Gustavo Adolfo Vallejo ¹, Felipe Guhl ², Julio César Carranza ¹, Omar Triana ³, Gerardo Pérez ⁴, Paola Andrea Ortiz ¹, Dairo Humberto Marín ¹, Lina Marcela Villa ¹, Jazmín Suárez ¹, Isaura Pilar Sánchez ¹, Ximena Pulido ¹, Ingrid Bibiana Rodríguez ¹, Leyder Elena Lozano ¹, Daniel Alfonso Urrea ¹, Fredy Arvey Rivera ¹, César Cuba-Cuba ⁵, Jairo Alfonso Clavijo 6

¹Laboratorio de Investigaciones en Parasitología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Ibagué, Colombia.
²Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical (CIMPAT), Universidad de los Andes, Bogotá D.C., Colombia.
³ Laboratorio de Chagas, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
⁴ Grupo de Investigación en Química de Proteínas, Departamento de Química, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D.C., Colombia.
⁵Unidade de Parasitologia Médica e Biología de Vetores, Facultade de Medicina, Universidade de Brasilia, Brasilia, DF, Brasil.
⁶Departamento de Matemáticas y Estadística, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Ibagué, Colombia.

Recibido: 23/06/06; aceptado: 14/07/06

Objetivo. Estudiar las características morfológicas y moleculares de cepas de T. rangeli aisladas de diferentes especies de Rhodnius e inoculadas en diferentes especies de vertebrados.

Materiales y métodos. Se utilizaron 19 cepas de T. rangeli aisladas de R. prolixus, R. pallescens y R. colombiensis en Colombia, R. ecuadoriensis en Perú y R. pallescens en Panamá. Se evaluó el polimorfismo de los tripomastigotes sanguíneos en ratones ICR y se estudió el pleomorfismo de la cepa P53 de T. rangeli KP1(-) inoculada en ratón, marsupial y canino. Se efectuó análisis de ADN polimorfo amplificado aleatorio en 12 cepas aisladas de cuatro especies de Rhodnius.

Resultados. Se observaron tres grupos discretos en la longitud total de los tripomastigotes sanguíneos y la cepa P53 presentó diferencias significativas en el tamaño de los tripomastigotes sanguíneos en ratón, marsupial y canino. El análisis de ADN polimorfo amplificado aleatorio mostró segregación de las cepas en dos ramas correspondientes a las cepas de T. rangeli KP1(+) y T. rangeli KP1(-). De otra parte todos las cepas de T. rangeli KP1(-) se agruparon de acuerdo con las especies de Rhodnius de las cuales fueron aisladas.

Conclusión. Este es el primer estudio que revela una estrecha asociación entre cepas de T. rangeli y las especies de Rhodnius, confirmando que cada especie de Rhodnius transmite al hospedero vertebrado poblaciones del parásito con claras diferencias fenotípicas y genotípicas, lo cual soporta la evolución clonal de estas poblaciones.

Palabras clave: Trypanosoma, Rhodnius, tripanosomiasis / epidemiología, técnica del ADN polimorfo amplificado aleatorio (RAPD), enfermedad de Chagas.

Introduction. Trypanosoma rangeli is a species of trypanosome second to T. cruzi, that is infective to humans in Latin America. Variability in the biological, biochemical and molecular characteristics between different isolates isolates of this parasite have been recorded.

Objective. Morphological and molecular characteristics were recorded from strains of T. rangeli that were isolated from different species of Rhodnius and maintained in different vertebrate species.

Materials and methods. Nineteen strains of T. rangeli were isolated from R. prolixus, R. pallescens and R. colombiensis in Colombia, R. ecuadoriensis in Peru and R. pallescens in Panama. Polymorphism of blood trypomastigotes in ICR mice was evaluated and pleomorphism of P53 strain of T. rangeli KP1(-) inoculated in mouse, marsupial and canine was studied. RAPD analysis (randomly amplified polymorphic DNA analysis) of 12 strains isolated from four species of Rhodnius was performed.

