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Biomédica

Print version ISSN 0120-4157

Biomédica vol.24 no.3 Bogotá Sept. 2004

 

Expresión y actividad de posibles polimorfismos provenientes de individuos normales en la proteína de 67 kd del sistema NADPH oxidasa utilizando el sistema COS phox

Andrés Augusto Arias 1 , Mary C. Dinauer 2 , Jiabin Ding 3 , Juan David Matute 1 , Pablo Javier Patiño 1

1 Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Corporación Biogénesis, Universidad de Antioquia, Medellín, Antioquia, Colombia.

2 Department of Pediatrics, Hematology/Oncology, Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN, U.S.A.

3 Department of Immunology, Genentech Inc., South San Francisco, CA, U.S.A.

El sistema NADPH oxidasa de las células fagocíticas cumple una función importante durante la respuesta antimicrobiana del organismo. La activación de este sistema está precedida por la translocación de las proteínas citosólicas p67 phox , p47 phox y p40 phox hacia la membrana para ponerse en contacto con el flavocitocromo b 558 , lo que induce la generación del anión superóxido, un precursor de agentes microbicidas oxidantes. El presente trabajo presenta un análisis funcional del sistema NADPH oxidasa basado en los hallazgos de polimorfismos encontrados en el gen de p67 phox de individuos sanos. Para esto se generaron mutaciones en el cADN que codifica la p67 phox y se expresaron en el sistema de células COS phox . Los datos obtenidos en el presente trabajo indican que los cambios Val 166 .Ile, Pro 329 .Ser y His 389 .Gln no generan alteraciones en el funcionamiento de la p67 phox cuando su función se analizó en el sistema transgénico basado en células COS-7. Por lo tanto, estos polimorfismos no generan ningún riesgo genético de producir deficiencias en la activación del sistema NADPH oxidasa. Además, se demuestra que el modelo de células COS phox representa un nuevo sistema celular, fácilmente transfectable que permite estudiar la función del sistema NADPH oxidasa de las células fagocíticas y sus particularidades genéticas. Finalmente, los hallazgos con estos polimorfismos nos permiten avanzar en el conocimiento sobre los mecanismos moleculares involucrados en la activación del sistema NADPH oxidasa células fagocíticas.

Palabras clave: NADPH oxidasa, p67 phox , COS- phox cells, polimorfismos.

Expression and activity of polymorphisms in the 67-kDa protein of the NADPH oxidase system

The NADPH oxidase system plays a central role in the antimicrobial activity of phagocytes. This system is initiated by the translocation of cytosolic proteins p67 phox , p47 phox and p40 phox to be in close contact with membrane flavocytochrome b 558 . This event begins the electron transfer from cytosolic NADPH to molecular oxygen to produce superoxide anions. Herein, a functional analysis is presented of p67 phox polymorphisms identified from healthy humans. Mutations were generated in the p67 phox cDNA by site-directed mutagenesis and then transiently expressed in COS7 cells that also expressed gp91 phox , p22 phox , and p47 phox from stable transgenes. The changes Val166Ile, Pro329Ser and His389Gln correspond to possible polymorphisms identified in healthy individuals revealed a functional activity similar to COS phox cells transiently transfected with WT p67 phox ; therefore, these modifications are not associated with genetic deficiencies in NADPH oxidase. In conclusion, the COS phox system represents an easily transfectable model for analysis of NADPH oxidase function in intact cells. The analysis of mutant derivatives of p67 phox provides insight into molecular mechanisms by which this subunit regulates the NADPH oxidase.

Key words: NADPH oxidase, p67 phox, COS- phox cells, polymorphisms.

Los neutrófilos y otros fagocitos son las únicas células capaces de generar durante un fenómeno conocido como 'explosión respiratoria' grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno en respuesta a una gran variedad de estímulos inflamatorios, tanto solubles como particulados.

Durante esta explosión respiratoria se transfieren electrones desde el NADPH citosólico al oxígeno molecular que se encuentra en la vacuola fagocítica o en el espacio extracelular, generando así anión superóxido (O 2 .- ) (1); este fenómeno depende del sistema NADPH oxidasa u oxidasa de las células fagocíticas.

