2 Departamento de Microbiología, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia

Introducción. El desarrollo de anticuerpos policlonales requiere de animales de laboratorio, generalmente, el conejo, que deben sangrarse para su obtención. Como alternativa, se han utilizado las gallinas.

Objetivo. Desarrollar anticuerpos policlonales IgY anti- Giardia duodenalis y evaluar diferentes métodos para su purificación a partir de yema de huevo.

Materiales y métodos. Se inmunizaron tres gallinas intramuscularmente con trofozoítos del parásito: las inmunizaciones se realizaron a los 0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 días. Se recolectaron huevos en cada etapa de la inmunización y se purificó la IgY por deslipidación (D) y precipitación (P) mediante cinco protocolos diferentes: M1: (P: sulfato de amonio/D: dextrán sulfato-cloruro de calcio), M2: (D: dextrán sulfato-cloruro de calcio/P: sulfato de amonio), M3: (D: cloroformo/ P: sulfato de amonio 50%), M4: (D: solución A/P:solución B) y M5: (D: cloroformo/P: sulfato de amonio 30%). Se realizó evaluación inmunoquímica de la IgY anti- Giardia duodenalis mediante inmunodifusión, contrainmunoelectroforesis e inmunoelectrotransferencia ( Western blot); la pureza de IgY por SDS-PAGE en presencia y ausencia de reductor y la concentración de la inmunoglobulina (mg/mL) por espectrofotometría y densitometría.

Resultados. La IgY anti- G. duodenalis mediante evaluación inmunoquímica presentó títulos hasta de 1:32. La inmunoglobulina en ausencia de reductor mostró una banda de 180 kd y en su presencia bandas de 30 y 68 kd, características de sus cadenas liviana y pesada, respectivamente. Las mayores concentraciones de inmunoglobulina se recuperaron con el método dos (M2), 4,6 mg de IgY por mL de yema de partida.

Conclusiones. Por su facilidad y economía de producción en gallinas, los anticuerpos policlonales IgY anti- Giardia así obtenidos podrán utilizarse para desarrollar inmunoensayos que detecten el parásito en eluídos de heces.

Palabras clave: Giardia, yema de huevo, anticuerpos antiprotozoarios.

Introduction. The development of polyclonal antibodies requires laboratory animals, as the usually rabbits, which are bled for obtaining the immunoglobulins.Hens are an alternative to developing IgY polyclonal antibodies.

Objective. In the current study, hens were used to develop IgY anti- Giardia duodenalis antibodies and to evaluate five protocols for its purification.

Materials and methods. Three hens were immunized intramuscularly immunized with Colombian Giardia duodenalis isolates trophozoites on day 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120. The hen eggs were collected before each immunization, and IgY purified from yolk by delipidation (D) and precipitation (P) using five different protocols: M1: (P: ammonium sulfate/D:dextran sulfate-calcium chloride), M2: (D: dextran sulfate-calcium chloride/P: ammonium sulfate), M3: (D: chloroform/P: ammonium sulfate 50%), M4: (D: solution A/P: solution B) and M5: (D: chloroform/P: ammonium sulfate 30%). The immunochemistry evaluation of IgY anti- Giardia duodenalis was assayed by immunodiffusion, counterimmunoelectrophoresis (CIE) and Western blot. The purity of IgY was assayed by SDS-PAGE under reducing and nonreducing conditions.

Immunoglobulin concentration (mg/mL) was estimated by spectrophotometry and densitometry.

Results. IgY anti- Giardia duodenalis by CIE had titres up to 1:32. SDS-PAGE, without 2- mercaptoethanol showed a 180 kd band characteristic of the whole to IgY and, with 2- mercaptoethanol, two bands of 68 and 30 kd, characteristic of its light and heavy chains, respectively. The greatest concentrations of immunoglobulin were recovered by method two (M2), producing 4.6 mg of IgY per mL of initial egg yolk.

