expresar de manera transitoria las p67 ^phox normal y mutante se utilizó la línea celular COS91/ 22/47. Esta línea celular había sido transfectada previamente de manera estable con los cADN de gp91 ^phox , p22 ^phox y p47 ^phox clonados en los vectores pEF-PGKpac, pEF-PGKneo y pEF-PGKhygro, respectivamente (40-42). Estas células se cultivaron en medio DMEM/10% suero bovino fetal (SBF) (Hyclone, Logan, UT) con suplemento de 50 unidades/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina (Gibco BRLÒ Life Technologies), 0,2 mg/ml de higromicina (Invitrogen), 1,8 mg/ml de G418 y 1 µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Las células COS91/22/47 adherentes se recolectaron de los platos de cultivo por incubación con tripsina/EDTA (Gibco BRLO Life Technologies) durante 5 minutos a 37°C. La acción de la tripsina se neutralizó por la adición de DMEM/10% SBF. Posteriormente, las células se precipitaron por centrifugación a 1200 rpm a 4°C por 5 minutos; se lavaron en PBS frío en hielo, nuevamente se centrifugaron y rápidamente se resuspendieron en PBS a 4°C.

Con el fin de transfectar transitoriamente la línea celular COS91/22/47 con los vectores que contenían los cADN normal o mutantes de p67 ^phox se utilizó el reactivo Lipofectamine Plus (GibcoBRL). Se mezclaron 3 x 10 ⁶ células COS91/22/47 con 2 µg de los respectivos cADN clonados en pcADN3.1/zeo(+). Éstas se analizaron 21 horas después de la transfección como se menciona en los ensayos de Price et al. (41,42).

Para determinar la expresión de la p67 ^phox tanto normal como mutantes, se realizó una inmunodetección con un anticuerpo específico contra p67 ^phox . A partir de las células trans-fectadas, 1 x 10 ⁶ células se concentraron por centrifugación y, posteriormente, se resuspendieron en el tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Tritón X-100, 20 µg/ml de quimostatina, 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil, PMSF-, 1 mM de 4-(2- aminoetil) fluoruro de benzenosulfonilo, AEBSF-y 10 mM de leupeptina). La concentración de las proteínas totales en el lisado se cuantificó usando el ensayo de proteínas BSA (Pierce, Rockford, IL). Un total de 10 µg del lisado total se sometieron a electroforesis en gel SDS-PAGE 12% seguido por la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en TBS-T (tampón de tris salino, Tween-20 al 0,5%) con leche descremada baja en grasa al 6% durante 1 hora; luego, se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo policlonal de conejo contra p67 ^phox humana donado por David Lambeth (Emory University, Atlanta, GA) diluido 1:5.000 en TBS-T. Posteriormente, se adicionó un anticuerpo monoclonal anti-IgG de conejo producido en ratón, conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en 1:3.000 en TBS-T y se incubó por 1 hora; la reacción antígeno-anticuerpo se visualizó por medio de quimioluminiscencia ECL (Amershan, Arlington Heights, IL). La presencia de las bandas correspondientes a la p67 ^phox se evidenció en película radiográfica X-Omat (Eastman Kodak Co., Rochester, NY).

Para determinar la actividad funcional del sistema NADPH oxidasa en las células COS91/22/47 transfectadas transitoriamente con los vectores que contenían el cADN de p67 ^phox , se evaluó la producción de anión superóxido. Para esto se realizó un ensayo de cinética cuantitativa basada en la reducción del citocromo c, reacción que es inhibible por la superóxido dismutasa. El ensayo se realizó a 37°C con un lector de microplatos Thermomax (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA) como se ha descrito previamente (41,43).

Brevemente, 2,5 x 10 ⁵ células provenientes de cada una de las transfecciones se resuspendieron en 250 ul de PBSG (PBS más 0,5 mM de MgCl ₂ , 0,9 mM de CaCl ₂ y 7,5 mM de dextrosa) que contenía 75 µM de citocromo c. Las células se activaron por la adición de 100 µM de ácido araquidónico (AA). Por otro lado, una réplica de las muestras se incubó en paralelo con 250 unidades de superóxido dismutasa (SOD). La producción de anión superóxido se cuantificó usando el coeficiente de extinción de 21.1 mM -¹ cm -¹ para el citocromo C. El índice máximo de generación de anión superóxido por un intervalo de tres minutos se calculó con el programa Softmax, versión 2.0.

También se evaluó la actividad funcional del sistema NADPH oxidasa por medio de la técnica de NBT en placa. Para la detección de la reducción del azul de tetrazolio ( nitroblue tetrazolium, NBT) (Sigma-Aldrich) se procedió de la siguiente manera.

