ARTÍCULO ORIGINAL

doi: http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v34i1.1465

Contribución de los autores:

Itali M. Linero: diseño de experimentos, obtención, cultivo y caracterización de las Ad-MSC, elaboración del hidrogel de plasma sanguíneo humano, escritura y revisión del manuscrito.

Adriana Doncel: obtención, cultivo y caracterización de las Ad-MSC, y revisión del manuscrito.

Orlando Chaparro: diseño de experimentos, escritura y revisión del manuscrito.

Introducción. La utilización de las células madre mesenquimales en la práctica clínica ha aumentado considerablemente en la última década, ya que juegan un papel favorable en los procesos de reparación y regeneración tisular, siendo la principal herramienta de la terapia celular para el tratamiento de enfermedades que afectan funcionalmente el tejido óseo y cartilaginoso.

Objetivo. Evaluar la proliferación y capacidad de diferenciación osteogénica in vitro de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano en un hidrogel de plasma sanguíneo.

Materiales y métodos. Se obtuvieron células madre mesenquimales a partir de explantes de tejido adiposo humano y se caracterizaron por citometría de flujo; se buscó demostrar su multipotencialidad por su capacidad de diferenciación osteogénica y adipogénica. Se evaluó la proliferación celular y la capacidad de diferenciación osteogénica de las células cultivadas en hidrogeles de plasma sanguíneo.

Resultados. Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo cultivadas en el hidrogel de plasma sanguíneo humano mostraron un patrón de proliferación muy similar al de las células cultivadas en monocapa y, además, mantuvieron su capacidad de diferenciación hacia el linaje osteogénico.

Conclusiones. El hidrogel de plasma sanguíneo humano es un soporte adecuado para que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano proliferen y se diferencien hacia el linaje osteogénico y constituye un vehículo adecuado para su administración en regeneración del tejido óseo.

Palabras clave: células madre, hidrogeles, plasma, regeneración ósea.

doi: http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v34i1.1465

Proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in hydrogels of human blood plasma

Introduction: The use of mesenchymal stem cells in clinical practice has increased considerably in the last decade because they play a supporting role in the processes of tissue repair and regeneration, becoming the main tool of cell therapy for the treatment of diseases functionally affecting bone and cartilage tissue .

Objective: To evaluate in vitro the proliferative and osteogenic differentiation ability of mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue in a blood plasma hydrogel.

Materials and methods: Mesenchymal stem cells were obtained from human adipose tissue explants and characterized by flow cytometry. Their multipotentiality was demonstrated by their ability to differentiate to adipogenic and osteogenic lineages. Cell proliferation and osteogenic differentiation ability of the cells cultured in blood plasma hydrogels were also evaluated.

Results: Mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue growing in human blood plasma hydrogels showed a pattern of proliferation similar to that of the cells cultured in monolayer and also maintained their ability to differentiate to osteogenic lineage.

Conclusions: Human blood plasma hydrogels are a suitable support for proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue and provides a substrate that is autologous, biocompatible, reabsorbable, easy to use, potentially injectable and economic, which could be used as a successful strategy for the management and clinical application of cell therapy in regenerative medicine.

Key words: stem cells, hydrogels, plasma, bone regeneration.

doi: http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v34i1.1465

Recibido: 28/11/12; aceptado: 22/08/13

La utilización de las células madre en la práctica clínica ha aumentado considerablemente en la última década. Durante este tiempo, la comunidad científica ha tratado de comprender los mecanismos biológicos que pueden jugar un papel favorable en los procesos de reparación y regeneración tisular y proyectar su potencialidad en la terapia celular y la medicina regenerativa (1,2).

Los tejidos adultos maduros mantienen una reserva de células madre adultas; en este grupo encontramos las células madre mesenquimales que desde la década de los 70 han sido motivo de múltiples investigaciones, primero por su papel como parte del estroma hematopoyético, y en los últimos 10 años, como una opción terapéutica para múltiples enfermedades por sus propiedades biológicas aplicables al campo de la medicina regenerativa (3,4).

Las células madre mesenquimales son células adultas multipotentes, capaces de autorrenovarse y diferenciarse a linajes mesenquimales como el osteogénico, condrogénico, adipogénico y miogénico, aunque también se ha demostrado su capacidad de diferenciarse a células de origen no mesenquimal como las del tejido nervioso (5-8).

