Ángela Patricia Guerra ¹, Angélica Knudson ², Rubén Santiago Nicholls ², John Alexander Galindo ¹, Zaava Ravid 1, Sonia Rahirant ¹, Nidia Duarte ¹, Jacqueline Chaparro-Olaya ¹, Moisés Wasserman ³

1 Laboratorio de Bioquímica y Biología Celular, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.

Durante los años 2002 a 2004 se recolectaron 123 muestras de sangre de pacientes con malaria en el marco de un estudio de eficacia a la cloroquina para el tratamiento de la malaria no complicada por P. falciparum, siguiendo los protocolos estandarizados por la OMS y la OPS (22), con algunas modificaciones en los criterios de inclusión. Así, se seleccionaron pacientes de 2 o más años de edad que presentaran malaria no complicada con una parasitemia en el rango de 500 a 5.000 formas asexuales/µl de sangre.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud y presentado, discutido y aprobado por parte de las autoridades departamentales de salud de los sitios en donde se realizó el trabajo de campo (23). Mediante la firma de un consentimiento escrito, los pacientes o los padres (o adultos responsables) en el caso de menores de edad, aceptaron voluntariamente participar en el estudio (24).

Antes de iniciar el tratamiento (día 0), a todos los pacientes se les tomó una muestra de sangre que se recolectó en círculos de papel filtro (Whatman 3 M) de 1 cm de diámetro. Además, al 44% (n=49) de los pacientes que presentaron falla terapéutica al tratamiento con cloroquina se les tomó una segunda muestra el día de la falla. La respuesta terapéutica de estos pacientes se clasificó en dos categorías: falla terapéutica precoz del tratamiento y falla terapéutica tardía del tratamiento (22).

Se tomó la mitad del círculo del papel filtro impregnado con la sangre del paciente, se resuspendió en saponina al 0,5% (Sigma) y se incubó a 4°C durante toda la noche. El tubo con la muestra se centrifugó a 12.000 g durante 3 minutos, se lavó tres veces con solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) y, luego, se resuspendió en Chelex-100 (Bio-Rad), incubando primero a 56°C durante 15 minutos y, luego, a 100°C durante 10 minutos. Se recuperó el AND presente en el sobrenadante, se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -20°C (18,25).

Las infecciones se clasificaron en simples o mixtas con base en la detección de uno (infección simple) o más (infección mixta) alelos de cada gen en cada muestra evaluada (19). Una muestra se consideró como simple cuando en los ensayos de PCR se produjo señal sólo para un alelo del gen msp1 y sólo para un alelo del gen dhfr.

Los productos de PCR para los dos marcadores genéticos probados fueron resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñidos en solución acuosa de 1 µg/ml de bromuro de etidio, visualizados sobre luz UV y analizados por el programa One-Dscan one-dimensional electrophoresis (Scanalytic Fairfax, VA). Se creó una base de datos en Microsoft Excel (Office 2000 para Windows) en la que se registró la información de cada paciente. Para todos los análisis se calcularon los intervalos de confianza del 95% (IC 95%).

En el estudio se incluyeron 52 pacientes de Tierralta, 53 de Puerto Libertador, 10 de La Carpa y 8 de Casuarito, para un total de 123 pacientes. Ciento doce pacientes no respondieron al tratamiento con cloroquina, 46 con falla terapéutica tardía y 66 con falla terapéutica precoz.

Se detectaron las 3 formas alélicas del bloque 2 del gen msp1 (MAD20, K1 y RO33) y, en todos los casos, el tamaño del producto de PCR obtenido para el alotipo K1 fue de 210 pb, aproximadamente; el del alotipo MAD20 fue de 150 pb, aproximadamente; y el del alotipo RO33 fue de 190 pb, aproximadamente. Se encontró que en el total de la población estudiada la frecuencia de MAD20 fue de 95,9% (118/123) (IC 95%: 90,8 a 98,7), la de K1 fue de 6,5% (8/123) (IC 95%: 2,8 a 12,4) y la de RO33 fue de 2,4% (3/123) (IC 95%: 0,5 a 6,9). El alotipo MAD20 se presentó con una frecuencia de 100% en La Carpa y en Puerto Libertador; de 92,3% (48/52) (IC 95%: 81,5 a 97,9) en Tierralta, y de 87,5% (7/8) (IC 95%: 47,3 a 99,7) en Casuarito. El alotipo K1 se encontró en Tierralta y en Casuarito con frecuencias de 11,5% (6/52) (IC 95%: 4,4 a 23,4) y 25% (2/8) (IC 95%: 3,2 a 65,1), respectivamente. No se encontró el alotipo K1 en La Carpa ni en Puerto Libertador. El alelo RO33 se halló en tres de los sitios estudiados: en Tierralta, con una frecuencia de 1,9% (1/52) (IC 95%: 0,05 a 10,3); en Puerto Libertador, también con una frecuencia de 1,9% (1/53) (IC 95%: 0,05 a 10,1), y en Casuarito con una frecuencia de 12,5% (1/8) (IC 95%: 0,3 a 52,7).

