Brian Alejandro Suárez, Claudia Liliana Cuervo, Concepción Judith Puerta

Laboratorio de Parasitología Molecular, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D. C., Colombia

Recibido: 05/03/07; aceptado: 29/05/07

Introducción. Con base en la amplificación del ADN de los minicírculos del cinetoplasto y de los genes miniexón, Trypanosoma rangeli ha sido clasificado en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+).

Objetivo. Comparar la región intergénica de los genes H2A entre cepas KP1(+) y KP1(-) de T. rangeli, con el fin de aportar evidencias a dicha división.

Materiales y métodos. Se amplificó, clonó y determinó la secuencia de la región intergénica de los genes h2a de las cepas KP1(-) Tre y 5048 y de la cepa Choachí KP1(+). Dichas secuencias, junto con las reportadas para las cepas C23 KP1(-)y H14 KP1(+), fueron utilizadas para la reconstrucción de árboles filogenéticos basados en los métodos de neighbor-joining, máxima parsimonia y máxima verosimilitud, utilizando la cepa Y de Trypanosoma cruzi como grupo raíz externo.

Resultados. Se evidenció heterogeneidad intraespecífica en el tamaño de la región estudiada, soportados por valores bootstrap de 85% (neighbor-joining), 66% (máxima parsimonia) y 57% (máxima verosimilitud), los resultados indican que las cepas KP1(-) se agrupan aparte, claramente diferenciadas de las cepas KP1(+), las cuales presentan una mayor heterogeneidad intraespecífica en tamaño y secuencia. Además, se encontró mayor proximidad filogenética entre T. rangeli y T. cruzi que entre T. rangeli y Trypanosoma brucei.

Conclusiones. Los análisis filogenéticos basados en la región intergénica de los genes h2a de las cepas estudiadas apoyan la división de T. rangeli en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+). Sin embargo, se requiere estudiar un mayor número de cepas para confirmar estos hallazgos.

Palabras clave: Trypanosoma/genética, ADN intergénico, genes, histonas/genética, secuencia conservada, filogenia.

Introduction. Trypanosoma rangeli has been classified in the KP1(+) and KP1(-) subpopulations, based on the mini-exon gene and kinetoplast DNA minicircle amplification profiles.

Objective. The intergenic region of the histone h2a gene was compared between KP1(+) and KP1(-) strains of T. rangeli to substantiate this classification.

Materials and methods. The amplification, cloning and sequencing of the h2a gene intergenic region was undertaken for the Tre and 5048 KP1(-)strains for comparison with the Choachí KP1(+) strain. These sequences, along with those previously reported for the KP1 (+) and KP1 (-) H14 and C23 strains, were used to reconstruct phylogenetic trees based on the "neighbor-joining", maximum parsimony and maximum likelihood methods. The Y strain of Trypanosoma cruzi was chosen as the outgroup.

Results. Intra-specific heterogeneity was observed in the size of the gene region under study, supported by bootstarp values of 85% (neighbor-joining), 66% (maximum parsimony) and 57% (maximum likelihood). The KP1(-) strains were grouped apart, clearly differentiated from the KP1(+) strains. The latter demonstrated a higher intra-specific heterogeneity, both in sequence length and composition. In addition, a closer phylogenetic relationship between T. rangeli and T. cruzi was found to be more closely related to one another than to T. rangeli and Trypanosoma brucei.

Conclusion. Phylogenetic analyses of analyzed strains based on the intergenic region of the h2a genes supported the T. rangeli grouping in two major subpopulations known as KP1(+) and KP1(-) strains. However, a higher number of strains are needed to confirm this finding.

Key words: Trypanosoma/genetics, DNA, intergenic, genes, histones/genetics, conserved sequence, phylogeny.

Trypanosoma rangeli es un protozoario hemoflagelado que infecta al hombre, los animales silvestres, los domésticos y los insectos vectores en distintas regiones del centro y sur de América (1). Hasta el momento, T. rangeli es considerado como un parásito no patógeno para el humano, contrario a lo que sucede con Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas (2). No obstante, T. rangeli, además de distribuirse en regiones geográficas endémicas para la enfermedad de Chagas, comparte vectores y reservorios con T. cruzi, presentándose infecciones mixtas tanto en el hospedero vertebrado como en el invertebrado (1,2). Lo anterior, sumado a la presencia de reacciones serológicas cruzadas entre ambos tripanosomas (3), dificultan el diagnóstico específico de la infección chagásica (1). Por lo tanto, resulta de gran interés el estudio de las características genotípicas de T. rangeli con el fin de dilucidar el panorama evolutivo, filogenético y biológico de dicho parásito.