Tradicionalmente la médula ósea se ha considerado como la fuente principal para el aislamiento de las células madre mesenquimales (7), aunque conforman tan solo el 0,001-0,01 % de la población total de las células nucleadas de la médula ósea (9). En diversos estudios se ha demostrado que las células madre mesenquimales pueden ser aisladas a partir de otras fuentes como la sangre del cordón umbilical, sangre periférica (10), tejido adiposo (11-13), folículo capilar (14), ligamento periodontal (15) y pulpa dental (16), entre otros.

Dado su importante potencial terapéutico, y con el fin de comparar los resultados de los diversos estudios, la International Society for Cellular Therapy (ISCT) ha propuesto tres criterios mínimos para definir las células madre mesenquimales humanas. El primero corresponde a la capacidad de adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar; el segundo, al fenotipo celular determinado idealmente por citometría de flujo en la que las células madre mesenquimales deben expresar CD105, CD73 y CD90, y no expresar CD45, CD34, CD14, entre otros antígenos hematopoyéticos, y el tercero, que hace referencia a la capacidad de diferenciarse in vitro a los linajes osteogénico, condrogénico y adipogénico (6,7,17).

La información científica respalda el uso de las células madre mesenquimales como una terapia biológica para diversas aplicaciones clínicas por su facilidad de acceso y aislamiento, gran potencial de expansión en cultivo, plasticidad, capacidad de migrar hacia los tejidos lesionados (18), efecto paracrino, propiedades inmunomoduladoras (3,7,19-22), propiedades antiapoptóticas y antifibróticas (6), por su capacidad de promover angiogénesis, producir múltiples tipos de tejido conectivo y disminuir la respuesta inflamatoria (1); además, los trabajos con las células madre mesenquimales no involucran los dilemas éticos que se presentan con el manejo de las células madre embrionarias (3,6,19). Por todo esto, las células madre mesenquimales son hoy en día el centro de múltiples estudios clínicos para ciertas entidades como infarto del miocardio, diabetes, alteraciones cerebrales y de médula espinal, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Crohn (1,6) y otras que involucran el tejido óseo y cartilaginoso (8,12,23-25).

Según los National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, a la fecha se están realizando a nivel mundial 340 ensayos clínicos de aplicación de células madre mesenquimales, de los cuales, 195 incluyen enfermedades relacionadas con el tejido muscular, óseo y cartilaginoso como, por ejemplo, la osteoartritis, la osteogénesis imperfecta, la artritis y las enfermedades óseas metabólicas y del desarrollo, entre otras (26).

La fibrina se ha utilizado en medicina desde hace casi 100 años (27,28). Se introdujo en el campo de la cirugía debido a su potencial para actuar como un sellador y ayudante de la hemostasis (27,29). En 1990, Gibble y Ness (30) introdujeron por primera vez la fibrina autóloga, encontrando en ella la capacidad de crear grandes cantidades de gel en corto tiempo, a un bajo costo y con un bajo riesgo de transmisión de enfermedades, lo que popularizó el uso de geles de fibrina de sangre autóloga como un mecanismo de transporte de factores de crecimiento y como una matriz para el trasplante autólogo de células (28). Se han descrito diferentes preparaciones de hidrogeles de fibrina para el cultivo y crecimiento de distintos tipos celulares como, por ejemplo, condrocitos para el desarrollo de tejido cartilaginoso (31), fibroblastos y queratinocitos para piel (32), células madre embrionarias (33) y células madre mesenquimales para el desarrollo de tejido óseo (34,35). El hidrogel de fibrina es probablemente uno de los más completos derivados del plasma sanguíneo en términos de su composición y aplicación clínica, que permite la formación de un coágulo semirrígido que es de fácil consolidación y adherencia en el sitio de la aplicación (36-38).

Los defectos óseos y del cartílago son importantes causas de incapacidad funcional y la restauración de la función esquelética, en el campo de la ortopedia y la cirugía maxilofacial, continúa siendo un reto importante. La reparación de defectos óseos que se producen por trauma, tumores, infecciones, trastornos bioquímicos o de desarrollo esquelético anormal son situaciones clínicas que requieren una intervención quirúrgica. Los tipos de material disponible para el tratamiento de estos problemas incluyen hueso autólogo (del mismo paciente), hueso heterólogo (de un donante), matrices desmineralizadas, así como una amplia gama de biomateriales sintéticos como metales, cerámicas, polímeros y materiales compuestos (39-41).