Para el gen dhfr, en las 123 muestras analizadas se detectó el alotipo mutante N108. Se observó también una frecuencia de 34,1% (42/123) (IC 95%: 25,8 a 43,2) para el alotipo silvestre S108 y de 3,2% (4/123) (IC 95%: 0,9 a 8,1) para el alotipo mutante T108. La presencia del alotipo S108 se observó en todos los sitios de estudio a excepción de Casuarito, y la mutación T108 se observó únicamente en Tierralta y Puerto Libertador.

De las 123 muestras, 76 (61,8%; IC 95%: 52,6 a 70,4) correspondieron a infecciones simples y 47 (38,2%; IC 95%: 29,6 a 47,4) a infecciones mixtas. Entre las infecciones simples se encontraron 2 genotipos, MAD20/N108 con una frecuencia de 60,2% (74/123) (IC 95%: 50,9 a 68,9) y K1/N108 con una frecuencia de 1,6% (2/ 123) (IC 95%: 0,2 a 5,8), y para las infecciones mixtas hubo 9 combinaciones distintas, siendo la de mayor frecuencia la MAD20/N108-S108 con 30,2% (37/123) (IC 95%: 22,1 a 39). Las 8 combinaciones restantes fueron MAD20/N108- T108-S108 y MAD20-K1/N108, con una frecuencia de 1,6% cada una (2/123) (IC 95%: 0,2 a 5,8), y MAD20/N108-T108, MAD20-RO33/N108, MAD20- K1-RO33/N108-S108, K1/N108-S108, K1/N108- S108-T108 y K1-RO33/N108, con una frecuencia cada una de 0,8% (1/123) (IC 95%: 0,02 a 4,4).

Variabilidad genética de la infección por P. falciparum en el tiempo

Se evaluó el 44% de las muestras de los pacientes que presentaron falla al tratamiento con cloroquina (n=112); así, se analizaron 49 muestras pareadas (tanto del día 0 como del día de la falla) con los marcadores msp1 y dhfr. Cuando se genotipificaron las muestras del día de la falla con msp1 (bloque 2) sólo se obtuvo amplificación en 42 muestras, y cuando se utilizó dhfr (codón 108) sólo hubo productos de PCR en 23 muestras; con el resto de las muestras no se logró amplificar ninguna de las formas alélicas. Teniendo en cuenta lo anterior, sólo 22 muestras pudieron analizarse en forma pareada: 8 provenían de Tierralta, 6 de Puerto Libertador, 3 de La Carpa y 5 de Casuarito.

Los resultados de las cuatro localidades indican que las poblaciones naturales de P. falciparum que circulan en estas áreas son muy homogéneas. Aunque se encontraron nueve genotipos distintos distribuidos entre los 47 pacientes con infección mixta, sólo detectamos 3 alelos para el gen msp1 (MAD20 de 150 pb, aproximadamente, RO33 de 190 pb y K1 de 210 pb) y los tres alelos posibles (S108, N108 y T108 de 339 pb) para el codón 108 del gen dhfr.

Estos resultados concuerdan con los de un estudio que se realizó en la región de Urabá-bajo Cauca con muestras de pacientes recolectadas entre los años 2000 y 2001, en el cual la cantidad de alelos diferentes para los genes msp1, msp2 y glurp fue muy baja; MAD20 de 147 pb fue el único alelo encontrado para msp1 (20). Además, otro estudio realizado en una localidad de la Costa Pacífica colombiana con muestras tomadas entre julio y septiembre de 1997, reportó 4 alelos para msp1; MAD20-1 (218 pb), MAD20-2 (238 pb), K1 (210 pb) y RO33 (190 pb) (19). En nuestros resultados, al igual que en los de Montoya y Gómez, el alelo predominante para el gen msp1 fue MAD20. Aunque a simple vista los resultados de los tres estudios muestran alelos de diferentes tamaños, situación que se podría interpretar como variación y cambio de alelos en el tiempo, debe tenerse cautela en el análisis de estas observaciones, ya que se tiene evidencia del alto grado de variabilidad entre laboratorios cuando se comparan los resultados de distintos estudios epidemiológicos (27). Resulta interesante que al comparar los resultados de los tres estudios con los deSnewin (17), se observa cómo han ido cambiando las poblaciones de parásitos a lo largo del tiempo. Así, antes de 1991 el alelo predominante en Colombia era RO33, con una frecuencia de 83,8%, seguido por MAD20 con 48,3% y K1 con 9,6%. De la misma forma, el alelo K1 ha disminuido progresivamente su frecuencia como lodemuestran nuestros hallazgos (6,5%) y los de Montoya (0%). Gómez, sin embargo, reportó una frecuencia alta para K1 (11%), pero esto pudo corresponder a una propagación de tipo epidémico teniendo en cuenta que las muestras de los pacientes se tomaron durante un brote de malaria en una población residente en un área pequeña y aislada, donde la tasa de migración era baja (14,28).