Conclusions. The easy and inexpensive production of IgY anti- Giardia duodenalis in hens is an advantage for using it to develop immunoassays that detect the parasite in fecal eluates.

Key words: Giardia, egg yolk, antibodies protozoan.

La giardiosis es una infección intestinal causada por Giardia duodenalis (1) de distribución a nivel mundial. Según la primera encuesta nacional de morbilidad, 1965-1966, la prevalencia en la población colombiana fue de 11,9% (2), y de 13,7% en la segunda, 1977-1980 (3). Estudios realizados en niños colombianos de 12 a 59 meses de edad (4) y de 3 a 13 años alojados en asentamientos temporales (5) informaron prevalencias de 21,2% y de 65%, respectivamente.

La identificación de G. duodenalis se realiza tradicionalmente visualizando quistes o trofozoítos del parásito en materia fecal, considerada como la mejor muestra y la de más fácil consecución (6). Sensibilidades mayores a 85% para la identificación de G. duodenalis raramente se logran debido a la excreción intermitente de quistes, fenómeno inherente a la biología del parásito (7). Sin embargo, una alternativa para establecer la presencia de G. duodenalis es la detección de antígeno del parásito en heces mediante anticuerpos policlonales anti- Giardia duodenalis (8).

Se han desarrollado anticuerpos policlonales IgY contra antígenos específicos de péptidos y proteínas, de virus (rotavirus, enterovirus, picornavirus, arbovirus, paramixovirus, potivirus y adenovirus), de bacterias ( Escherichia coli enterotoxigénica y enteropatógena, Brucella abortus) y de algunos parásitos ( Echinococcus granulosus, Naegleria fowleri, Plasmodium falciparum, Sarcocystis gigantae, Toxoplasma gondii y Trypanosoma brucei brucei) (9-13).

La producción de anticuerpos policlonales contra agentes infecciosos requiere de animales de laboratorio, generalmente, conejos, que deben ser sangrados periódicamente para su obtención. Como una alternativa menos invasiva se han utilizado gallinas, debido a que la sangría puede ser reemplazada por la recolección de huevos (14). Además, el uso de las gallinas para la producción de anticuerpos en contraposición al de mamíferos representa reducción en el número de animales porque éstas producen cantidades más altas de anticuerpos (1500 mg de IgY por mes) que los mamíferos pequeños (200 mg de IgG por mes). Las principales clases de anticuerpos en aves son IgM, IgA e IgG, también llamada IgY. Las aves son una excelente opción para el desarrollo de anticuerpos antimamífero (15-17) y constituyen modelos útiles en la investigación básica de la inmunología, ya que muchas de las funciones de su sistema inmune son similares a las del humano (18).

El propósito de este trabajo fue desarrollar anticuerpos policlonales IgY dirigidos contra aislamientos colombianos de G. duodenalis, hasta la fecha no desarrollados, y evaluar el método de purificación más eficiente para su obtención en términos de reconocimiento de antígeno de Giardia, pureza y concentración (mg/mL).

Se realizó cultivo masivo de una mezcla de trofozoítos de veinticuatro aislamientos colombianos de G. duodenalis (19) provenientes del banco de parásitos del Grupo de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (INS). Se centrifugaron los trofozoítos a 1.400 g a 18°C durante 8 minutos, se lavó el sedimento (parásitos) con solución salina fisiológica estéril (SSFE), se resuspendieron en 1 mL de ésta, se congelaron a -196°C, y se descongelaron a 18°C mediante vórtex. Se sometieron a disrupción por ultrasonido en un equipo Biosonik II A®, a una frecuencia de 20 kHz en tres ciclos de 30 segundos cada uno; se centrifugaron a 1.400 g a 18°C durante 8 minutos y se retuvo el sobrenadante; luego se determinó la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford (20).

