Comportamiento de la infección experimental por aislamientos colombianos de Giardia duodenalis en el modelo animal del gerbo ( Meriones unguiculatus)

Adriana Arévalo, Sofía Duque, Rubén Santiago Nicholls

Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D. C., Colombia.

Introducción. Se han informado infecciones naturales y experimentales con Giardia sp. En bovinos, equinos, caprinos, caninos, felinos y roedores como ratones, ratas y gerbos; estos últimos son el modelo más adecuado para estudios de la infección por Giardia duodenalis y Giardia muris.

Objetivo. Establecer el comportamiento de la infección con aislamientos colombianos de Giardia duodenalis en el modelo animal del gerbo.

Resultados. La eliminación de quistes presentó un patrón intermitente de excreción, con ausencia en la primera y cuarta semanas de infección, y presencia constante durante la segunda y tercera semanas, en número variable con promedio mínimo de 79 y máximo de 17.943 quistes liberados en heces recolectadas en un período de dos horas. Se observó colonización de los trofozoítos en el intestino delgado, en número que osciló entre 15.000 y 6'577.778 trofozoítos por ml.

Conclusiones. En gerbos infectados con aislamientos de Giardia duodenalis circulantes en otras regiones geográficas, la resolución natural de la infección oscila entre 86 y 114 días mientras que los gerbos infectados con aislamientos colombianos del parásito la resuelven al día 30. El gerbo constituye un modelo animal adecuado para la infección con aislamientos colombianos de G. duodenalis. La infección experimental por Giardia en gerbo permite obtener quistes y trofozoítos del parásito en cantidades suficientes con la finalidad de ser utilizados como antígenos para la inmunización de animales y para la obtención de anticuerpos que puedan utilizarse para la detección de antígeno de Giardia en materia fecal.

Palabras clave: Giardia, gerbo, Meriones unguiculatus, infección, quiste, trofozoíto.

Introduction. Natural and experimental Giardia infections have been reported from bovines, equines, goats, canines, felines and rodents such as mice, rats and gerbils. The latter have provided successful animal models for Giardia duodenalis and Giardia muris experimental infections.

Objective. The gerbil model was used to establish the pattern of infection of Colombian Giardia human isolates.

Results. The pattern of cyst excretion was found to be intermittent. Cysts were released during the second and third weeks of infection but not during the first or fourth weeks. The mean minimal number of cysts released per 2-hr collection period was 79 and the mean maximum number was 17,943. Colonization of the small intestine by trophozoites was observed with a mean number ranging from 15,000 to 6,577,778 trophozoites/ml.

Discussion and conclusions. Gerbils inoculated with G. duodenalis isolates obtained from geographical areas outside Colombia resolved the infection between 86 and 114 days after infection, whereas gerbils infected with Colombian G. duodenalis isolates resolved the infection at 30 days. The gerbil proved to be a good animal model for experimental infection with Colombian isolates of G. duodenalis. Experimental Giardia infection of gerbils permit a sufficient yield of cysts and trophozoites to be used as antigens for the immunization of other animals and to obtain Giardia antibodies that could be used for Giardia antigen detection assays in stool specimens.

Keywords: Giardia, gerbil, Meriones unguiculatus, infection, cyst, trophozoite.

La giardiosis es la infección intestinal humana causada por el protozoario flagelado Giardia lamblia, también conocido como G. intestinalis o G. duodenalis (1). Otras especies de Giardia ocasionan parasitismo en mamíferos, aves, anfibios y reptiles (2).

Giardia es uno de los patógenos más comunes que causa infección intestinal a nivel mundial (3) y cuya prevalencia varía según la población estudiada (4). En la población colombiana, según la primera encuesta nacional de morbilidad, 1965-1966, la prevalencia fue del 11,9% (5) y en la segunda, 1977-1980, del 13,4% (6). Los estudios realizados en 1995 en niños colombianos de 12 a 59 meses de edad demostraron prevalencias del 21,2% (7) y en niños de 3 a 13 años alojados en asentamientos temporales posterremoto en Armenia fue del 65% (Torres E., Gallego M.L., Gómez J.E. Giardiasis en niños viviendo en asentamientos temporales en Armenia. III Encuentro Nacional de Investigación en Enfermedades infecciosas, Popayán, Colombia. Infectio 2002.p.89).