El NBT utilizado se obtuvo del sobrenadante de una solución saturada de NBT en PBSG (PBS más 0,9 mM de CaCl ₂ , 0,5 mM MgCl ₂ y 7,5 mM de glucosa). La mezcla para este ensayo contenía 20 µl de células COS91/22/47 transfectadas transitoriamente con los vectores que contenían el cADN de p67 phox tipo normal o mutantes a una concentración de 5 x 10 ⁶ células/ml, 60 µl de PBSG-NBT, más 0,4 µg/ml de PMA (Sigma - Aldrich) y se llevó a un volumen final de 300 ul con PBSG. Esta solución se dispensó en un sistema de láminas-cámara de 8 pozos (USA Scientific, Ocala, FL) y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se aspiró el sobrenadante y las células se dejaron secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Finalmente, las células se fijaron con metanol al 100% y se colorearon con safranina al 0,2% durante un minuto. La observación de las láminas y la determinación del porcentaje de células NBT positivas se realizó contando al azar 200 células, en las cuales se identificó la presencia de precipitados azul oscuro (formazán) en el citoplasma celular por medio de un microscopio de luz a un aumento de 400X. Las células que presentaban precipitado de formazán se clasificaron como positivas para el NBT y las que no presentaban este precipitado como negativas.

Obtención de cADNs mutantes p67 ^phox y subclonación en el vector pcDNA3.1/zeo (+)

Con el propósito de analizar si las mutaciones que se habían identificado previamente en individuos normales (25) correspondían a polimorfismos genéticos o eran mutaciones que podrían alterar la función de la proteína de 67 kd del sistema NADPH oxidasa, se introdujeron modificaciones en sitios específicos del cADN del gen NCF-2 por medio de mutagénesis sitio dirigida.

La transfección de los genes modificados permite una expresión adecuada de las proteínas mutantes de p67 ^phox en las células COS91/22/47.

Los polimorfismos de p67 ^phox analizados no afectan la función del sistema NADPH oxidasa.

En un trabajo previo, nuestro grupo describió la caracterización genética y molecular de varios pacientes con enfermedad granulomatosa crónica autosómica recesiva causada por defectos en la proteína p67 ^phox , lo cual permitió identificar una amplia diversidad de mutaciones que afectaban aspectos relacionados con la estructura del gen NCF2 y con la expresión de la p67 ^phox (25). Además, se evidenciaron algunas sustituciones nucleotídicas en sujetos usados como controles. Puesto que la presencia del fenotipo de enfermedad granulomatosa crónica depende de la presencia de ambos alelos mutados, en este caso en el gen NCF-2, no era posible saber si estos cambios correspondían a polimorfismos en este gen o si alguna de ellas era una mutación presente en un individuo portador. Por lo tanto, consideramos importante avanzar en el estudio genético y funcional de la p67 ^phox teniendo como modelo las sustituciones encontradas. Basados en estos hallazgos, se generaron por medio de mutagénesis sitio dirigida en el cADN de p67 ^phox los cambios correspondientes con el objetivo de evaluar en un sistema celular su efecto en la activación del sistema NADPH oxidasa.

Para el análisis funcional de las proteínas con mutaciones se utilizaron las células COS91/22/ 47 transfectadas transitoriamente y estimuladas con ácido araquidónico o PMA, lo cual permite determinar la funcionalidad del sistema NADPH oxidasa en células intactas. Esto es importante porque muchas de las características del ensamble del sistema oxidasa no se pueden duplicar en ensayos de sistemas libres de células, pues no reflejan el fenómeno observado en células enteras. Por ejemplo, la fosforilación de p47 ^phox se requiere para la actividad del sistema NADPH oxidasa en neutrófilos (44-46), pero no se requiere para estudios en sistemas libres de células (1,5,47). Por otro lado, las células fagocíticas no son fácilmente transfectables, mientras que el análisis funcional de proteínas mutantes ^phox en las líneas celulares PBL-985 y linfocitos B transformados con EBV (LB-EBV), las cuales expresan el sistema NADPH oxidasa, tienen limitaciones genéticas y la expresión de los genes transfectados es poco eficiente; además, los linfocitos B tienen bajos niveles de producción de anión superóxido. El sistema NAPDH oxidasa también ha sido reconstituido por transfección en líneas de células hematopoyéticas no fagocíticas K562, las cuales pueden llegar a producir anión superóxido a una taza de 5% a 15% comparados con los neutrófilos humanos (48,49).