El uso de injertos óseos en la práctica clínica presenta varios inconvenientes como la escasez de donantes, la transmisión de enfermedades, la morbilidad del sitio de extracción y la incapacidad de los materiales para remodelarse y reaccionar ante condiciones fisiológicas, con un alto porcentaje de pérdida por complicaciones como la falta de unión, la reabsorción osteoclástica, el incremento en la prevalencia de microfracturas y la disminución en la densidad mineral ósea (42).

Para reducir tales problemas, la ingeniería de tejidos se ha convertido en una estrategia encaminada a reparar, reconstruir o regenerar tejido vivo utilizando células y biomoléculas en una matriz tridimensional para la formación y el crecimiento de los nuevos tejidos a ser empleados en la reconstitución morfológica y funcional del tejido perdido (43-47).

Con el fin de desarrollar un modelo para la aplicación clínica de las células madre mesenquimales en lesiones óseas, se evaluó su proliferación y capacidad de diferenciación osteogénica in vitro en un hidrogel de plasma sanguíneo humano. El hidrogel de plasma sanguíneo proporcionaría un soporte autólogo, totalmente biocompatible, reabsorbible, de fácil manejo, potencialmente inyectable y económico, en el que las células madre mesenquimales cumplen su papel de regeneración y reparación del tejido óseo afectado, lo que podría llegar a ser una estrategia exitosa en la búsqueda de una nueva alternativa para su administración y aplicación clínica en medicina regenerativa.

Materiales y métodos

Obtención y cultivo de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

Las muestras para el estudio se obtuvieron a partir de biopsias de tejido adiposo humano de dos individuos mayores de edad (23 y 35 años) de sexo femenino, programados para cirugía máxilo-facial, de quienes se obtuvo la aprobación y la firma del consentimiento informado; se contó con el aval del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.

Se sembraron explantes de, aproximadamente, 0,2 cm de diámetro de tejido adiposo en cajas plásticas de cultivo de seis pozos (cajas GreinerBio-one), y medio de cultivo Dulbecco´s Modified Eagle TM bajo en glucosa (DMEM, GIBCO), con suplemento de 10 % de suero fetal bovino (SFB TM , GIBCO), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml. Los explantes se incubaron a 37 o C en atmósfera húmeda con 5 % de CO 2 . El medio fue reemplazado por medio de cultivo fresco dos veces por semana hasta que las células alcanzaron 70-80 % de confluencia entre la segunda y la tercera semana de cultivo (48).

Caracterización de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano por citometría de flujo

Las células madre derivadas de tejido adiposo (Ad-MSC) de sexto pasaje en 70 % de confluencia fueron recolectadas con tripsina al 0,25% (GIBCO), llevadas a una concentración de 5 x 10 5 e incubadas con anticuerpo monoclonal anti-CD105 humano-PE (Phycoerytrin TM , clon sn6, eBioscience), anticuerpo monoclonal anti- CD34 humano-APC (Allophicocyanin TM , clon AC 136, Milteny Biotec), anticuerpo monoclonal anti-CD45 humano-RPE-Cy5 (R-phycoerytrin- Cyanine 5 TM , clon T29/33, Dako Cytomation), anticuerpo monoclonal anti-CD 90 humano-APC (Allophicocyanin, Alexa Fluor TM , clon F 15-42-1, AbD, Serotec), anticuerpo monoclonal anti-HLA-ABC humano-FITC (Fluorescein Isothiocyanate TM , clon w6/332,AbD, Serotec), anticuerpo monoclonal anti-HLA-DR humano-RPE (R-Phycoerytrin TM , clon AB/3), y los controles negativos específicos de isotipo IgG1/RPE Cy5, IgG2a/RPE e IgG1/FITC (Dako Cytomation).

Las lecturas y el análisis de resultados se realizaron en el citómetro FACS Canto TM ubicado en la Unidad de Citometría de Flujo del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia.

Se adquirieron, aproximadamente, 10.000 eventos de la región que corresponde a una población celular con alta complejidad ( sidescatter ) y tamaño ( forward scatter ) y se realizó el análisis de esta población para observar la expresión de los antígenos CD34, CD45, CD105, CD90, HLA-ABC y HLA-DR independientemente.