Nuestros resultados y, en general, los de otros autores colombianos contrastan fuertemente con los de países africanos, donde se pueden encontrar un sinnúmero de alelos para msp1, como fuereportado en estudios realizados en Uganda, donde se encontraron 45 alelos distintos (26 para K1, 13 para MAD20 y 6 para RO33) (10); en Senegal, donde se detectaron 36 alelos (21 para K1, 13 para MAD20 y 2 para RO33) (29), y en Nigeria, que presentó 9 alelos diferentes (4 para K1, 2 para MAD20 y 2 para RO33) (30).

El escaso polimorfismo encontrado en nuestros resultados coincide con lo reportado por Sallenave- Sales en dos localidades brasileras donde detectaron cinco alelos para el gen msp1 (2 para K1, 2 para MAD20 y 1 para RO33) (31) y por Haddad en Honduras, quien encontró 4 alelos (2 para K1 y 2 para MAD20) (32).

Ya que nuestros resultados aportan información de tres regiones geográficas distantes unas de otras y donde la población humana mantiene altas tasas de movilidad debido a las condiciones sociales y económicas, estos aspectos sugieren que el escaso polimorfismo alélico encontrado es la condición general en Colombia, a pesar de la posible migración de poblaciones humanas entre regiones endémicas de malaria.

Aunque Colombia es considerada una zona de baja transmisión comparada con otras regiones en África y Asia, la localidad de Tierralta presenta índices parasitarios anuales de más de 10, mayores que el promedio nacional, lo que la define como una región de alto riesgo de transmisión de malaria en el país (21). Esto sugiere que en Tierralta es más probable encontrar un mayor número de alelos y, por ello, a diferencia de las otras localidades, se presenta con mayor frecuencia el alelo K1. Sin embargo, existen otros factores que pueden afectar la estructura de las poblaciones de parásitos como son el esquema terapéutico empleado, la movilidad de las poblaciones humanas, las características ecoepidemiológicas de la región y la inmunidad del hospedero (8,9).

La complejidad de la infección también se determinó utilizando cada gen por separado; así, cuando sólo se usó msp1, se obtuvo un porcentaje de infecciones simples de 96%, y de mixtas de 4%. Cuando se utilizó sólo dhfr, el porcentaje de infecciones simples fue de 65% y el de mixtas de 35%. Aunque, los genes que codifican para antígenos de superficie se utilizan para llevar a cabo los estudios de diversidad genética, en este trabajo se puede observar que los resultados con el gen dhfr aportaron una mayor información para determinar la complejidad de la infección malárica. Lo anterior sugiere que, a diferencia de los estudios realizados en zonas de alta transmisión, donde algunos autores aconsejan el uso de un solo gen para genotipificar muestras del día 0 y del día de la falla al tratamiento (10,30), en zonas de baja transmisión es necesario el uso de varios marcadores moleculares para establecer realmente la diversidad genética de la población de parásitos circulantes. El uso del marcador dhfr permitió detectar 42 infecciones que contenían, además del alelo mutante N108, el alelo silvestre S108. Casuarito, localidad que tuvo el mayor porcentaje de infecciones simples, no presentó ninguna muestra con el genotipo S108. Esta situaciónpodría explicarse por el hecho de que en estalocalidad fronteriza con Venezuela posiblemente la presión ejercida con sulfadoxina-pirimetamina (S-P) ha ido eliminando gradualmente el genotipo silvestre.

Aunque la mutación puntual N108 se considera clave en el desarrollo de resistencia a los antifolatos, se necesita un efecto acumulativo de mutaciones en los genes dhfr y dhps para que ésta se desarrolle (33,34). En Suramérica se han observado niveles importantes de resistencia a S-P relacionados con ciertas mutaciones puntuales en estos genes. Así, en Venezuela, país donde se presentan altos niveles de resistenciaclínica a S-P, la frecuencia de la mutación N108 es del 96%. Estos genotipos resistentes han tenido una difusión masiva, debido a que la propagación clonal ha facilitado su dispersión, aumentando la diseminación de la multirresistencia a antimaláricos (35-37). La prevalencia y alta frecuencia de la mutación N108 en las poblaciones colombianas estudiadas (18, 19,34,38), puede ser una señal de alerta que indica la necesidad de vigilar la aparición de mutaciones en otros codones en los genes dhfr y dhps.