El sistema oxidasa está formado por cinco componentes principales: gp91 phox (phox por phagocyte oxidase), p22 phox , p67 phox , p47 phox y p40 phox . La interacción de las proteínas gp91 phox y la p22 phox forma un heterodímero transmembranal conocido como flavocitocromo b 558 , el cual contiene los elementos necesarios para el transporte de electrones (2-4). Durante la activación del sistema oxidasa, las subunidades citoplasmáticas p40 phox , p47 phox y p67 phox se desplazan en bloque para unirse al flavocitocromo b en la membrana plasmática. Una vez ocurre la interacción, el NADPH es oxidado a NADP + , los electrones son transportados al grupo FAD presente en el flavocitocromo b 558 , luego a sus dos grupos heme y, finalmente, al O 2 .- (5,6). Además de las proteínas phox la activación de este sistema también requiere de la proteína unidora de GTP Rac con actividad GTPasa (Rac1 o Rac2) (7).

Aunque dichas especies reactivas de oxígeno son importantes en la respuesta microbicida, cuando se generan en cantidades elevadas pueden producir daño en los tejidos del hospedero, lo cual ha llevado a establecer su participación en la patogénesis de enfermedades asociadas con inflamación crónica y aguda tales como la artritis reumatoidea (8), el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (9) y el choque séptico (10).

Por lo tanto, su producción debe estar altamente regulada para asegurar que se produzcan en el sitio adecuado y en el momento en que sean requeridos (1,5).

La importancia biológica del sistema NADPH oxidasa se ha demostrado gracias a la enfermedad granulomatosa crónica, un trastorno hereditario del sistema inmune caracterizado por la ausencia o, en algunas ocasiones, por la disminución de la producción de O 2 .- . El anión superóxido y sus derivados tóxicos (peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso y radical hidroxilo) (6,11-14) son necesarios para destruir algunos microorganismos invasores; por tanto, los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica sufren infecciones recurrentes y algunas veces fatales por bacterias y por ciertos hongos (15,16).

La forma más común de enfermedad granulomatosa crónica es la ligada al cromosoma X, que se presenta en ~65% de todos los casos y es causada por una mutación en el gen CYBB que codifica para la gp91 phox (17,18). Los casos restantes de enfermedad granulomatosa crónica se heredan de forma autosómica recesiva y son causadas por defectos en los genes CYA (p22 phox), NCF-1(p47 phox ) y NCF-2 (p67 phox ). La enfermedad granulomatosa crónica por deficiencia de p67 phox es una forma rara de la enfermedad y se presenta en 6%, aproximadamente, de los pacientes.

Hasta la fecha se han descrito aproximadamente quince mutaciones en el gen NCF-2 y todas ellas dan como resultado una ausencia total del producto proteico (19-23). De la misma manera, se han reportado varios candidatos para polimorfismos en el gen NCF-2 (24,25).

La p67 phox es una proteína levemente ácida (pI~6) con 526 aminoácidos y una masa de 60,9 kd, la cual está codificada por el gen NCF2 que está ubicado en el cromosoma 1q25; éste tiene una longitud de 40 kb y contiene 16 exones que generan un mARN de 2,4 kb (26). En esta proteína se han descrito diferentes tipos de dominios estructurales que tienen un papel importante para su función. En la región amino terminal posee cuatro dominios conocidos como repeticiones tetratricopeptídicas (TPR); tres de ellos se encuentran continuos y el cuarto se encuentra

separado de los tres primeros por una secuencia de 16 aminoácidos (27-32). Juntos, estos cuatro dominios hacen de la región amino terminal de p67 phox un dominio funcional (residuos 1-246) que permite la activación del sistema oxidasa en sistemas libres de células (33) y se une a la proteína Rac (28,29,31,32).

Una de las características más importantes de las proteínas citosólicas del sistema NADPH oxidasa es la presencia de los denominados dominios de homología 3 con Src (SH3) que se encuentran en una gran variedad de proteínas de señalización intracelular que se desplazan entre el citosol y la membrana o en complejos relacionados con el citoesqueleto (1,34,35). Los dominios SH3 se unen en forma no covalente a regiones ricas en prolinas que se encuentran ubicadas en las proteínas blanco. Tanto la p67 phox como la p47 phox contienen dos dominios SH3 y una región rica en prolinas; por su parte, la proteína p40 phox posee un dominio SH3 (36-38). La presencia de estos dominios en p67 phox le permite interactuar y formar complejos con p47 phox y p40 phox.

El papel exacto de p67 phox y las demás proteínas phox citosólicas es desconocido; sin embargo, es claro que p67 phox es absolutamente requerida para la generación del anión superóxido en células intactas y en sistemas libres de células.