De esta forma, utilizando herramientas bioquímicas y moleculares como el estudio de las isoenzimas del parásito (4), la amplificación aleatoria de fragmentos de ADN polimórfico (4) y la amplificación del gen miniexón (5), se encontró que las cepas procedentes de Centroamérica y del norte de Suramérica, presentaban variabilidad con respecto a las cepas oriundas de Brasil. Estudios posteriores demostraron, mediante la caracterización de 37 cepas de T. rangeli procedentes de Honduras, Panamá, Colombia, Venezuela y Brasil, que éstas se clasifican independientemente de su origen geográfico, en dos grupos molecularmente definidos como grupo 1, o cepas KP1(-), y grupo 2, o cepas KP1(+), según la presencia o ausencia del minicírculo KP1 en el ADN del cinetoplasto (6).

Mas adelante, Vallejo et al, (7) y Urrea et al. (8), utilizando como marcadores el ADN del cinetoplasto y el gen miniexón, evidenciaron en sus estudios la asociación de los dos grupos 1 y 2 de T. rangeli con las diferentes líneas evolutivas de vectores del género Rhodnius. Es así como las cepas KP1(+) se asocian al grupo Prolixus (R. prolixus, R. neglectus, R. nasutus, R. domesticus y R. robustos), mientras que las cepas KP1(-) se asocian con el grupo Pallescens (R. pallescens, R. ecuadoriensis y R.colombiensis). Datos que están de acuerdo con la teoría de Schofield y Dujardin (9), según la cual las especies de Rhodnius sufrieron un proceso de radiación en Suramérica a partir de especies ancestrales semejantes a R. pictipes en la región del Amazonas, de la cual se originaron tres líneas adaptativas del vector representadas por las formas forestales (R. pictipes, R. stali, R.brethesi, R. paraensis y R. dalessandroi), el grupo Prolixus, en el cual se incluyen los vectores que se distribuyen al oriente de la región Andina y el complejo Pallescens, conformado por vectores distribuidos a lo largo de la Cordillera de los Andes. Además, los estudios de la amplificación aleatoria de fragmentos de ADN polimórfico de cepas aisladas de R. prolixus, R. pallescens, R. colombiensis y R. ecuadoriensis, muestran que estas cepas se agrupan no sólo de acuerdo con la presencia del minicírculo KP1, sino según la especie de Rhodnius de la cual proceden (10). Se plantea, además, que el vector actúa como un filtro biológico de las subpoblaciones del parásito (11).

Teniendo en cuenta que ensayos previos de reacción en cadena de la polimerasa de baja astringencia usando un único iniciador (LSSP-PCR) sugieren que la región intergénica del gen H2A puede constituir un marcador diferencial de cepas KP1(-) y KP1(+) del parásito (12), en el presente trabajo se utilizó dicha secuencia para aportar evidencias moleculares basadas en un gen nuclear que soporten la división de T. rangeli en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+).

Para la amplificación de los fragmentos de interés se utilizaron los ADN genómicos disponibles en la genoteca del Laboratorio de Parasitología Molecular de la Pontificia Universidad Javeriana, correspondientes a las cepas KP1(-): Tre Morales et al., 2002 (13) y 5048 MHOM/CO/99/5048, Morales et al., 2002 (13) y la cepa Choachí IRHO/CO/82/Ch, Schottelius, 1987(14) KP1(+) de T. rangeli. Los iniciadores empleados, H14 IntF (5’-TAGATACACCTGGGGGAACG 3’) y H14 IntR (5’-TCACAGCTGCAACAAGCAAAC 3’-) (12), amplifican la región intergénica del gen H2A de la cepa H14 comprendida entre los nucleótidos 451 a 764 (No. de acceso al GenBank AY147905).

Para la reacción de amplificación se utilizaron 125 ng de ADN genómico del parásito, 20 pmoles de cada uno de los iniciadores, 2,5 µl de solución tampón de reacción 10X (10 mM Tris-HCl pH 9,0 50 mM KCl, y 0,1 % de tritón X-100), 2,6 U de la enzima High Fidelity PCR System (Roche), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dioxinucleótido trifosfatado (dNTPs), en un volumen final de reacción de 25 µl. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador MJ Research PTC-100, usando el siguiente perfil de amplificación: desnaturación inicial a 95°C/30 s, seguida de 35 ciclos 95°C/30 s, 65°C/40 s y 72°C/40 s, con extensión final a 72°C por 5 min.