Se siguieron las normas internacionales del National Research Council, 1996 (21) y las normas de Cedeño et al., 1994 (22), utilizadas en el Instituto Nacional de Salud para el manejo y mantenimiento de animales. Se utilizaron tres gallinas de la línea Hy Line Brown (23) para el desarrollo de IgY anti- G. duodenalis y una gallina de la misma línea como control.

Se utilizó antígeno de trofozoíto de G. duodenalis con una concentración de proteínas de 4,65 mg/ mL. Se tomaron 10,7 µL de éste para disolverlos con SSFE hasta completar un volumen de 100 µL y, luego, adicionarles 100 µL de adyuvante completo e incompleto de Freund para inóculo inicial e inóculos subsiguientes, respectivamente. Se mezcló el antígeno y los adyuvantes hasta obtener una emulsión homogénea utilizando un vórtex. Se realizó inmunización a tres gallinas en el músculo pectoral a una profundidad de 1 cm con 200 µL del inóculo (que contiene 50 mg de antígeno de Giardia) por sitio, y en cinco sitios diferentes de la gallina con la misma concentración y el mismo volumen (9, 24). La gallina control se inoculó con 200 µL de SSFE. Las inmunizaciones se realizaron a los 0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 días (14,25). Se sangró cada gallina en la vena braquial antes de realizar las inmunizaciones y se recolectaron tres huevos; uno el día anterior, otro el día de la inmunización y el último huevo el día posterior a ésta por cada gallina y en cada etapa del esquema de inmunización. Se realizó un pool con las tres yemas de los huevos recolectados (20 mL) y se utilizaron 4 mL de éste por cada método de purificación de IgY.

Se utilizaron por separado cinco métodos diferentes denominados como M1 (9), M2 (26-28), M3 (29, 30), M4 Estuche comercial (EGGstract® IgY purification system - Promega) y M5 (9, 30); todos ellos tuvieron en común el proceso de deslipidación (D) y el de precipitación (P) de la IgY para su purificación.

Método 1 (M1): precipitación (P) con sulfato de amonio y delipidación (D) con dextrán sulfatocloruro de calcio

Se separó la clara de la yema de huevo y ésta se mezcló en proporción 1:9 v/v con agua destilada. Se ajustó la mezcla a pH 7,0, se congeló a -20°C durante 24 horas, se descongeló a 4°C, se centrifugó a 2.000 g a 4°C durante 20 minutos y se retuvo el sobrenadante. Se precipitó la IgY con sulfato de amonio al 30%, incubado a 18°C mediante agitación constante durante 30 minutos. Se centrifugó a 2.000 g a 4°C durante 20 minutos y se retuvo el sedimento. Se separaron las lipoproteínas de la IgY con dextrán sulfato al 0,2% incubado a 0°C durante 5 minutos, y posteriormente con cloruro de calcio al 0,1%, incubado a la misma temperatura durante 30 minutos. Se centrifugó a 2.000 g a 4°C durante 20 minutos, y el sobrenadante (IgY) se dializó contra solución reguladora de fosfatos (PBS).

Método 2 (M2): deslipidación (D) con dextrán sulfato-cloruro de calcio y precipitación (P) con sulfato de amonio Se separó la clara de la yema de huevo y ésta se mezcló en proporción 1:9 v/v con agua destilada.

Se ajustó la mezcla a pH 7,0, se congeló a -20°C durante 24 horas, se descongeló a 4°C, se centrifugó a 10.000 g a 4°C durante 20 minutos y se retuvo el sobrenadante. Se separaron de la IgY las lipoproteínas con dextrán sulfato al 10% incubando a 0°C durante 5 minutos y, posteriormente, con cloruro de calcio al 11,1%, incubando a la misma temperatura durante 30 minutos. Se centrifugó a 2.000 g a 4°C durante 20 minutos, se retuvo el sobrenadante y se precipitó la IgY con sulfato de amonio al 30%, incubando a 18°C mediante agitación constante durante 30 minutos. Se centrifugó a 2.000 g a 4°C durante 20 minutos, se retuvo el sedimento (IgY), éste se disolvió con PBS en dilución 1:20, y se dializó contra solución reguladora de fosfatos.