Diferenciación osteogénica

Las células se incubaron en medio de diferenciación osteogénica: DMEM con suplemento de 10 % de SFB, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, dexametasona 0,1 µM, ascorbato-2-fosfato 50 µM y a-glicerol fosfato 10 mM (Sigma-Aldrich) (49,50). El medio de inducción se reemplazó dos veces por semana durante tres semanas, incubando las células a 37 o C en atmósfera húmeda con 5 % de CO 2 . Como control negativo se usaron células incubadas en medio de cultivo convencional y todos los ensayos se realizaron por triplicado.

A la primera semana de inducción se evalúo la actividad de la enzima fosfatasa alcalina, un marcador temprano de diferenciación osteogénica, mediante la tinción de Fast Red (Sigma-Aldrich) (51). Además, a las tres semanas de incubación con el medio de inducción las células se tiñeron para detectar depósitos de calcio utilizando la tinción de von Kossa (Sigma-Aldrich) (3).

Diferenciación adipogénica

Los cultivos celulares de sexto pasaje se incubaron durante tres semanas en medio de inducción adipogénica: DMEM con alto contenido de glucosa, con suplemento de 10 % de SFB, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µm/ml, indometacina 100 µM, insulina 10 µg/ml, isobutil-metilxantina 0,5 mM y dexametasona 1 µM (49). Se utilizaron células cultivadas en medio convencional como control negativo. Para evidenciar la diferenciación adipogénica, las inclusiones citoplasmáticas de lípidos se colorearon con aceite rojo O (Sigma-Aldrich) (52).

Elaboración del hidrogel de plasma sanguíneo humano

Los hidrogeles de 250 µl se prepararon mezclando plasma sanguíneo humano (83 µl), solución salina estéril (133 µl), ácido tranexámico 100 mg/ml (1,6 µl), DMEM (16,6 µl) y CaCl 2 al 10 % estéril (16,6 µl). Para el cultivo de las células en los hidrogeles se utilizaron 50.000 Ad-MSCs por hidrogel, resuspendidas en DMEM con suplemento de 10 % de SFB. Las estructuras tridimensionales resultantes, compuestas por Ad-MSC embebidas en los hidrogeles, se cultivaron en DMEM con suplemento de 10 % de SFB, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml y se incubaron a 37 o C en atmósfera húmeda con 5 % de CO 2 . El medio se reemplazó dos veces por semana. Se observaron las características macroscópicas y microscópicas de los hidrogeles, así como la permanencia y proliferación de las Ad-MSC en su interior.

Microscopía electrónica de barrido

El hidrogel de plasma sanguíneo humano se analizó por microscopía electrónica de barrido para determinar la morfología y porosidad. Los hidrogeles se fijaron en glutaraldehído al 2 %, se deshidrataron en etanol y se secaron utilizando el secador de punto crítico para retener la estructura del poro. Posteriormente, las muestras se recubrieron con Au/Pd y se procedió a analizarlas al microscopio electrónico de barrido en el Laboratorio de Microscopia Electrónica de Barrido, en el Centro de Equipos Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia (53).

Ensayo de proliferación de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

La proliferación celular se analizó utilizando el Vybrant MTT Cellproliferation Assay Kit TM (Invitrogen V-13154) y siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Para el análisis de proliferación en monocapa, las Ad-MSCs se sembraron en cajas de 96 pozos a una concentración de 10.000 células en 100 µl de DMEM con suplemento de 10 % SFB, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml y se incubaron a 37 °C en atmosfera húmeda con 5 % de CO 2 ; se realizaron lecturas entre los días 1 y 12. Las lecturas de la densidad óptica se hicieron en un microlector de platos Ultramark TM a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos fueron comparados con una curva estándar con concentraciones celulares conocidas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

La proliferación de las Ad-MSC en los hidrogeles se evaluó sembrando 50.000 células por hidrogel y haciendo seguimiento hasta el día 16 de cultivo. Se comparó con una curva de calibración en hidrogeles de plasma sanguíneo con diferentes concentraciones celulares de entre 15.000 y 200.000 células. Las lecturas de la densidad óptica se hicieron en un microlector de platos Ultramark TM a una longitud de onda de 550 nm. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano en los hidrogeles de plasma sanguíneo humano

Los ensayos de diferenciación osteogénica en los hidrogeles de plasma sanguíneo se realizaron como se describió previamente para la caracterización de las Ad-MSC en monocapa. Para el análisis de actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la detección de los depósitos de calcio, los hidrogeles se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se embebieron en parafina, y se hicieron cortes histológicos de 4 µm. Las láminas fueron teñidas con las coloraciones de von Kossa y de Fast Red (54).