La giardiosis se asocia con la ingestión de agua o alimentos contaminados por heces humanas que contienen quistes del parásito, agua mal filtrada o con tratamiento inadecuado (8). Otras fuentes de infección adicionales al hombre incluyen los castores (9), quizá, las ratas almizcleras y, posiblemente, algunos animales domésticos (10) y silvestres (11). Se ha comprobado que algunos animales como perros, gatos, castores y rumiantes pueden encontrarse naturalmente infectados o pueden ser infectados experimentalmente con especies de Giardia y, posiblemente, dar origen a la infección en humanos, en cuyo caso esta parasitosis podría considerarse como una zoonosis (12). Los humanos son los hospederos principales de G. duodenalis (13). Sin embargo, se ha observado que animales domésticos, perros y gatos (13), o de granja como terneros, corderos, lechones y potros son hospederos importantes de Giardia (14).

Durante los últimos cuarenta años se han estudiado infecciones naturales y experimentales por Giardia en una gran variedad de animales como ratas, ratones, gatos, perros y gerbos, y estos últimos son el modelo animal más adecuado para estudiar las infecciones con G. duodenalis y G. muris (15).

Kirkpatrick y Greene en 1985 (28) informaron que los gatos adultos no son muy susceptibles a la infección al igual que lo informado por Woo y Paterson (20) con gatos jóvenes.

Hewlett et al., en 1982 (29), al inocular perros con trofozoítos del parásito observaron una susceptibilidad a la infección del 37% y no se conocen evidencias documentadas de transmisión al humano de Giardia de perros infectados (30).

Faubert y Belosevic en 1990 (15) estudiaron al gerbo como modelo animal para estudios de giardiosis utilizando G. duodenalis dadas las diferencias fisiológicas existentes entre especies de Giardia y aislamientos humanos del parásito de diferentes áreas geográficas.

Con el auge de la biología y la medicina, los modelos animales se han utilizado con la finalidad de conocer aspectos relacionados con la infección que eventualmente puedan extrapolarse a humanos. Los estudios de aislamientos de G. duodenalis de diferentes hospederos sugieren que la variación intraespecífica ocurre dentro del grupo (13) y el humano es el principal reservorio del parásito. Faubert y Belosevic (15), utilizando al gerbo como modelo animal para estudios de giardiosis, observaron que el patrón de excreción de quistes varía entre diferentes aislamientos humanos y Nash et al., en 1988 (31), demostraron la acentuada variabilidad antigénica en la superficie de trofozoítos del parásito.

Se han demostrado grandes diferencias entre diferentes aislamientos de G. duodenalis con respecto a proteínas de superficie (32), perfiles antigénicos (33), patrones por enzimas de restricción (34) y patrones isoenzimáticos (35). Los estudios in vitro han revelado que un sólo trofozoíto de distintos aislamientos puede generar organismos con diferentes antígenos de superficie (31,36) e igual fenómeno se ha observado al estudiar la infección in vivo en gerbos con aislamientos de Giardia de humanos (37). La infección experimental en gerbos ha permitido, entre otros estudios, comparar la antigenicidad de diferentes aislamientos y la relación entre los perfiles antigénicos y la patogenicidad de clones (cepa WB) del trofozoíto de G. lamblia. Nash et al., en 1990 (38), demostraron que la variación antigénica de Giardia en infecciones humanas y la respuesta humoral del hospedero son en parte aislamiento-específicas. Es posible que debido a la variabilidad genética del parásito, los patrones de excreción de quistes de Giardia sean característicos por áreas geográficas y que la respuesta a sus antígenos sea también específica.

Por lo tanto, este estudio se propuso establecer el curso de la infección por quistes de aislamientos colombianos de G. duodenalis, de origen humano, en el modelo animal del gerbo.

Se recolectaron muestras de materia fecal de 35 pacientes con giardiosis clínicamente sintomática que habían consultado a los laboratorios clínicos del Hospital Infantil Lorencita Villegas de Santos (HILVS) y al Centro de Salud No.78 José María Carbonell de Bosa, ambos localizados en Bogotá, D. C.