En el presente trabajo se presenta una aproximación al estudio del sistema NADPH oxidasa basada en los hallazgos del análisis de tres mutaciones distintas que se habían identificado previamente en el gen de p67 phox de individuos sanos (25). Debido a que la enfermedad granulomatosa crónica por deficiencia de p67 phox es un rasgo autosómico recesivo y que dichos cambios se detectaron en individuos sanos heterocigóticos, no era posible saber si estos individuos eran portadores de mutaciones que alteraban la expresión de la p67 phox o simplemente correspondían a polimorfismos de dicha proteína.

Con el objetivo de determinar el efecto de estas mutaciones sobre el sistema NADPH oxidasa, se generaron mutaciones en el cADN de p67 phox y se expresaron en el sistema de células COS phox , un modelo recientemente desarrollado basado en células COS-7, originarias del riñón del mono verde africano (39). Las células COS91/22/47/67 (COS phox ) exhiben un alto nivel de actividad del sistema NADPH oxidasa cuando son activadas con acetato de forbol miristato ( phorbol myristate acetate, PMA) o ácido araquidónico, que son dos estimulantes solubles comúnmente usados para activar el sistema NADPH oxidasa de los neutrófilos. Estas células son fácilmente transfectables y expresan constitutivamente la proteína Rac1.

Materiales y métodos

Obtención del cADN de p67 phox y características del vector pBfox67

El cADN de p67 phox utilizado se encontraba clonado en el vector pVL1393 (Pharmingen, San Diego, CA) en los sitios XbaI y PstI. El diseño de los oligonucleótidos, el mapa de restricción y la secuencia de nucleótidos después de la reacción de obtención de secuencias se basó en la secuencia del ARNm de p67 phox publicada en el GenBank (Accession # NM_000433). El tamaño total del inserto era de 2,4 kb constituido por una secuencia de 1581 pb que codifica para p67 phox y una secuencia de 819 pb correspondiente a parte de la región 3' no traducida del ARNm.

Mutagénesis sitio dirigida

La mutagénesis sitio dirigida para introducir mutaciones específicas en el gen de la proteína p67 phox se realizó con el producto comercial GeneEditor...in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega, Madison, WI). Las mutantes obtenidas a partir del cADN de p67 phox clonado en el vector pVL1393 fueron las siguientes: Sust G 496 .A, Sust C 985 .T y Sust C 1167 .A que generaron un cambio en los aminoácidos V166I, P329S y H389Q, respectivamente.

Subclonación de las diferentes mutantes de p67 phox en el vector pcADN3.1/zeo(+)

Los cADN de p67 phox tipo silvestre y mutantes obtenidos por mutagénesis sitio dirigida se subclonaron en el vector pcADN3.1/zeo(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando las enzimas de restricción BamHI y PstI (Promega). Para la subclonación se realizó una digestión parcial, ya que el cADN de p67 phox contiene un sitio de corte interno para BamHI en el nucleótido 966 corriente arriba del codón de iniciación. En cada uno de los plásmidos obtenidos se verificó la inserción correcta y la presencia del cADN de p67 phox por medio de una digestión con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Los nuevos vectores obtenidos se denominaron como pcADN-G 496 .A, pcADN-C 985 .T, pcADN-C 1167 .A y pcADN-67WT.

Con el fin de verificar la inserción correcta de los diferentes cADN de p67 phox clonados en el vector pcADN3.1/zeo(+), así como la presencia de las mutaciones generadas por mutagénesis sitio dirigida, se obtuvo la secuencia del cADN de p67 phox en un secuenciador ABI 310 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) con el estuche comercial BigDye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer Applied Biosystems), el oligonucleótido universal del promotor de T7 y un oligonucleótido en dirección sentido que forma híbridos con los nucleótidos 813 al 831 del cDNA de p67 phox .