Result. Based on the total length of blood trypomastigotes, three discrete groups were observed. The P53 strain showed significant differences in the size of blood trypomastigotes in mouse, marsupial and canine. RAPD analysis showed that the strains segregated into two branches corresponding to strains of T. rangeli KP1(+) and T. rangeli KP1(-). All strains of T. rangeli KP1 (-) clustered according to the species of Rhodnius from which they were isolated .

Conclusion. These data reveal, for the first time, a close association amongst T. rangeli strains and Rhodnius species, confirming that each species of Rhodnius transmits to vertebrate hosts a parasite population with clear phenotypic and genotypic differences. This is further evidence that supports the concept of clonal evolution of these parasites.

Key words: Trypanosoma, Rhodnius, trypanosomiasis/epidemiology, random amplified polymorphic DNA technique, Chagas disease.

Trypanosoma rangeli es un interesante parásito no patógeno para el hombre, que exhibe particulares características biológicas, entre las cuales se destacan la patogenicidad del parásito para el vector (1-3), la susceptibilidad de las especies de Rhodnius a cepas de T. rangeli del mismo origen geográfico (4,5), la reacción serológica cruzada de T. rangeli con T. cruzi (6,7) y la resistencia de los flagelados a la lisis mediada por el complemento (8), entre otras. Por ello, durante las últimas décadas, T. rangeli ha sido objeto de estudio por parte de varios grupos de investigación que han encontrado en este parásito un importante modelo para conocer los procesos coevolutivos entre parásito-vector y para estudiar la dinámica de la transmisión de subpoblaciones de T. rangeli al hospedero vertebrado (9). De otra parte, existe interés en desarrollar métodos para diferenciar T. cruzi de T. rangeli, debido a que en la mayoría de los países de América Latina estas dos especies se encuentran infectando los mismos vertebrados y vectores, generando dificultades en el diagnóstico morfológico de las dos especies (10) o en el diagnóstico serológico de la infección en los vertebrados (6,7,11).

La variabilidad de las poblaciones de T. rangeli se ha demostrado en las últimas décadas mediante estudios de minisatélites de ADN, los cuales mostraron diferencias genéticas entre las cepas de Santa Catarina y las aisladas en Honduras, Colombia y Venezuela (12). El análisis de polimor-fismos del ADN mitocondrial mostró que el minicírculo de kDNA denominado KP1 se encontró asociado con las cepas de T. rangeli aisladas en Colombia, Honduras y Venezuela, pero no en las cepas aisladas en Santa Catarina al sureste de Brasil (13). Una divergencia genética similar entre estos dos grupos se demostró usando electroforesis de isoenzimas y AP-PCR (14). Una conclusión similar se obtuvo con el análisis del cariotipo molecular de varias cepas de T. rangeli, revelando la existencia de polimorfismo cromosómico (15).

Utilizando amplificación del kDNA, en Colombia y en otros países de América Latina se han detec-tado dos grupos de T. rangeli molecularmente diferentes. Un grupo de cepas aisladas de Rhodnius prolixus presentan tres clases de minicírculos de kDNA denominados KP1, KP2 y KP3 (T. rangeli KP1+), mientras que las cepas aisladas de R. colombiensis presentan solamente dos clases deno-minadas KP2 y KP3 (T. rangeli KP1-) (9,16-18).

Recientemente se caracterizaron 18 cepas de T. rangeli aisladas de glándulas salivares de R. colombiensis, R. pallescens y R. prolixus (18) utilizando dos marcadores independientes: kDNA (17) y el espaciador intergénico del gen mini-exón (19). Los autores observaron que el producto de 380 pb de amplificación del mini-exón siempre se presentó asociado con los productos obtenidos de los minicírculos KP2 Y KP3 de kDNA y el producto de 340 pb del mini-exón siempre se presentó asociado con los productos de los minicírculos KP1, KP2 Y KP3. Existen dos hipótesis alternativas sobre el origen de los dos grupos de T. rangeli; por un lado podría tratarse de grupos con evolución clonal, en la cual la reproducción sexual sería rara o inexistente, o se trataría de un proceso de especiación críptica.