El producto de amplificación se visualizó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio (15). Los fragmen-tos de amplificación de interés fueron escindidos y purificados del gel usando el estuche comercial QIA-Gel extraction kit (QIAGEN), para su posterior clonación en el plásmido vector pGEM®-T Easy (Promega) (15). Los clones seleccionados con base en la prueba de blancas y azules (15), uno por cepa, fueron sometidos a extracción del ADN plasmídico total mediante el estuche comercial Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega); se determinaron dos veces las secuencias de ambas cadenas del ADN del inserto presente en los mismos mediante procedimientos estándares del servicio suministrado por la compañía Macrogen® (Corea), utilizando los iniciadores universales M13F y M13R.

Para confirmar que las secuencias obtenidas para las cepas Tre, 5048 y Choachí codificaran para la región intergénica de los genes h2a, éstas fueron comparadas con las reportadas en la base de datos GenBank usando la herramienta BLAST-N (16). Posteriormente, dichas secuencias, junto con las previamente reportadas para las cepas C23 (No. de acceso al GenBank (AF169130) y H14 (No. de acceso al GenBank AY147905) de T. rangeli e Y de T. cruzi (No. de acceso al GenBank AF167074), se alinearon usando el programa CLUSTAL-W versión 1.81 (17), ajustándose manualmente con el programa Bioedit Sequence Alignment Editor (18). La reconstrucción de los árboles se realizó mediante los métodos de neighbor-joining (19) y máxima parsimonia utilizando los programas MEGA 3.1 (20) y PAUP 4.0 con valores bootstrap obtenidos a partir de 1.000 pseudorréplicas y el método de máxima verosimilitud usando el programa PAUP 4.0 (21). Para el árbol de neighbor-joining se usó el modelo de sustitución Kimura de 2-parámetros (22), para el de máxima parsimonia, se usó el nivel 1 de la opción close-neighbor-interchange (CNI, por sus siglas en inglés) con una adición aleatoria para árboles de 10 réplicas y el de máxima verosimilitud fue realizado mediante búsqueda heurística con valores bootstrap obtenidos a partir de 1.000 pseudorréplicas, siguiendo el modelo de sustitución HKY85 de Hasegawa et al. (23).

Para cada una de las tres cepas en estudio, se obtuvo el fragmento de amplificación del tamaño esperado de alrededor 310 pb (no se muestran los datos), fragmentos que fueron clonados, obteniéndose tamaños de 309, 307 y 324 pb para los insertos de los clones Trec1, c5048-3 y Cho1, derivados de las cepas C23, 5048 y Choachí, respectivamente.

Los análisis BLAST/N de las secuencias obtenidas mostraron porcentajes de similitud de 92% a 99,5% (valor e: 2e-147 a 3e-50) con lo reportado para las cepas C23 y H14 de T. rangeli, y 55,2% (valor e: 3e-05) para la cepa Y de T. cruzi, con lo cual se confirmó que la región intergénica de los genes H2A había sido amplificada y clonada.

Las regiones intergénicas de tripanosomátidos constituyen un blanco interesante de estudio pese a que no tienen funciones codificantes para productos proteicos. Es así como, por ejemplo, se ha reportado que la región 3’ no traducida (la cual hace parte de la región intergénica o espaciadora) de los genes codificantes para la calmodulina, acumula mutaciones entre los diferentes linajes de T. cruzi que hacen posible su distinción mediante métodos filogenéticos (26).

La histona H2A es una proteína conservada evolutivamente, la cual puede presentar organización genómica diferente según la especie y la cepa (27). En T. cruzi se han encontrado diferencias en el número de copias, organización cromosómica y el nivel de expresión de sus mARN (28). Por su parte, en T. rangeli se han observado diferencias en la secuencia al comparar la región intergénica del gen h2a entre dos cepas (12). Por lo tanto, estas secuencias pueden constituir un marcador nuclear útil para la agrupación y diferenciación de distintas cepas de T. rangeli, además de los actualmente postulados como son el ADNk y el gen mini-exón (5-8).

Dentro del anterior contexto, en este trabajo se estudiaron las relaciones filogenéticas entre cepas KP1(+) y KP1(-) de T. rangeli usando como base la región intergénica de los genes codificantes para la histona H2A del parásito. Se detectaron diferencias en el tamaño de los fragmentos amplificados al utilizar los iniciadores H14IntF/R. Se encontró un mayor tamaño en las cepas KP1(+) Choachí y H14 (12) que en las cepas KP1(-) Tre, 5048 y C23 (29), y estas últimas secuencias mostraron una menor dispersión en sus tamaños.