Método 3 (M3): deslipidación (D) con cloroformo y precipitación (P) con sulfato de amonio al 50%

Se separó la clara de la yema del huevo. Se separaron los lípidos, mezclando 2 partes de la yema con 3 partes de una solución que contenía 3:1 v/v de PBS y cloroformo. Se incubó la mezcla a 18°C mediante agitación constante durante 15 minutos, se centrifugó a 3.000 g a 4°C durante 20 minutos y se retuvo el sobrenadante. Se precipitó la IgY con sulfato de amonio al 50%, incubado a 4°C mediante agitación constante durante 18 horas, se centrifugó a 3.000 g a 4°C durante 20 minutos, se retuvo el sedimento (IgY), éste se disolvió con 1 mL de PBS, y se dializó contra solución reguladora de fosfatos.

Método 4 (M4): estuche comercial (EGGstract® IgY purification system - Promega)

Se separó la clara de la yema del huevo. Se separaron los lípidos, mezclando 1 parte de la yema con 3 partes de solución A, se incubó la mezcla a 18°C mediante agitación constante durante 5 minutos, se centrifugó a 10.000 g a 4°C durante 10 minutos y se retuvo el sobrenadante. Se precipitó la IgY con solución B en proporción 3:1 v/v, incubando a 18°C durante 5 minutos, se centrifugó a 10.000 g a 4°C durante 10 minutos, se retuvo el sedimento (IgY), y éste se disolvió con PBS en un volumen igual de la yema al inicial.

Método 5 (M5): deslipidación (D) con cloroformo y precipitación (P) con sulfato de amonio al 30%

Se separó la clara de la yema del huevo. Se separaron los lípidos, mezclando 2 partes de la yema con 3 partes de una solución que contenía 3:1 v/v de PBS y cloroformo. Se incubó la mezcla a 18°C mediante agitación constante durante 15 minutos, se centrifugó a 3.000 g a 4°C durante 20 minutos y se retuvo el sobrenadante. Se precipitó la IgY con sulfato de amonio al 30%, incubando a 4°C mediante agitación constante durante 18 horas, se centrifugó a 3.000 g a 4°C durante 20 minutos, se retuvo el sedimento (IgY), éste se disolvió con 1 mL de PBS, y se dializó contra solución reguladora de fosfatos.

Se determinó mediante inmunodifusión (ID), contrainmunoelectroforesis (CIE) e inmunoelectrotransferencia ( Western blot).

Inmunodifusión

Se elaboraron dos geles de agarosa al 1,3%. El primer gel con solución salina estéril (SSE) 0,15 M para confrontar antígeno de Giardia con IgY anti- Giardia presente en el suero de gallina, y el segundo gel con 1,5 M de SSE para dirigir IgY anti-parásito purificada a partir de yema de huevo contra antígeno del parásito. Se eliminaron las bandas inespecíficas con citrato de sodio al 5% y a las 72 horas se colorearon las bandas correspondientes a la unión antígeno-anticuerpo con azul de Coomassie (28,31).

Contrainmunoelectroforesis

Se preparó un gel de agarosa al 1,3% (Sigma tipo IV®) con solución reguladora de acetato de sodio - ácido acético pH 5,6. Se realizaron diluciones seriadas al medio de la IgY anti-parásito, que fueron confrontadas con el antígeno de trofozoíto de G. duodenalis mediante CIE a 51 voltios, a una temperatura de 4°C durante 3 horas, para determinar la dilución máxima a la cual precipita el complejo. Se eliminaron las bandas inespecíficas con citrato de sodio al 5% y se colorearon con azul de Coomassie (32).

