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Biomédica

Print version ISSN 0120-4157On-line version ISSN 2590-7379

Biomed. vol.40 no.4 Bogotá Oct./Dec. 2020  Epub Dec 11, 2020

https://doi.org/10.7705/biomedica.5417 

Artículo original

Caracterización molecular y fenotípica de aislamientos clínicos de Salmonella Typhimurium variante monofásica (1,4,[5],12:i:-) recuperados en Colombia

Molecular and phenotypic characterization of Salmonella Typhimurium monophasic variant (1,4,[5],12:i:-) from Colombian clinical isolates

Paloma Cuenca-Arias1 

Lucy Angeline Montaño2 

José Miguel Villarreal3  4 

Magdalena Wiesner1  * 

1 Grupo de Microbiología, Subdirección de Investigación Científica y Tecnológica, Dirección de Investigación en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia

2 Grupo de Microbiología, Dirección de Redes en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D. C., Colombia

3 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D. C., Colombia

4 Grupo de Investigación en Ciencias Biológicas y Químicas, Facultad de Ciencias, Universidad Antonio Nariño, Bogotá, D. C., Colombia


Resumen

Introducción.

La variante monofásica (1,4,[5],12:i:-) de Salmonella Typhimurium ocupa los primeros lugares en los programas de vigilancia de Salmonella a nivel mundial. En Colombia, Salmonella enterica variante monofásica alcanza el cuarto lugar en cuanto a los aislamientos clínicos recuperados por medio de la vigilancia por laboratorio del Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud, pero se desconoce si dichos aislamientos están relacionados con la variante monofásica de Typhimurium que circula a nivel global, y con sus características genéticas y fenotípicas.

Objetivo.

Caracterizar los aislamientos de Salmonella monofásica recuperados en Colombia entre el 2015 y el 2018 por el Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud.

Materiales y métodos.

Se analizaron 286 aislamientos clínicos de Salmonella enterica variante monofásica mediante PCR o secuenciación del genoma completo (Whole Genome Sequencing, WGS) para confirmar si correspondían a Salmonella Typhimurium variante monofásica, en tanto que, en 54 aislamientos, se determinó la estructura genética del operón que codifica la segunda fase flagelar y, en 23, se evaluó la motilidad, el crecimiento y la expresión de las proteínas de membrana externa.

Resultados.

El 61 % (n=174) de los aislamientos de Salmonella monofásica correspondió a Salmonella Typhimurium serovar monofásico. El 64,8 % (n=35/54) se relacionó con el clon europeo-español y, el 13 % (n=7/54), con el estadounidense. En dos aislamientos de orina se encontró una diferencia significativa en la motilidad y el crecimiento, así como ausencia de la porina OmpD en medio mínimo M9.

Conclusiones.

En el periodo de estudio, circuló en Colombia la variante monofásica de Salmonella Typhimurium relacionada con el clon europeo-español, y se registró ausencia total del operón fljAB. Los resultados evidenciaron cambios fenotípicos en los aislamientos provenientes de muestras de orina que sugieren adaptación en procesos invasivos.

Palabras clave: Salmonella Typhimurium; porinas; flagelos; vigilancia; Colombia

Abstract

Introduction.

The Salmonella Typhimurium monophasic variant (1,4,[5],12:i:-) is currently the most commonly detected variant in Salmonella surveillance programs worldwide. In Colombia, the Salmonella enterica monophasic variant is the fourth most common clinical isolate recovered through the laboratory surveillance of the Grupo de Microbiología from the Instituto Nacional de Salud; however, it is unknown whether these isolates are closely related to the monophasic Typhimurium variant, which circulates globally, and their genetic and phenotypic characteristics have not been reported.

Objective.

To characterize monophasic Salmonella enterica isolates identified in Colombia from 2015 to 2018 by the Instituto Nacional de Salud.

Materials and methods.

Two hundred eighty-six clinical isolates of the monophasic Salmonella enterica variant were analyzed by PCR or whole-genome sequencing to confirm whether they corresponded to the Salmonella Typhimurium monophasic variant while the genetic structure of the operon encoding the second flagellar phase was determined in 54 isolates. Motility, growth, and expression of the outer membrane proteins were evaluated in 23 isolates.

Results.

During the study period in Colombia, 61% (n=174) of Salmonella monophasic isolates belonged to Salmonella Typhimurium serovar monophasic (1,4,[5],12:i-). Of these, 64.8% (n=35/54) were related to the European/Spanish clone and 13% (n=7/54) to the U.S. clone. Two isolates recovered from urine samples showed differences in motility, growth, and the absence of the OmpD porin in M9 minimal medium.