Se realizó la identificación del parásito mediante examen directo en solución salina fisiológica y coloración con lugol (39) y por concentración con formol (Merck 4003)-éter (Merck 921) (39,40). Se examinó al microscopio en 100X y 400X.

Se diluyeron las heces completamente con agua destilada, se filtraron a través de gasa (41) y se almacenó el filtrado a 4°C (42).

Se purificaron quistes de Giardia a partir de heces humanas mediante gradientes de sacarosa (Sigma S9378) y percoll (Sigma P1644). Se homogenizaron 5 ml del filtrado de materia fecal almacenado a 4°C y se completó a un volumen de 14 ml con agua destilada. Después, se lavó el filtrado mediante centrifugación a 400 g durante 5 minutos a 18°C y se resuspendió el sedimento con agua destilada. A 1 volumen de sacarosa 1M, densidad 1,11 g/ml, se adicionó 1 volumen de la suspensión obtenida y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos a 18°C. Luego, se removieron los quistes de Giardia concentrados en la interfase agua-sacarosa, se verificó su presencia mediante observación microscópica, se lavaron con agua destilada centrifugando a 400 g durante 5 minutos a 18°C, se resuspendieron en agua destilada y se realizó el recuento de quistes del parásito bajo observación microscópica en laminilla de 22x22mm (43). Posteriormente, se vertió 1 volumen de la suspensión sobre 1 volumen de 40% de Percoll y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos a 18-20°C lavando dos veces consecutivas el precipitado (quistes de Giardia). Finalmente, se resuspendieron los quistes en 1 ml de agua destilada y se guardó la suspensión a 4°C hasta el momento de ser utilizada (44, 45).

Se utilizó el gerbo/Agouti, Meriones ungüiculatus, cepa:Agouti, línea: Cenp MON, categoría genética: no consanguíneo, categoría microbiológica: mínima contención (M-CON), suministrado por el bioterio del Instituto Nacional de Salud (INS), sexo: machos, edad: 6-10 semanas.

Se siguieron los parámetros de temperatura, humedad y ventilación establecidos internacionalmente para la cría y mantenimiento de animales en bioterio. Para su alimentación se les suministró Rodentina ® , concentrado especialmente preparado por Purina ® para roedores, y agua en un bebedero que se cambiaba tres veces por semana. El suministro de alimento y agua era ad libitum. Desde el momento de su admisión al bioterio de experimentación, los animales se sometieron a cuarentena y readaptación durante 5-15 días, tiempo recomendado para gerbos, observando la desaparición de todos los riesgos (tensión o estrés, angustia, trastornos de salud) antes de considerarlos adaptados de acuerdo con el concepto del médico veterinario (46,47).

Se les suministró, a los gerbos, metronidazol (Flagyl® 250) 20 mg/gerbo por día, por vía oral, durante tres días consecutivos, como medida de profilaxis y se realizó el diagnóstico parasitológico seriado de tal manera que sólo se utilizaron gerbos que se encontraban libres de parásitos intestinales.

La infección se hizo mediante intubación con sonda nasogástrica impregnada con lidocaína. Como controles se utilizaron 4 gerbos inoculados con 0,2 ml de solución salina fisiológica.

Se realizó el estudio del curso de la infección mediante la observación microscópica de quistes y trofozoítos de Giardia y la cuantificación de éstos (48).

Se recolectó la materia fecal a cada uno de los gerbos diariamente durante 30 días consecutivos para establecer el patrón de liberación de quistes de los aislamientos colombianos de Giardia. Se disolvieron 0,5 g de heces en 5 ml de solución salina reguladora de fosfatos (PBS) 0,1 M, pH 7,2, y se hizo el diagnóstico parasitológico a cada muestra. Se obtuvieron quistes de Giardia según la metodología descrita anteriormente para purificación de quistes de Giardia a partir de heces humanas y se efectuó el recuento de quistes liberados.

Todos los procedimientos anteriormente señalados fueron avalados por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud, de acuerdo con lo establecido en la Resolución No. 008430 del Ministerio de Salud.

La cuantificación de quistes y trofozoítos del parásito se realizó, de manera independiente, utilizando un hemocitómetro (48) y como medida de tendencia central se estimó la media (o promedio) (50).