Se encontró asociación coevolutiva entre las cepas de T. rangeli KP1(-), las cuales circulan en la cordillera de los Andes en los vectores del grupo "pallescens", representados por R. pallescens, R. colombiensis y R. ecuadoriensis, y las cepas de T. rangeli KP1(+), las cuales circulan al oriente de la cordillera de los Andes en los vectores del grupo "prolixus", representados por R. prolixus y R. neglectus (9).

Nuestro interés fue conocer el grado de divergencia genética existente entre los grupos de T. rangeli KP1(+) y T. rangeli KP1(-). Por esta razón, en el presente trabajo se analizaron las características morfológicas de los tripo-mastigotes sanguíneos y las características genéticas mediante análisis de RAPD en cepas de T. rangeli aisladas de R. pallescens, R. colombiensis, R. ecudoriensis y R. prolixus para verificar si los polimorfismos observados en las poblaciones de este parásito están asociados con los vectores que las transmiten, de manera que estos actuarían como filtros biológicos seleccionando las diferentes poblaciones del parásito.

Se utilizaron 19 cepas de T. rangeli. Las cepas Perú 1, Perú 1A y Perú 2A se aislaron de las glándulas salivares naturalmente infectadas de R. ecuadoriensis domiciliado en el departamento de la Libertad en el norte del Perú; las cepas P53, Trs, Rcol, 2715 y 044 se aislaron de R. colombiensis silvestre en el departamento del Tolima, región central de Colombia; las cepas Gal 47, Gal 57, SO28, SO48 se aislaron de R. pallescens silvestre en el departamento de Sucre, norte de Colombia; la cepa 0401 se aisló de R. pallescens silvestre en el departamento del Tolima, Colombia; la cepa GMLLC se aisló de R. pallescens en Panamá; las cepas 444, 1545, 3123 se aislaron de R. prolixus domiciliado en el departamento de Boyacá, Colombia, y las cepas P19 y Choachí se aislaron de R. prolixus domiciliado en los departamentos de Norte de Santander y Cundinamarca, Colombia. Los tripomastigotes metacíclicos de las glándulas salivares de cada vector se inocularon intraperito-nealmente en ratones ICR. Se efectuaron hemocultivos a partir de los ratones positivos en el quinto día posinoculación y las cepas aisladas se mantuvieron a 28°C mediante pasajes semanales en medio NNN con LIT suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado. Todas las cepas aisladas de R. ecuadoriensis, R. colombiensis y R. pallescens se caracterizaron como T. rangeli KP1(-), y las cepas aisladas de R. prolixus como T. rangeli KP1(+) mediante la amplificación de kDNA y del espaciador intergénico del gen miniexón (17,19).

Grupos de tres ratones ICR machos de ±20 gramos se inocularon con 5x106 epimastigotes de las cepas de cultivo de T. rangeli KP1(-). Otros grupos de tres ratones ICR machos se inocularon con 400.000 tripomastigotes metacíclicos de cada cepa de T. rangeli KP1(+). Los ratones se examinaron a partir del tercer día de inoculación, se observó la parasitemia y se dibujaron en cámara lúcida 30 formas sanguíneas circulantes de cada una de las cepas en el quinto día posinoculación. En cada una de las formas dibujadas se midió la longitud total, la longitud del flagelo, las distancias del núcleo al extremo posterior y al extremo anterior, los índices nucleares y los índices del cinetoplasto (20,21). Se realizaron estimaciones de las medias de la longitud total de los tripomastigotes sanguíneos de las cepas de T. rangeli en el quinto día posinfección con los respectivos intervalos de 95% de confianza y se efectuó análisis multivariado de varianza (MANOVA) utilizando el programa STATISTICA V4.5.