Resultados

Caracterización de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

Entre la primera y segunda semanas de cultivo se observaron células fibroblastoides adherentes al plástico adyacentes al explante de tejido adiposo. A partir de la tercera semana de cultivo se observaron abundantes células que formaban una monocapa celular confluente que cubría la superficie de la caja de cultivo. Las células aisladas se expandieron en cultivo con tripsina y pasajes seriados (figura 1).

Caracterización por citometría de flujo

El fenotipo de las Ad-MSC se determinó por citometría de flujo evaluando la expresión de los antígenos de superficie CD105 y CD90 carac-terísticos de las células madre mesenquimales, y CD45 y CD34, marcadores característicos hematopoyéticos. Además, se analizó la expre-sión de HLA-ABC y -HLA-DR. Se adquirieron, aproximadamente, 10.000 eventos de la región que corresponde a una población celular similar en complejidad y tamaño. Se usaron como control las Ad-MSC en cultivo sin marcar. Los resultados, como se observa en la figura 2, mostraron que las células expresaban los antígenos CD105, CD90 y HLA I y no así los CD45, CD34 y HLA II. Este inmunofenotipo concuerda con los parámetros establecidos por la International Society for Cellular Therapy como el perfil característico de las células madre mesenquimales.

Diferenciación osteogénica

La capacidad de diferenciación ósea se determinó por medio de la detección de la enzima fosfatasa alcalina, marcador temprano del fenotipo osteo-blástico, y la mineralización de la matriz extracelular como marcador de la funcionalidad celular.

Después de la primera semana de inducción osteogénica se detectó la presencia de fosfatasa alcalina con la tinción Fast Red en los cultivos celulares tratados con medio de inducción y la ausencia de expresión de esta enzima en las células no inducidas (control) (figura 3, paneles A y B). Después de la tercera semana de cultivo con el medio de inducción osteogénica se observaron los depósitos de mineralización ósea de color café oscuro con la tinción de von Kossa. Las Ad-MSC no inducidas (control) fueron negativas (figura 4, paneles A y B).

Diferenciación adipogénica

Después de tres semanas del tratamiento con el medio de inducción adipogénica fue evidente la aparición de vacuolas lipídicas (ricas en triglicéridos), lo cual se evidenció con la tinción positiva del aceite rojo O (figura 5, paneles A y B) mientras que las células no inducidas fueron negativas para esta tinción (figura 5, panel C).

Cultivo de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano en hidrogeles de plasma sanguíneo humano

El tiempo de gelificación desde el momento de la adición del CaCl 2 fue de tres a cinco minutos, aproximadamente. El hidrogel de plasma sanguíneo humano exhibió una composición homogénea, transparente, sin sedimentos ni turbidez. Estas características permitieron la visualización micros-cópica de las Ad-MSC durante su proliferación y diferenciación (figura 6). Además, fue de fácil manipulación y permaneció estable durante el estudio. Las células presentaron una morfología fibroblastoide a partir del segundo día de la siembra (figura 6, paneles D, E y F).

Mediante microscopía electrónica de barrido se observó que las redes de fibrina formaban una estructura tridimensional que generó un enmallado con poros interconectados entre sí con un diámetro promedio de entre 20 y 30 µm (figura 6, paneles B y C).

Ensayo de proliferación celular

En la figura 7 se presentan las curvas de proliferación celular tanto en monocapa como en los hidrogeles de plasma sanguíneo humano. Los resultados demostraron que el hidrogel proporciona un microambiente adecuado para la proliferación celular.

Diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano en el hidrogel de plasma sanguíneo humano

Después de la primera semana de inducción osteogénica se detectó la presencia de fosfatasa alcalina con la tinción Fast Red en los hidrogeles tratados con medio de inducción y la ausencia de expresión de esta enzima en los hidrogeles control (figura 3, paneles C y D). Después de la tercera semana de cultivo con el medio de inducción osteogénica se observaron los depósitos de calcio con la tinción de von Kossa. En las Ad-MSC no inducidas (control) no se observaron los depósitos de calcio (figura 4, paneles C y D).