Transfección de la línea celular COS91/22/47

Para expresar de manera transitoria las p67 phox normal y mutante se utilizó la línea celular COS91/ 22/47. Esta línea celular había sido transfectada previamente de manera estable con los cADN de gp91 phox , p22 phox y p47 phox clonados en los vectores pEF-PGKpac, pEF-PGKneo y pEF-PGKhygro, respectivamente (40-42). Estas células se cultivaron en medio DMEM/10% suero bovino fetal (SBF) (Hyclone, Logan, UT) con suplemento de 50 unidades/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina (Gibco BRLÒ Life Technologies), 0,2 mg/ml de higromicina (Invitrogen), 1,8 mg/ml de G418 y 1 µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Las células COS91/22/47 adherentes se recolectaron de los platos de cultivo por incubación con tripsina/EDTA (Gibco BRLO Life Technologies) durante 5 minutos a 37°C. La acción de la tripsina se neutralizó por la adición de DMEM/10% SBF. Posteriormente, las células se precipitaron por centrifugación a 1200 rpm a 4°C por 5 minutos; se lavaron en PBS frío en hielo, nuevamente se centrifugaron y rápidamente se resuspendieron en PBS a 4°C.

Con el fin de transfectar transitoriamente la línea celular COS91/22/47 con los vectores que contenían los cADN normal o mutantes de p67 phox se utilizó el reactivo Lipofectamine Plus (GibcoBRL). Se mezclaron 3 x 10 6 células COS91/22/47 con 2 µg de los respectivos cADN clonados en pcADN3.1/zeo(+). Éstas se analizaron 21 horas después de la transfección como se menciona en los ensayos de Price et al. (41,42).

Análisis de la expresión de la p67 phox tipo normal y mutante en células COS91/22/47 transformadas transitoriamente

Para determinar la expresión de la p67 phox tanto normal como mutantes, se realizó una inmunodetección con un anticuerpo específico contra p67 phox . A partir de las células trans-fectadas, 1 x 10 6 células se concentraron por centrifugación y, posteriormente, se resuspendieron en el tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Tritón X-100, 20 µg/ml de quimostatina, 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil, PMSF-, 1 mM de 4-(2- aminoetil) fluoruro de benzenosulfonilo, AEBSF-y 10 mM de leupeptina). La concentración de las proteínas totales en el lisado se cuantificó usando el ensayo de proteínas BSA (Pierce, Rockford, IL). Un total de 10 µg del lisado total se sometieron a electroforesis en gel SDS-PAGE 12% seguido por la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en TBS-T (tampón de tris salino, Tween-20 al 0,5%) con leche descremada baja en grasa al 6% durante 1 hora; luego, se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo policlonal de conejo contra p67 phox humana donado por David Lambeth (Emory University, Atlanta, GA) diluido 1:5.000 en TBS-T. Posteriormente, se adicionó un anticuerpo monoclonal anti-IgG de conejo producido en ratón, conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en 1:3.000 en TBS-T y se incubó por 1 hora; la reacción antígeno-anticuerpo se visualizó por medio de quimioluminiscencia ECL (Amershan, Arlington Heights, IL). La presencia de las bandas correspondientes a la p67 phox se evidenció en película radiográfica X-Omat (Eastman Kodak Co., Rochester, NY).

Cinética de anión superóxido

Para determinar la actividad funcional del sistema NADPH oxidasa en las células COS91/22/47 transfectadas transitoriamente con los vectores que contenían el cADN de p67 phox , se evaluó la producción de anión superóxido. Para esto se realizó un ensayo de cinética cuantitativa basada en la reducción del citocromo c, reacción que es inhibible por la superóxido dismutasa. El ensayo se realizó a 37°C con un lector de microplatos Thermomax (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA) como se ha descrito previamente (41,43).

Brevemente, 2,5 x 10 5 células provenientes de cada una de las transfecciones se resuspendieron en 250 ul de PBSG (PBS más 0,5 mM de MgCl 2 , 0,9 mM de CaCl 2 y 7,5 mM de dextrosa) que contenía 75 µM de citocromo c. Las células se activaron por la adición de 100 µM de ácido araquidónico (AA). Por otro lado, una réplica de las muestras se incubó en paralelo con 250 unidades de superóxido dismutasa (SOD). La producción de anión superóxido se cuantificó usando el coeficiente de extinción de 21.1 mM -1 cm -1 para el citocromo C. El índice máximo de generación de anión superóxido por un intervalo de tres minutos se calculó con el programa Softmax, versión 2.0.

Técnica de NBT en placa

También se evaluó la actividad funcional del sistema NADPH oxidasa por medio de la técnica de NBT en placa. Para la detección de la reducción del azul de tetrazolio ( nitroblue tetrazolium, NBT) (Sigma-Aldrich) se procedió de la siguiente manera.