Para evaluar pleomorfismos de las formas sanguíneas se seleccionó la cepa P53 de T. rangeli KP1(-) para infectar dos individuos de Mus musculus, Didelphis marsupialis y Canis familiaris, a los que se les inocularon formas de cultivo que contenían 2x10⁶ parásitos por gramo de peso corporal. Los tripomastigotes sanguíneos se aislaron de la sangre de cada uno de los mamíferos, concentrándolos por centrifugación en tubo capilar, extendiéndolos y coloreándolos con Giemsa. Se dibujaron 30 tripomastigotes sanguíneos circulantes en ratón, canino y didélfido durante el tercer día posinoculación. A cada una de las formas dibujadas se les efectuó la toma de las medidas morfométricas y se realizaron estimaciones de las medias de la longitud total de los tripomastigotes sanguíneos de la cepa P53 de T. rangeli en el tercer día posinfección en cada uno de los mamíferos utilizados con los respec-tivos intervalos de 95% de confianza; se efectuó análisis multivariado de varianza (MANOVA) utilizando el programa STATISTICA V4.5.

El ADN genómico se extrajo de los cultivos de parásitos mediante el método de fenol-cloroformo seguido de precipitación con etanol y acetato de sodio. La concentración del ADN se determinó por electroforesis mediante comparación con patrones de concentración conocidos. Para la obtención del ADN polimorfo amplificado aleatorio (RAPD) se ensayaron 12 iniciadores a partir de los cuales se seleccionaron OPBG-02 (5´-GGAAAGCCCA-3´) y OPBG-013 (5´-GGTTGGGC CA-3´) (Operon Technologies, Inc.), los que permitieron obtener los patrones más discrimi-nantes para analizar todas las cepas. Para las amplificaciones se utilizó un volumen final de reacción de 20 µl que contenía 2 ml de buffer de Taq Polimerasa 10X (INVITROGEN), una mezcla de dNTPs 200 mM dNTPs, MgCl2 3,5 mM,, KCL 25 mM y 25 mM del iniciador ,1 unidad de Taq DNA polimerasa (INVITROGEN) y 10 ng de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se corrió en una termociclador M.J. Research PTC-150-16 y se sometió a 35 ciclos de amplificación. Los perfiles de temperatura para denaturación del ADN, hibridación y extensión del iniciador fueron 95°C por un minuto (con un tiempo inicial de 5 min), 30°C por un minuto y 72°C por un minuto, respectivamente, y una extensión final de 5 minutos. Los productos amplificados fueron separados en geles de poliacrilamida al 6% y coloreados con nitrato de plata (22). Los perfiles de RAPD se usaron para la construcción de una matriz binaria de acuerdo con la presencia (1) o ausencia (0) de las bandas. El análisis se efectuó con el programa RAPDPLOT versión 3.0 y se calculó la matriz de distancias a partir del índice de bandas compartidas (1-MATCH). El índice de bandas compartidas (M) se calculó usando la formula: M = NAB/NT, donde NAB es el número total de apareamientos entre los individuos A y B y NT es el número total de loci registrados (23). Con base en los resultados de los perfiles de RAPD se construyó un dendrograma por el método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Means) utilizando un bootstrap con 100 pseudoréplicas. Las distancias entre los grupos de parásitos se obtuvieron con el programa RAPDIST, con el cual se compararon las distancias genéticas de Nei (24), y se comprobó la consistencia de los datos de RAPD que soportan las ramas del dendrograma usando análisis de bootstrap con 100 pseudoréplicas.

La interacción entre las subpoblaciones de tripanosomas con diferentes especies de triatominos, así como los mecanismos que regulan la transmisión, son importantes elementos para la documentación de la epidemiología de la tripanosomiasis americana. A partir de este enfoque será posible establecer cuáles subpoblaciones de tripanosomas son transmitidas por los vectores en una determinada área geográfica. De otra parte será igualmente posible conocer si existen diferencias en la susceptibilidad a la infección de los hospederos vertebrados. Adicionalmente, los estudios de la interacción tripanosoma-triatomino permitirán identificar procesos coevolutivos para fortalecer las hipótesis acerca de la filogenia y dispersión de los parásitos y de los vectores, contribuyendo así a aclarar la posición taxonómica de las especies semejantes a T. cruzi o a T. rangeli en América.