Conclusions.

Most of the monophasic Salmonella Typhimurium variants that have circulated in Colombia since 2015 lacked the second phase of operon fljAB, which is related to the European/Spanish clone. The results evidenced phenotypic changes in urine samples suggesting bacterial adaptation in the case of these invasive samples.

Keywords: Salmonella Typhimurium; porins; flagella; surveillance; Colombia

Salmonella spp. es una de las principales causas de enfermedad diarreica a nivel global; según la Organización Mundial de la Salud (OMS), una de cada diez personas adquiere este agente patógeno por el consumo de agua o comida contaminadas y anualmente se reportan más de 550 millones de casos 1.

La clasificación de Salmonella spp. se hace con el método de serotipificación siguiendo el esquema de Kauffmann-White-Le Minor, que identifica los antígenos presentes en la superficie bacteriana, como el lipopolisacárido (antígeno somático O), las proteínas flagelares (antígeno H) y las capsulares (antígeno K) 2. La mayoría de los serovares de Salmonella spp. son móviles debido a las proteínas flagelares que están codificadas por dos genes cromosómicos diferentes, el fliC para la primera fase y el fljB para la segunda, los cuales se expresan de manera alternada mediante el mecanismo de variación de fase flagelar. La responsable de este mecanismo es la unidad genética del operón fljAB, compuesta por la enzima ADN invertasa hin, que actúa como un interruptor molecular, seguida del gen fljA, que codifica un regulador negativo inhibidor de la expresión de la primera fase flagelar (fliC), y el gen fljB, que expresa la proteína flagelar de la fase dos 3,4. Estos serovares son bifásicos, es decir, son capaces de expresar ambos genes flagelares.

Salmonella enterica, subespecie enterica serovar Typhimurium (Typhimurium), es el principal serotipo a nivel mundial proveniente de muestras clínicas. La serotipificación de este serovar bifásico incluye el reconocimiento de las dos fases flagelares y su fórmula antigénica 1,4,[5],12:i:1,2. Sin embargo, en Europa y Estados Unidos, la variante de Typhimurium monofásica-STVM (1,[4],5,12:i:-), que se asocia con multirresistencia y no expresa la segunda fase flagelar, se cuenta entre las más frecuentemente recuperadas en los aislamientos clínicos 5,6. Dado que en la serotipificación solo se identifican las proteínas expresadas, estos aislamientos suelen clasificarse inicialmente como S. enterica subsp. enterica serovar (1,4,[5],12:i:-), o serovar monofásico, por lo que la confirmación de la variante STVM puede hacerse únicamente mediante técnicas moleculares como la PCR o la secuenciación de genoma completo.

En los informes internacionales, y mediante análisis filogenéticos, se han identificado varios clones de STVM con diferentes mecanismos de resistencia, perfiles de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y patrones de análisis de repetición en tándem de un número variable de múltiples locus 7-9, que se caracterizan por la pérdida de regiones genéticas a lo largo del cromosoma bacteriano o por la adquisición de elementos de resistencia a antibióticos y metales pesados, lo que sugiere la aparición de la STVM por medio de eventos independientes 10. Entre ellos, se destacan tres clones descritos por Soyer, et al.11: el clon europeo y el clon español, que son multirresistentes y carecen por completo del operón fljAB, pero difieren en el tipo de "secuenciotipo" ST34 y ST19, la ausencia y la presencia del gen iroB y el plásmido de virulencia de Salmonella, respectivamente, y el clon estadounidense, el cual es sensible a los antibióticos y conserva los genes hin e iroB.

Actualmente, el clon europeo es el predominante a nivel global. Todos los clones presentan grandes deleciones en el contenido del genoma. Además de estos clones reportados a nivel internacional, se han descrito clones endémicos en países como Bélgica, Japón y Estados Unidos, los cuales exhiben otros arreglos de genes en el operón fljAB11,12. En Colombia, predomina el serovar Typhimurium según los resultados obtenidos por el Programa de Vigilancia por el Laboratorio de la Enfermedad Diarreica Aguda del Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud 13,14 utilizando el esquema de Kauffmann-White-Le Minor 2.

Entre el 2015 y el 2017, el serovar identificado como Salmonella enterica subsp. enterica serovar (1,4,[5],12:i:-) se ubicó en el cuarto lugar de la vigilancia, con 180 aislamientos del total de 12.055. Mediante la caracterización genómica de 209 aislamientos colombianos de Typhimurium recuperados de hemocultivos, se confirmó que 16 de ellos, recuperados entre el 2015 y el 2016 y clasificados como serovar monofásico (1,4,[5],12:i:-), pertenecían a la variante STVM 15, aunque solo representaron, aproximadamente, el 9 % de los aislamientos monofásicos recuperados en el país.