El NBT utilizado se obtuvo del sobrenadante de una solución saturada de NBT en PBSG (PBS más 0,9 mM de CaCl 2 , 0,5 mM MgCl 2 y 7,5 mM de glucosa). La mezcla para este ensayo contenía 20 µl de células COS91/22/47 transfectadas transitoriamente con los vectores que contenían el cADN de p67 phox tipo normal o mutantes a una concentración de 5 x 10 6 células/ml, 60 µl de PBSG-NBT, más 0,4 µg/ml de PMA (Sigma - Aldrich) y se llevó a un volumen final de 300 ul con PBSG. Esta solución se dispensó en un sistema de láminas-cámara de 8 pozos (USA Scientific, Ocala, FL) y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se aspiró el sobrenadante y las células se dejaron secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Finalmente, las células se fijaron con metanol al 100% y se colorearon con safranina al 0,2% durante un minuto. La observación de las láminas y la determinación del porcentaje de células NBT positivas se realizó contando al azar 200 células, en las cuales se identificó la presencia de precipitados azul oscuro (formazán) en el citoplasma celular por medio de un microscopio de luz a un aumento de 400X. Las células que presentaban precipitado de formazán se clasificaron como positivas para el NBT y las que no presentaban este precipitado como negativas.

Resultados

Obtención de cADNs mutantes p67 phox y subclonación en el vector pcDNA3.1/zeo (+)

Con el propósito de analizar si las mutaciones que se habían identificado previamente en individuos normales (25) correspondían a polimorfismos genéticos o eran mutaciones que podrían alterar la función de la proteína de 67 kd del sistema NADPH oxidasa, se introdujeron modificaciones en sitios específicos del cADN del gen NCF-2 por medio de mutagénesis sitio dirigida.

Las mutaciones generadas están localizadas en diferentes partes del cADN de p67 phox y correspondían a las sustituciones G 496 .A, C 985 .T y C 1167 .A. La primera de ellas es una transición que predice para una modificación conservadora Val 166 .Ile. Las transversiones C 985 .T y C 1167 .A predicen el reemplazo Pro 329 .Ser e His 389 .Gln, respectivamente (figura 1).

 

 Posteriormente, estos cADN se subclonaron en el vector de expresión en mamíferos pcADN3.1/zeo(+) bajo el control del promotor de CMV, lo que permite una eficiente y alta expresión de la proteína recombinante. Los constructos obtenidos fueron pcADN-G 496 .A, pcADN-C 985 .T, pcADN-C 1167 .A y pcADN-67WT (tipo normal), los cuales tenían un tamaño de 7415 pb. La orientación correcta del inserto se verificó por medio de digestión con las enzimas BamHI y HindIII que, como se observa en la figura 2, genera un fragmento de 6419 pb y otro de 996 pb, lo cual indica la construcción correcta de los nuevos vectores. La verificación de las mutaciones generadas por mutagénesis sitio dirigida se realizó al obtener la secuencia de la región del cADN de p67 phox donde se encontraba la mutaciónintroducida por los respectivos oligonucleótidos (datos no mostrados).

La transfección de los genes modificados permite una expresión adecuada de las proteínas mutantes de p67 phox en las células COS91/22/47.

Para confirmar que los cADN que codificaban para la proteína tipo normal y las diferentes mutantes se expresan en las células COS91/22/47, se realizó un Western blot después de 24 horas de la transformación transitoria (figura 3). Estos resultados muestran que tanto la p67 phox normal, como las diferentes mutantes se expresaban en las células COS91/22/47 después de la transfección con los constructos pcADN-G 496 .A, pcADN-C 985 .T, pcADN-C 1167 .A y pcADN-67WT. La expresión de las proteínas mutantes fue entre 47% y 74% comparadas con la expresión de la proteína p67 phox tipo normal. Esta disminución en la expresión de las proteínas mutantes en las células COS91/22/47, al compararla con la expresión de la p67 phox en células transformadas de manera transitoria con el cADN tipo normal puede deberse a una posible inestabilidad proteica o a una regulación de la expresión intracelular de estas proteínas o, simplemente, es un problema inherente al tipo de transfección transitoria utilizado.

Los polimorfismos de p67 phox analizados no afectan la función del sistema NADPH oxidasa.