Se ha demostrado que las cepas de T. rangeli aisladas de las especies de Rhodnius del grupo pallescens (R. pallescens, R. colombiensis y R. ecuadoriensis) denominadas (KP1-) son genéticamente divergentes de las cepas aisladas del grupo prolixus (prolixus, neglectus) denominadas (KP1+) (9,17,18), lo que indica una posible asociación evolutiva entre las subpoblaciones de T. rangeli y los grupos de especies de Rhodnius.

La relación entre la diversidad genética del parásito y su transmisibilidad vectorial no está completamente entendida, pues se ha mostrado que las poblaciones de T. cruzi y T. rangeli difieren en su habilidad para sobrevivir, multiplicarse y diferenciarse en el insecto vector. También se ha mostrado que en una misma área geográfica existen diferencias significativas entre la proporción de genotipos de T. cruzi y T. rangeli detectados en los vectores y en los mamíferos. Estas diferencias podrían explicarse por la transmisión selectiva de algunos genotipos por parte de los vectores locales, que actuarían como filtros biológicos del parásito. Se ha demostrado que en Colombia R. colombiensis puede infectarse con T. rangeli KP1(-) y KP1(+), pero sólo transmite a KP1(-) a través de la picadura y que R. prolixus se infecta con T. rangeli KP1(-) y KP1(+), pero solo transmite por picadura a la subpoblación KP1(+) (17,18). Estos resultados demuestran que R. prolixus es susceptible a la infección de T. rangeli KP1(+), pero presenta una respuesta refractaria a la invasión de cepas de T. rangeli KP1(-) aisladas de R. pallescens, R. colombiensis y R. ecuadoriensis. El compor-tamiento diferencial en la transmisión de estas dos subpoblaciones se relaciona con la activación de la respuesta inmune del vector, en la que factores intrínsecos como la producción de hemocitos, nódulos y factores tripanolíticos limitan la infección parasitaria (25). Recientemente se detectó en la hemolinfa de R. prolixus un factor tripanolítico contra las cepas de T. rangeli KP1(-) que corresponde a una proteína termolábil, la cual sería un factor inmunológico para que R. prolixus actúe como filtro biológico de subpoblaciones de T. rangeli KP1(-) (datos no publicados).

Dentro de una misma especie de tripanosoma pueden encontrarse variaciones morfológicas significativas que pueden conducir a la separación de una misma especie en dos o más especies diferentes (21). Varios autores han señalado pleomorfismos o variaciones morfológicas de T. rangeli cuando se infectan diferentes vertebrados con un mismo aislamiento. El pleomorfismo de los tripomastigotes sanguíneos detectado en el presente trabajo en ratón, Didelphis y perro al tercer día posinoculación revela que la longitud total de estas formas de T. rangeli sería dependiente del vertebrado en el cual se examina (figura 2). Estos resultados preliminares indican que probablemente el vertebrado también selecciona diferentes subpoblaciones del parásito, o que la morfología de T. rangeli sería dependiente de la respuesta inmune del hospedero vertebrado. El hallazgo de este carácter pleomorfico en T. rangeli podría contribuir a aclarar la posición taxonómica de los tripanosomas semejantes a T. rangeli, tales como T. (H.) mesnilbrimontí, T. (H.) preguici, T. (H.) myrmecophague, T. (H.) mycetae, T. (H.) diasi, T, (H.) cebus, T. (H.) saimiri, y T. (H.) advieri, entre otros, pues como se sabe, estos parásitos fueron clasificados como especies diferentes con base en diferencias de tamaño al ser comparados con cepas de T. rangeli aisladas de R. prolixus.