Hubo diferencias caracterizadas principalmente por eventos de inserción/deleción, en los cuales, para el caso de las cepas KP1(+), no existe homogeneidad en dicho polimorfismo ya que en la cepa Choachí existe una inserción de siete nucleótidos de guanina en la posición 166 ausente en la cepa H14. Estos resultados sugieren una mayor heterogeneidad dentro del grupo KP1(+), comparado con las cepas KP1(-). Este hecho, aun cuando debe confirmarse utilizando un mayor número de cepas, concuerda con estudios de cariotipo en los cuales, al analizar los cromosomas de ambas subpoblaciones del parásito mediante electroforesis de campo pulsado, las cepas KP1(+) exhiben heterogeneidad entre sus perfiles de migración, mientras que las cepas KP1(-) presentan un patrón electroforético homogéneo (30).

De especial interés es el hecho de que las regiones intergénicas presentaron variabilidad en su secuencia, principalmente a partir del nucleótido 150, manteniendo bastante conservada su región 5´, en la cual es posible que se encuentren, además de la horquilla 3´ previamente descrita en eucariotes superiores, señales implicadas en la regulación postranscripcional de estos genes, tal como se ha reportado previa-mente para otros genes en tripanosomátidos (31).

Estudios filogenéticos mediante el método de distancia neighbor-joining y los discretos de máxima parsimonia y máxima verosimilitud, permiten dilucidar que las cepas KP1(-) estudiadas constituyen un grupo monofilogenético, distinto al de las cepas KP1(+), sustentado por altos valores bootstrap. Estos resultados apoyan la existencia de las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+) de T. rangeli. Sin embargo, es importante resaltar que se requiere aumentar el número de cepas para generalizar estos hallazgos.

Además, al realizar análisis filogenéticos utilizando secuencias reportadas en el GenBank para T. cruzi, Trypanosoma brucei y L. infantum, entre otras, se evidenció cómo las diferencias en la región intergénica del gen codificante para la histona H2A también permiten distinguir T. rangeli de T. cruzi. Este resultado está de acuerdo con la presencia exclusiva del elemento SIRE (short interspersed repetitive element), en la región 3’ no traducida de estos genes en T. cruzi (32).

Por otro lado, estudios filogenéticos basados en las secuencias de ADN de la subunidad pequeña ribosomal y del espaciador interno transcrito ITS1, mostraron que el grupo monofilogenético que agrupa las cepas de T. rangeli se encuentra más cercano a T. cruzi (subgénero Schyzotrypanum) que a T. brucei (subgénero Trypanozoon) (33). En este sentido, es importante anotar que en este estudio se evidenció una mayor proximidad filogenética entre T. rangeli y T. cruzi que entre T. rangeli y T. brucei, a pesar de que estos dos últimos parásitos son trasmitidos por la saliva del vector (sección salivaria), mientras que T. cruzi se transmite por las heces de los triatóminos (sección stercoraria).

De especial interés es el hecho de que las cepas KP1(+) y KP1(-) de T. rangeli parecen corresponder a dos de los cuatro grupos descritos para T. rangeli por Maia da Silva et al. mediante análisis de la amplificación aleatoria de fragmentos de ADN polimórfico, en concreto a los grupos denominados como A y C, respectivamente (34).

Por lo tanto, se requiere aumentar el número de cepas, incluyendo aislamientos procedentes de diversos orígenes geográficos y hospederos, para confirmar estos hallazgos y dilucidar la posible presencia de otras subpoblaciones del parásito.

Se agradece a Rubén Santiago Nicholls y Marleny Montilla del Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud por proporcionar las cepas de T. rangeli para la constitución de la genoteca; a Gustavo Adolfo Vallejo del Laboratorio de Investigación en Parasitología Tropical de la Universidad del Tolima por la caracterización de las mismas; al Departamento de Sistemas de la Pontificia Universidad Javeriana por su colaboración con la ejecución de los programas computacionales; y a Diana Álvarez de la Pontificia Universidad Javeriana y Felipe Guhl del Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical (CIMPAT) de la Universidad de los Andes, por sus valiosos aportes y comentarios al trabajo.

Los autores manifestamos expresamente que durante la realización del presente trabajo no existió conflicto de interés alguno que pudiera afectar los resultados obtenidos.

Este trabajo fue financiado por la Vicerrectoría Académica de la Pontificia Universidad Javeriana, proyecto No. 1038.

Correspondencia:

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