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las sustituciones Val ₁₆₆ .Ile, Pro ₃₂₉ .Ser y His ₃₈₉ .Gln no limitaron de manera significativa la producción de anión superóxido en las células COS91/22/47 transfectadas con los cADN que contenían estas mutaciones, comparado con las células transfectadas con el cADN para la proteína tipo silvestre. De acuerdo con estos resultados, dichos cambios en la secuencia del gen NCF-2 pueden ser considerados como polimorfismos genéticos que no afecta la función. Los polimorfismos genéticos son variaciones comunes que ocurren frecuentemente en cualquier genoma y, en algunos casos, pueden alterar tanto la expresión como la función de un producto genético. Muchos polimorfismos son fenotípicamente benignos en el individuo normal; sin embargo, en un contexto ambiental y genético apropiado, un polimorfismo en una población dada puede actuar como un gen de susceptibilidad y modificar la expresión clínica de una enfermedad (50-55). Por ejemplo, en un estudio reciente se demostró una asociación de complicacionesclínicas en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica con la presencia de polimorfismos en genes relacionados con el sistema inmune (50).

Algunos de estos cambios en la secuencia de la p67 ^phox pudieran alterar en cierta forma la correcta expresión o función de esta proteína y, por lo tanto, los individuos portadores de dichos polimorfismos podrían tener una pequeña disminución en la producción de especies reactivas del oxígeno sin llegar a presentar un fenotipo de enfermedad granulomatosa crónica. De esta manera, los portadores de estos cambios podrían aumentar su riesgo genético en asocio con otros polimorfismos para la aparición de enfermedades relacionadas con la disminución de la respuesta inmune innata. Sin embargo, en el sistema celular utilizado en el presente trabajo, las proteínas que portaban estos tres polimorfismos se asociaron con la generación de anión superóxido en cantidades similares a las de la p67 ^phox tipo normal. Esto sugiere que ninguno de los tres polimorfismos está asociado con cambios en la expresión o función de la p67 ^phox que conduzcan a una disminución en la producción de especies reactivas del oxígeno. En el caso del cambio Val ₁₆₆ .Ile, en el cual ambos son aminoácidos alifáticos y se comportan como hidrófobos, no se esperaba un cambio trascendental en las características funcionales de la proteína, lo que concuerda con los resultados encontrados. En cambio, en la modificación Pro ₃₂₉ .Ser, se reemplaza un aminoácido que tiene características alifáticas y es hidrófobo por una aminoácido débilmente polar. Como consecuencia de esto, se esperaría un cambio en la actividad del sistema oxidasa; sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a la producción de anión superóxido entre las dos proteínas. Posiblemente esto se deba a que el sitio del polimorfismo no se encuentra en un dominio importante de la proteína o a que los cambios de carga generados no producen alteraciones dramáticas en la estructura terciaria de p67 ^phox. En el último polimorfismo estudiado (His 389 .Gln), se cambió un aminoácido básico, fuertemente polar e hidrofílico, por otro polar e hidrofílico. Ambos aminoácidos se encuentran, por lo general, en la superficie exterior de las proteínas interactuando con el medio acuoso, lo que puede estar explicando los resultados obtenidos en los cuales no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa cuando el cADN con el polimorfismo fue transfectado en células COS91/22/47 y su actividad se comparó con la función de la proteína expresada por el cADN tipo normal de p67 ^phox.

En conclusión, en el presente trabajo se determinó el efecto que tienen algunos polimorfismos en el gen de la p67 ^phox sobre la función del sistema NADPH oxidasa usando un sistema celular transgénico no hematopoyético basado en células COS-7. Con este modelo de células completas se pudo determinar que los cambios Val ₁₆₆ .Ile, Pro ₃₂₉ .Ser y His ₃₈₉ .Gln no se asociaban con ninguna alteración que conllevara a una disminución en la actividad del sistema NADPH oxidasa. De esta manera, el modelo celular COS ^phox representa un nuevo sistema de células completas que sirve para estudiar la función del sistema NADPH oxidasa de las células fagocíticas y sus características genéticas.

La realización de este trabajo ha sido posible gracias a la financiación de Colciencias (proyecto 1115-04-12013) y del Comité de Investigaciones de la Universidad de Antioquia. Agradecemos igualmente a Marianne Price por toda su asesoría y por compartir todos sus conocimientos relacionados con el sistema Cos ^phox .

Correspondencia:

Andrés Augusto Arias, Sede de Investigaciones Universitarias (SIU), Calle 62 #52-59, Oficina 530,

Universidad de Antioquia, Medellín, Antioquia, Colombia.

Teléfono: (574) 210 6471; fax: (574) 510 6047

Recibido: 17/09/03; aceptado: 08/07/04

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