Los patrones del curso de infección por Giardia en diferentes especies animales demuestran una excreción intermitente de quistes característica del parásito según el animal infectado. En terneros, la mayor eliminación de quistes se observa entre la primera y sexta semana posinfección (14) y este patrón es semejante en ovejas (51), potros y caballos (14). En gatos ha sido más difícil establecer el patrón de excreción de quistes por la dificultad en obtener el coprológico seriado de estos animales (52). En perros infectados con aislamientos de G. duodenalis, se ha observado que la excreción cíclica de quistes del parásito ocurre con mayor intensidad entre la segunda y tercera semanas posinfección (29), igual al patrón de excreción de quistes observado en los gerbos de este estudio. Podría pensarse en utilizar a los bovinos, los caprinos, los equinos y los caninos como posibles modelos animales para estudios de giardiosis, pero son costosos y su mantenimiento en el laboratorio en términos de vivienda, nutrición y cuidado demanda mayores recursos económicos que los utilizados para un roedor como el gerbo.

Los ratones lactantes (22), recién destetados (53) y adultos (54) han sido estudiados como posibles modelos animales para estudios de giardiosis. Sin embargo, es importante considerar que los ratones lactantes y recién destetados no tienen un sistema inmune maduro como sí lo poseen los adultos. Estos últimos, se han utilizado como modelos para estudiar la relación hospedero-parásito, incluida la variabilidad genética de Giardia (55) pero se ha demostrado que los patrones de infección difieren entre las cepas de ratones utilizadas y que las respuestas inmunológicas son características de cada patrón de infección (54).

Las ratas presentan una excreción de quistes de Giardia de forma variable eliminando quistes constantemente en algunos ejemplares, otras en forma intermitente y, en algunos casos, no existe excreción de quistes del parásito (42). Las ratas no son muy útiles para estudios de giardiosis debido a su pobre susceptibilidad a la infección y a la ausencia de patología a nivel intestinal (15).

Los gerbos utilizados en el estudio permitieron establecer el comportamiento de la infección experimental con aislamientos colombianos de Giardia provenientes de pacientes sintomáticos infectados y cumplieron con los requisitos establecidos internacionalmente para ser un modelo animal para estudios de giardiosis (15): 1) los gerbos no fueron costosos (US $2), se aparearon, se mantuvieron en las condiciones de bioterio y fueron fáciles de manejar en el laboratorio; 2) se conocía su biología, lo que garantizó el conocimiento del curso de la infección con el parásito y su aplicabilidad en estudios posteriores; 3) los animales se pudieron trabajar en el laboratorio según la ética y normas internacionales preservando su integridad en el momento de la infección experimental; 4) se inocularon oralmente con quistes de Giardia obtenidos de materia fecal de pacientes colombianos con giardiosis, semejando la transmisión fecal-oral como ocurre naturalmente en el medio ambiente; 5) los gerbos fueron sensibles a la infección con los aislamientos colombianos de Giardia y esto se demostró a lo largo del estudio por la presencia de quistes y trofozoítos del parásito en los ejemplares; 6) los trofozoítos colonizaron y se multiplicaron en el intestino delgado entre la segunda y tercera semanas de la infección permitiendo que éstos fuesen recolectados, mantenidos in vitro e iniciar un banco de aislamientos colombianos de Giardia; 7) se formaron quistes del parásito que fueron liberados en las heces intermitentemente entre la segunda y tercera semanas posinfección y esta excreción intermitente de quistes de Giardia es similar a lo que se observa en humanos.

El patrón del curso de la infección, desarrollado por los aislamientos colombianos de Giardia en los gerbos estudiados, se caracterizó por excreción intermitente con alternación de presencia y ausencia de quistes del parásito en las heces de los ejemplares, comportamiento similar al de otros aislamientos del parásito circulantes en otros países (15). El patrón de excreción intermitente de quistes del parásito de los gerbos estudiados fue diferente al de gerbos infectados con aislamientos del parásito circulantes en Etiopía, Canadá, España, Haití y Cuba (15), tomando como criterios los días en que hubo ausencia de quistes en las heces y el número de días que esta ausencia perduró. Los aislamientos de Giardia de Etiopía y Haití presentaron una sola vez ausencia de quistes; los de Canadá y España, 3 veces; los de Cuba, 4 veces (15), y los de Colombia ninguno pero sí una baja excreción de quistes representada por 79 de ellos. Sin embargo, al comparar cada uno de los gerbos infectados con los aislamientos colombianos de Giardia se observaron variaciones entre los ejemplares presentándose ausencia de quistes en las heces una sola vez en 3 animales y 2 veces en 2 ejemplares.