Para determinar la actividad funcional del sistema NADPH oxidasa en las células COS91/22/47 transformadas transitoriamente con los vectores que contenían el cADN de p67 phox con los tres polimorfismos G 496 .A, C 985 .T y C 1167 .A y con la p67 phox normal se evaluó la producción de anión superóxido en un ensayo de cinética cuantitativa basada en la reducción del citocromo c; además, se determinó la capacidad que tenían estas células para reducir el azul de tetrazolio por medio de la técnica de NBT en placa. La primera de estas sustituciones determina para una modificación conservadora de la valina 166 por isoleucina (Val 166 .Ile). Las células que expresaban esta proteína produjeron anión superóxido a razón de 2,17±0,52 nmol/10 7 células/min (n=5), mientras que el porcentaje de reducción del NBT era de 9,05±1,57 (n=7) (figura 4A y 4B). Estos datos no presentaban una diferencia estadísticamente significativa comparada con las células que expresaban la proteína normal donde la producción de anión superóxido fue de 1,26±0,24 nmol/10 7 células/min (n=5) y el porcentaje de reducción del NBT fue de 10,67±1,95 (n=7). Las células que contenían los cambios C 985 .T y C 1167 .A que predicen el reemplazo de Pro 329 .Ser y His 389 .Gln produjeron 2,07±0,53 nmol/10 7 células/min (n=5) y 1,64±0,40 nmol/10 7 células/min (n=5), respectivamente. En el ensayo de NBT, el total de células que trasportaba la transversión C 985 .T tenía la capacidad de reducir el NBT en un porcentaje de 14,18±3,12 (n=7), mientras que las que tenían la transversión C 1167 .A fue de 10,58±2,11 (n=7). Estos resultados muestran que no hay diferencia significativa si se compara con los resultados obtenidos con la p67 phox silvestre (10,67±1,95, n=7). 

Discusión

En un trabajo previo, nuestro grupo describió la caracterización genética y molecular de varios pacientes con enfermedad granulomatosa crónica autosómica recesiva causada por defectos en la proteína p67 phox , lo cual permitió identificar una amplia diversidad de mutaciones que afectaban aspectos relacionados con la estructura del gen NCF2 y con la expresión de la p67 phox (25). Además, se evidenciaron algunas sustituciones nucleotídicas en sujetos usados como controles. Puesto que la presencia del fenotipo de enfermedad granulomatosa crónica depende de la presencia de ambos alelos mutados, en este caso en el gen NCF-2, no era posible saber si estos cambios correspondían a polimorfismos en este gen o si alguna de ellas era una mutación presente en un individuo portador. Por lo tanto, consideramos importante avanzar en el estudio genético y funcional de la p67 phox teniendo como modelo las sustituciones encontradas. Basados en estos hallazgos, se generaron por medio de mutagénesis sitio dirigida en el cADN de p67 phox los cambios correspondientes con el objetivo de evaluar en un sistema celular su efecto en la activación del sistema NADPH oxidasa.

Para el análisis funcional de las proteínas con mutaciones se utilizaron las células COS91/22/ 47 transfectadas transitoriamente y estimuladas con ácido araquidónico o PMA, lo cual permite determinar la funcionalidad del sistema NADPH oxidasa en células intactas. Esto es importante porque muchas de las características del ensamble del sistema oxidasa no se pueden duplicar en ensayos de sistemas libres de células, pues no reflejan el fenómeno observado en células enteras. Por ejemplo, la fosforilación de p47 phox se requiere para la actividad del sistema NADPH oxidasa en neutrófilos (44-46), pero no se requiere para estudios en sistemas libres de células (1,5,47). Por otro lado, las células fagocíticas no son fácilmente transfectables, mientras que el análisis funcional de proteínas mutantes phox en las líneas celulares PBL-985 y linfocitos B transformados con EBV (LB-EBV), las cuales expresan el sistema NADPH oxidasa, tienen limitaciones genéticas y la expresión de los genes transfectados es poco eficiente; además, los linfocitos B tienen bajos niveles de producción de anión superóxido. El sistema NAPDH oxidasa también ha sido reconstituido por transfección en líneas de células hematopoyéticas no fagocíticas K562, las cuales pueden llegar a producir anión superóxido a una taza de 5% a 15% comparados con los neutrófilos humanos (48,49).