Discusión

La ingeniería de tejidos se ha desarrollado como una estrategia terapéutica para reparar, reconstruir o regenerar tejido vivo. Para lograrlo se requiere no solamente de células reparadoras, sino también de una matriz adecuada que se pueda implantar en el sitio donde está el defecto y sirva de soporte a las células implantadas para que puedan proliferar e interactuar con factores de crecimiento y citocinas específicas (43).

Por su capacidad de diferenciación a múltiples linajes, específicamente por su potencialidad osteogénica y sus propiedades inmunomodula-doras, antiinflamatorias y anti-apoptóticas, las células madre mesenquimales se han convertido en la principal herramienta de la terapia celular para el tratamiento regenerativo de enfermedades que afectan funcionalmente al tejido óseo (1,3,8,24,55-57).

La cantidad y accesibilidad de tejido adiposo subcutáneo en humanos hace que sea una alternativa más atractiva que la médula ósea como fuente de células madre adultas. Los primeros métodos para el aislamiento de las Ad-MSC fueron iniciados por Rodbell y Jones en la década de 1960, quienes por disgregación enzimática aislaron la población de células adherentes de la fracción vascular endotelial. Este procedimiento se ha modificado a lo largo del tiempo. Inicialmente, los fragmentos se trituraban a mano, pero con el desarrollo de la cirugía por liposucción se ha simplificado este primer paso (58). Sin embargo, con este método el proceso de aislamiento requiere de la manipulación de grandes volúmenes de lípidos, lo cual aumenta los riesgos potenciales de contaminación (59). Para facilitar este proceso y disminuir el riesgo de contaminación por otros tipos celulares, en nuestro grupo de investigación se utilizó un método diferente para el aislamiento a pequeña escala (48). La extracción celular a partir del método de explante constituye un procedimiento fácil, de mínima morbilidad y menos invasivo que el método de lipoaspirado y, además, permite obtener células que cumplen con los parámetros morfológicos, fenotípicos y funcionales estable- cidos por la International Society for Cellular Therapy para ser definidas como células madre mesenquimales (18,60-62).

En este estudio, las células madre mesenquimales aisladas de tejido adiposo humano presentaron una forma fibroblastoide (figura 1) y expresaron los marcadores CD105, CD90 y HLA I y no expresaron CD34, CD45 y HLA II (figura 2). Este perfil de expresión coincide con el perfil de marcadores de superficie celular descrito típicamente para las células madre mesenquimales en la literatura (1,6,9,18,60). Además, se demostró que estas células son capaces de diferenciarse hacia el linaje osteogénico y adipogénico, cumpliendo con los parámetros internacionales para ser definidas como células madre mesenquimales.

Nuestros resultados demostraron que las Ad-MSC proliferaron en el interior del hidrogel de plasma sanguíneo humano presentando un patrón de proliferación muy similar al observado en el cultivo en monocapa (figura 7). Esto indica que el hidrogel proporcionó un microambiente adecuado, con un tamaño de poro apropiado (entre 20 y 30 µm) (figura 6, paneles B y C) para la proliferación celular y que en estas condiciones las Ad-MSC conservaron su capacidad de diferenciación hacia el linaje osteogénico (figura 3 y figura 4). Estas dos características son muy importantes para pensar en la utilización de este modelo en terapia celular del tejido óseo, ya que es fundamental que las células conserven su capacidad de proliferación y diferenciación osteogénica en el momento de ser trasplantadas para que respondan adecuadamente a los estímulos generados en el sitio de la lesión.

En cuanto a su aplicación clínica, el hidrogel de plasma sanguíneo humano puede administrase en el sitio del defecto en estado líquido para que se adapte a la forma y tamaño del defecto a tratar. Una vez allí, se gelifica formando una estructura tridimensional que contiene en su interior las células madre mesenquimales y permite que estas células ejerzan su actividad terapéutica. Esta podría llegar a ser una estrategia exitosa en la búsqueda de una alternativa para la administración y aplicación clínica de las células madre mesenquimales en medicina regenerativa.

Este trabajo se realizó gracias al apoyo de la División de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Proyecto Código 5422.

Los autores de este manuscrito declaran no tener conflicto de intereses.

El presente trabajo se realizó con recursos de la Dirección de Investigación, sede Bogotá, de la Universidad Nacional de Colombia.

Correspondencia:

Orlando Chaparro, Universidad Nacional de Colombia, Ciudad Universitaria, edificio 471, oficina 410, Bogotá, D. C., Colombia

Teléfono: (571) 316 5000, extensión 15059 ochaparrog@unal.edu.co

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