El inicio de la excreción intermitente de quistes ocurre al día 12 de la infección con los aislamientos de Haití, al día 21 con los de Cuba, Canadá y España, al día 37 con los de Etiopía, mientras que con los de Colombia ocurre más tempranamente, al día 8 posinfección. La duración en el número de días de la ausencia de quistes en heces de los gerbos infectados es de 1 día para los aislamientos de Cuba y Etiopía, de 3 días con los de Haití, de 1 y 3 días con los de Canadá, de 1, 3 y 14 días con los de España y con los colombianos de 1, 3, 4 y 5 días.

La excreción intermitente de quistes es una característica inherente de este protozoario debido a las proteínas involucradas en el proceso y, por lo tanto, relacionadas con la variación antigénica (56). Es posible que debido a la variabilidad genética que presenta el parásito, los patrones de excreción de quistes sean característicos por áreas geográficas y que el proceso de resolución natural de la infección también sea diferente. Así, la infección se resuelve en los gerbos infectados con aislamientos de Giardia circulantes en Etiopía y Haití, Canadá, España y Cuba, aproximadamente, a los días 86, 100 y 114, respectivamente (15) mientras los gerbos infectados con aislamientos colombianos de Giardia resuelven la infección al día 30 (cuarta semana) posinfección.

Los trofozoítos se localizan en el duodeno y yeyuno proximal a los días 5, 20 y 25 posinfección; en duodeno, yeyuno proximal, yeyuno distal e ileon a los días 10 y 15 y sólo en duodeno al día 30 (15). El ambiente duodenal tiende a ser ácido pero el pH incrementa gradualmente en el intestino delgado hasta valores entre 7,6 y 8,0 en el yeyuno distal (61). Este pH ligeramente básico en yeyuno distal induce la ionización de ácidos grasos e incrementa su asociación con las sales biliares que promueven el enquistamiento del parásito (62). La presencia de sólo trofozoítos en duodeno y su ausencia en yeyuno distal, sitio en el cual ocurre el enquistamiento (15), podría explicar la ausencia de quistes durante la fase final de la infección en la materia fecal de los gerbos infectados con aislamientos colombianos de Giardia. Complementariamente, durante el proceso de la resolución de la infección por Giardia en el intestino delgado de los gerbos se recupera la proporción vellosidad/criptas intestinales (63) y una vez que las células del epitelio intestinal se encuentran en su estado normal producen óxido nítrico que también inhibe el crecimiento y el enquistamiento de los trofozoítos de Giardia (64).

Los hallazgos de este trabajo permiten concluir que el gerbo constituye un buen modelo animal para la infección experimental con aislamientos colombianos de G. duodenalis, que el comportamiento de la infección experimental por los aislamientos colombianos del parásito difiere a lo observado con aislamientos del parásito de otras regiones geográficas y que la infección experimental permite obtener trofozoítos y quistes del parásito en cantidades suficientes con la finalidad de ser utilizados como antígenos para la inmunización de animales y para la obtención de anticuerpos que puedan utilizarse para la detección de antígeno de Giardia en materia fecal.

Los autores expresan sus agradecimientos al Grupo Producción y Desarrollo Tecnológico de la Subdirección de Producción del Instituto Nacional de Salud por el suministro y mantenimiento de los gerbos en el Bioterio Experimental. Al Centro de Salud No.78, José María Carbonel, y al Hospital Infantil Universitario Lorencita Villegas de Santos por las muestras de materia fecal con presencia de Giardia que fueron utilizadas en el ensayo piloto y, muy especialmente, a Rafael Guerrero por la selección de pacientes sintomáticos de giardiosis.

Este estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Salud.

Ninguno

Correspondencia:

Adriana Arévalo, Avenida Calle 26 No. 51-60, Bogotá, D.C., Colombia

Teléfono: (571) 220 7700, extensión 455; fax: (571) 220

7700, extensión 457

Recibido: 20/01/05; aceptado: 25/04/05

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