Los resultados de la caracterización molecular preliminar mediante RAPD de las cepas de T. rangeli (figura 4) muestran una clara divergencia entre el grupo de cepas KP1(+) y KP1(-), indicando la existencia de cuatro grupos de T. rangeli genéticamente divergentes y asociados con R. prolixus, R. pallescens, R. colombiensis y R. ecuadoriensis. Estos grupos difieren de los cuatro grupos de T. rangeli previamente detectados por Maia da Silva et al. (26), quienes utilizando análisis de RAPD encontraron un grupo formado por cepas de T. rangeli de Colombia, Venezuela, Honduras, la Isla de Marajó, Pará y Rondonia en Brasil, un segundo grupo formado por las cepas aisladas en Acre y Pará (Brasil), un tercer grupo formado por cepas aisladas en Panamá y el Salvador y un cuarto grupo formado por la cepa SC58 aislada en Santa Catarina (Brasil). Los resultados del presente trabajo, en conjunto con los de otros autores (26), indican que T. rangeli está formado por varios grupos genéticamente divergentes, probablemente asociados a diferentes especies de Rhodnius. Posteriores estudios filogenéticos en el grupo de cepas KP1(-), utilizando otros marcadores moleculares, podrían indicar si estas cepas evolucionaron de norte a sur en el mismo sentido que se propone la evolución del cline conformado por las especies de vectores del grupo "pallescens". Por otro lado, los estudios filogenéticos en el grupo de T. rangeli KP1(+) podrían arrojar información sobre la evolución de los parásitos y sus vectores.

Las distancias genéticas de Nei observadas por medio del análisis de isoenzimas en especies diferentes de un mismo género varían entre 0,162 y 0,3 en la mayoría de las especies (27). Las distancias obtenidas entre las subpoblaciones de T.rangeli en el presente trabajo (figura 5) indicaron que los grupos más próximos constituídos por las cepas aisladas de R. pallescens y R. colombiensis presentaron una distancia genética de Nei de 0,11110; sin embargo, las cepas aisladas de R. ecuadoriensis presentaron una distancia genética de 0,19955 con relación al grupo R.pallescens-R. colombiensis; por otro lado, el cálculo de la distancia genética de Nei entre poblaciones de T. rangeli con el empleo de RAPDIST mostró que las distancias entre T. rangeli KP1(-) y T. rangeli KP1(+) fueron de 0,30435, lo cual indica una gran divergencia genética entre estos dos grupos, semejante a la observada en especies diferentes de otros organismos (27).

Los resultados de la presente investigación señalan que la interacción T. rangeli-vector es un importante modelo, en el cual cada vector del género Rhodnius transmite subpoblaciones del parásito fenotípica y genotípicamente divergentes y que, por lo tanto, los vectores actuarían como filtros biológicos de dichas subpoblaciones. Es posible que ocurran fenómenos semejantes en la transmisión del agente causal de la enfermedad de Chagas, pues recientemente se han descrito seis subpoblaciones de T. cruzi (T. cruzi I, T. cruzi IIa, IIb, IIc, IId y IIe) (28,29), que interactúan con más de 100 especies de triatominos en diferentes regiones de América Latina.

Los autores del presente artículo declaramos que no teníamos conflictos de intereses de orden académico, institucional u operacional en el momento de realización de la investigación.

El presente trabajo recibió financiación de las siguientes instituciones: Instituto Colombiano "Francisco José de Caldas" (Colciencias), proyecto 1105-05-16919; Chagas Disease Intervention Activities-European Community (CDIA-EC), contrato No. ICA4-CT-2003-10049; SSA-EC: Trypanosomiasis Update y Fondo de Investigaciones de la Universidad del Tolima.

Correspondencia:
Gustavo Adolfo Vallejo, Laboratorio de Investigaciones en Parasitología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Ibagué, Tolima, Colombia. A.A. No. 546. Telfax +(57) 8 2669176.
gvallejo@ut.edu.co