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las sustituciones Val 166 .Ile, Pro 329 .Ser y His 389 .Gln no limitaron de manera significativa la producción de anión superóxido en las células COS91/22/47 transfectadas con los cADN que contenían estas mutaciones, comparado con las células transfectadas con el cADN para la proteína tipo silvestre. De acuerdo con estos resultados, dichos cambios en la secuencia del gen NCF-2 pueden ser considerados como polimorfismos genéticos que no afecta la función. Los polimorfismos genéticos son variaciones comunes que ocurren frecuentemente en cualquier genoma y, en algunos casos, pueden alterar tanto la expresión como la función de un producto genético. Muchos polimorfismos son fenotípicamente benignos en el individuo normal; sin embargo, en un contexto ambiental y genético apropiado, un polimorfismo en una población dada puede actuar como un gen de susceptibilidad y modificar la expresión clínica de una enfermedad (50-55). Por ejemplo, en un estudio reciente se demostró una asociación de complicacionesclínicas en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica con la presencia de polimorfismos en genes relacionados con el sistema inmune (50).

Algunos de estos cambios en la secuencia de la p67 phox pudieran alterar en cierta forma la correcta expresión o función de esta proteína y, por lo tanto, los individuos portadores de dichos polimorfismos podrían tener una pequeña disminución en la producción de especies reactivas del oxígeno sin llegar a presentar un fenotipo de enfermedad granulomatosa crónica. De esta manera, los portadores de estos cambios podrían aumentar su riesgo genético en asocio con otros polimorfismos para la aparición de enfermedades relacionadas con la disminución de la respuesta inmune innata. Sin embargo, en el sistema celular utilizado en el presente trabajo, las proteínas que portaban estos tres polimorfismos se asociaron con la generación de anión superóxido en cantidades similares a las de la p67 phox tipo normal. Esto sugiere que ninguno de los tres polimorfismos está asociado con cambios en la expresión o función de la p67 phox que conduzcan a una disminución en la producción de especies reactivas del oxígeno. En el caso del cambio Val 166 .Ile, en el cual ambos son aminoácidos alifáticos y se comportan como hidrófobos, no se esperaba un cambio trascendental en las características funcionales de la proteína, lo que concuerda con los resultados encontrados. En cambio, en la modificación Pro 329 .Ser, se reemplaza un aminoácido que tiene características alifáticas y es hidrófobo por una aminoácido débilmente polar. Como consecuencia de esto, se esperaría un cambio en la actividad del sistema oxidasa; sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a la producción de anión superóxido entre las dos proteínas. Posiblemente esto se deba a que el sitio del polimorfismo no se encuentra en un dominio importante de la proteína o a que los cambios de carga generados no producen alteraciones dramáticas en la estructura terciaria de p67 phox. En el último polimorfismo estudiado (His 389 .Gln), se cambió un aminoácido básico, fuertemente polar e hidrofílico, por otro polar e hidrofílico. Ambos aminoácidos se encuentran, por lo general, en la superficie exterior de las proteínas interactuando con el medio acuoso, lo que puede estar explicando los resultados obtenidos en los cuales no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa cuando el cADN con el polimorfismo fue transfectado en células COS91/22/47 y su actividad se comparó con la función de la proteína expresada por el cADN tipo normal de p67 phox.

En conclusión, en el presente trabajo se determinó el efecto que tienen algunos polimorfismos en el gen de la p67 phox sobre la función del sistema NADPH oxidasa usando un sistema celular transgénico no hematopoyético basado en células COS-7. Con este modelo de células completas se pudo determinar que los cambios Val 166 .Ile, Pro 329 .Ser y His 389 .Gln no se asociaban con ninguna alteración que conllevara a una disminución en la actividad del sistema NADPH oxidasa. De esta manera, el modelo celular COS phox representa un nuevo sistema de células completas que sirve para estudiar la función del sistema NADPH oxidasa de las células fagocíticas y sus características genéticas.

Agradecimientos

La realización de este trabajo ha sido posible gracias a la financiación de Colciencias (proyecto 1115-04-12013) y del Comité de Investigaciones de la Universidad de Antioquia. Agradecemos igualmente a Marianne Price por toda su asesoría y por compartir todos sus conocimientos relacionados con el sistema Cos phox .

Correspondencia:

Andrés Augusto Arias, Sede de Investigaciones Universitarias (SIU), Calle 62 #52-59, Oficina 530,

Universidad de Antioquia, Medellín, Antioquia, Colombia.

Teléfono: (574) 210 6471; fax: (574) 510 6047

aarias@quimbaya.udea.edu.co

Recibido: 17/09/03; aceptado: 08/07/04

 

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