Al comparar los resultados del día 0 y del día de la falla, 15 de 22 muestras conservaron el mismo genotipo, lo cual demuestra la permanencia de las poblaciones de parásitos a lo largo de la infección. Esta permanencia de las poblaciones puede darse por varios factores que permiten la selección de cepas, entre ellos, la presión con medicamentos, la cual genera resistencia (8, 39). Los resultados de los estudios de eficacia in vivo de tratamiento de la malaria no complicada por P. falciparum con cloroquina, a partir de los cuales se tomaron las muestras para el presente estudio de diversidad genética, mostraron un porcentaje global de falla terapéutica de 93,4%, con la presencia del alelo mutante K76T en el gen pfcrt en todas las muestras de P. falciparum estudiadas tanto en el día 0 como en el día de la falla (datos sin publicar). Esto indica que las poblaciones de parásitos con los distintos alelos de msp1 o de dhfr son resistentes a cloroquina y predominan ampliamente en estas áreas, limitando la circulación de otras poblaciones. Otro de los mecanismos de selección es la evasión del parásito a la respuesta inmune, gracias a la capacidad que tienen ciertas poblaciones de evadir la inmunidad del hospedero activando los mecanismos de variación antigénica, lo cual determina las poblaciones circulantes en sangre periférica y puede contribuir a un aumento de la virulencia (40).

En las siete muestras restantes, a diferencia del caso anterior, se detectaron nuevas poblaciones de parásitos. Estos casos se consideran recrudescencias y pertenecen al tipo en el cual se observa, en infección simple o mixta, la presencia de bandas idénticas en las muestras pre y postratamiento, con la aparición de una banda adicional después del tratamiento (10,41). Se descartó la posibilidad de una reinfección porque todas las fallas (22) se dieron dentro de los primeros 14 días de tratamiento (datos sin publicar), y la tasa de picadura del vector no es lo suficientemente alta para que ocurra este evento (42).

En Puerto Libertador dos muestras del día 0 con el genotipo K1/N108-S108 sufrieron un cambio en el día de la falla: desapareció el alelo K1 y se detectó MAD20. Esta desaparición de alelos se puede atribuir a mecanismos que incluirían el secuestro vascular de parásitos, la competencia de poblaciones, la respuesta inmune específica del huésped o la presencia de gametocitemia, lo que puede confundir los análisis de genotipificación (10,43), ya que los resultados pueden ser clasificados erróneamente. También podría atribuirse a limitaciones en la sensibilidad de la PCR (10,44); así, cuando se tienen diferentes poblaciones y una presenta menor densidad parasitaria con respecto a las otras, la PCR no tiene la suficiente sensibilidad para detectar la cepa que está en menor cantidad (45). Las limitaciones en la sensibilidad de la PCR, la presencia de inhibidores (por ejemplo hemoglobina) de la PCR en el ADN extraído, la baja eficiencia en la extracción del ADN o el efecto del almacenamiento y la metodología de recolección de las muestras (temperatura, humedad, calidad del papel de filtro) (46,47) podrían explicar la ausencia de amplificación en las 27 muestras correspondientes al día de la falla terapéutica.

En conclusión, las poblaciones de parásitos analizadas se caracterizaron por ser homogéneas genéticamente, observándose una amplia circulación de parásitos que presentan una alta frecuencia del alelo MAD20 en msp1 y de la mutación N108 en el gen dhfr. Estos resultados contribuyen al entendimiento de la transmisión de la malaria en Colombia y podrían ser útiles para la vigilancia y el control de la resistencia de parásitos a los antimaláricos.

Los autores manifestamos expresamente que durante la realización del presente trabajo no existió conflicto de interés alguno que pudiera haber afectado los resultados obtenidos.

Este estudio fue cofinanciado con recursos del Fondo de Investigaciones en Salud, Ministerio de la Protección Social-Colciencias, Proyecto Código 2104-04-11813, Contrato No. RC 134-2002, y del Instituto Nacional de Salud.

John Alexander Galindo estuvo vinculado a este proyecto gracias al Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores de Colciencias, convenio interadministrativo especial de cooperación No. 92-2003 Colciencias-INS y el contrato de prestación de servicios profesionales No. 014-2004.

Correspondencia:

Ángela Patricia Guerra, Laboratorio de Bioquímica y Biología

Celular, Instituto Nacional de Salud, Avenida calle 26 No. 51-60, Bogotá, D.C.

Teléfono: 2 207700, ext. 425

Recibido:16/09/05; aceptado: 27/12/05

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