Inmunoelectro transferencia (Western blot)

Se realizó mediante el procedimiento descrito por Laemmli (33) y Towbin et al. (34). Se utilizó antígeno de trofozoítos de G. duodenalis con una concentración de (0,8 mg/mL). Se dispensaron 28 µg de antígeno en el carril y se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE (12,5%) con y sin el agente reductor 2-mercaptoetanol (2-ME) y, luego, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (MNC) mediante Western blot a una temperatura de 4°C, con una corriente de 200 mA y 130 voltios durante 2 horas. Se verificó la transferencia de proteínas con rojo Ponceau S.Se bloqueó la MNC con leche descremada/PBS- Tween 20 al 0,1% (PBS-T) a 18°C durante una hora.

Se confrontaron las proteínas de G. duodenalis presentes en la MNC con IgY anti-parásito (1:400) de las gallinas inmunizadas y de la gallina control independientemente, incubando a 18°C durante 18 horas, tiempo después del cual se adicionó anti-IgY unida a fosfatasa alcalina (Promega®) en dilución 1:10.000. Para el reconocimiento de antígenos de trofozoíto de G. duodenalis por la IgY anti-parásito purificada a partir de yema de huevo se adicionó 5-bromo 4-cloro 3-indol fosfato (BCIP) y azul de nitrotetrazolio (NBT).

Se determinó la pureza de IgY mediante SDSPAGE (26,27,35-39). Se elaboraron el gel concentrador de poliacrilamida (5%) y los geles separadores al 7,5% sin 2-ME y al 12,5% con 2-ME. El marcador de peso molecular, la albúmina sérica bovina (BSA) (1 mg/mL) y la IgY (1:10) se sometieron a electroforesis bajo las siguientes condiciones: temperatura, 18°C; amperaje, 35 mA; voltaje, 75 voltios; duración, 45 minutos, Los geles obtenidos se colorearon con azul de Coomasie.

La concentración de IgY se determinó mediante espectrofotometría y densitometría y el porcentaje de recuperación por esta última, como se describe a continuación.

Espectrofotometría

Se estableció, por triplicado, el valor de la densidad óptica de la IgY (1:10) a una longitud de onda de 280 nm con un espectrofotómetro (Beckman modelo DU 640) (40). Se determinó la concentración en mg/mL de la IgY promediando los 3 valores de densidad óptica, multiplicando el promedio por el factor de dilución y dividiendo este producto por el coeficiente de extinción de la IgY disuelta en PBS 0,01M, que es de 13,2 (40,41).

Densitometría

Se digitalizaron los geles procesados mediante SDS-PAGE que contenían tanto la IgY 180 kd como sus cadenas liviana y pesada, de 30 y 68 kd, respectivamente. Se utilizó el programa para procesamiento y análisis de imágenes «ImageJ», (http://rsbweb.nih.gov/ij/); se determinó la intensidad relativa de color de la banda patrón de BSA, y las correspondientes a la IgY total (180 kd) y sus cadenas pesada y liviana (68 y 30 kd), así como las de las áreas contiguas a cada una de ellas (ruido de fondo). La diferencia de la intensidad relativa de estas bandas con la del ruido de fondo determinó el valor neto de la intensidad de color del patrón y de la IgY. La concentración de la IgY se definió como el cociente de la intensidad relativa neta de la IgY y la intensidad relativa neta del patrón. Se realizó control de calidad a la determinación de la concentración (mg /mL) de la IgY recuperada por cada uno de los métodos de purificación utilizados, y por el que presentase el mayor título en la evaluación inmunoquímica, sometiéndola a SDS-PAGE.

Se determinó por separado el porcentaje de recuperación de la IgY obtenida en cada uno de los métodos de purificación (M1-M5), dividiendo el valor de la intensidad relativa de la inmunoglobulina entre la suma de las intensidades relativas de todas las bandas obtenidas por SDS-PAGE y multiplicando por 100 los valores obtenidos.