Dado el rápido y reciente incremento de este serovar a nivel mundial y local, es importante confirmar si el total de aislamientos colombianos pertenecen a la variante STVM, con el fin de estar alerta ante un posible reemplazo de serovar. El objetivo del presente estudio fue confirmar si los aislamientos de S. enterica subsp. enterica serovar (1,4,[5],12:i:-) recuperados en el país durante el periodo de estudio correspondían a la STVM y a los clones ampliamente distribuidos, utilizando las pruebas de PCR, secuenciación de genoma completo (Whole Genome Sequencing, WGS), el fenotipo de crecimiento y los ensayos de motilidad.

Materiales y métodos

Aislamientos clínicos

Se analizaron 286 aislamientos clínicos de S. enterica subsp. enterica serovar (1,4,[5],12:i:-) recuperados de muestras de materia fecal (n=133), hemocultivo (n=105), orina (n=19), otras muestras (n=18) y aquellas sin datos (n=11) entre el 2015 y el 2018 por medio de la vigilancia por el laboratorio de la enfermedad diarreica aguda que se lleva a cabo en el Instituto Nacional de Salud (cuadro 1).

Cuadro 1 Total de aislamientos de Salmonella Typhimurium variante monofásica (1,4,[5],12:i:-), aislamientos positivos para el serovar STVM y porcentaje por año en Colombia 

Año n Positivas fliAB (%)
2015 58 41 70,7
2016 72 38 52,8
2017 52 34 65,4
2018 104 61 58,7
Total 286 174 60,8

La serotipificación se realizó siguiendo el esquema de Kauffman-White-Le Minor 2. La sensibilidad antimicrobiana se evaluó frente a ampicilina, ceftazidima, trimetoprim-sulfametoxazol, cefotaxima, cloranfenicol, tetraciclina y ácido nalidíxico mediante la técnica de difusión en disco de Kirby-Bauer y métodos semiautomatizados VITEK™, siguiendo las guías del Clinical and Laboratory Standards Intitute (CLSI) 16.

Para las pruebas de PCR, el ADN total se extrajo con el método de ebullición en 272 aislamientos 17. En los restantes 14 aislamientos, se secuenció genoma completo como parte del proyecto "10,000 Salmonella Genomes" mediante extracción con el paquete MagAttract™ (Qiagen), y la secuenciación con Illumina HiSeq4000™. Los números de acceso (Sequence Read Archive Accession Numbers) de los aislamientos se presentan en el cuadro 2 15,18. Se utilizó Typhimurium ATCC 14028 como cepa de referencia 19.

Cuadro 2 Aislamientos de Salmonella Typhimurium variante monofásica-STVM (1,4,[5],12:i:-) (n=23) seleccionados para curvas de crecimiento, pruebas de motilidad y expresión de OMP 

Código Año Muestra Resistencia Linaje clonal Número de acceso SRA
1 2015 Materia fecal TET Inconsistente No aplica.
2 2015 Materia fecal TET Variante atípica No aplica.
3 2016 Hemocultivo TET, CHL, NAL Variante atípica No aplica.
4 2016 Materia fecal TET Europeo-español No aplica.
5 2016 Materia fecal TET, CHL, SXT, AMP Europeo-español No aplica.
6 2017 Materia fecal TET, CHL, AMP Europeo-español No aplica.
7 2017 Orina Sensible Europeo-español No aplica.
8 2018 Hemocultivo CTX, CAZ Estados Unidos No aplica.
9 2018 Orina TET, NAL, AMP Estados Unidos No aplica.
10 2015 Hemocultivo TET, CHL, NAL Europeo-español SRR8740456
11 2015 Hemocultivo TET, CHL, NAL Europeo-español SRR8740455
12 2015 Hemocultivo TET, CHL, NAL Europeo-español SRR8740452
13 2015 Hemocultivo TET, CHL, NAL Europeo-español SRR8740488
14 2015 Hemocultivo TET, NAL Europeo-español SRR8740487
15 2016 Hemocultivo TET Europeo-español SRR8740503
16 2016 Hemocultivo TET, CHL Estados Unidos SRR8740534
17 2016 Hemocultivo TET Europeo-español No aplica.
18 2016 Hemocultivo TET, CHL, AMP Estados Unidos SRR8740536
19 2016 Hemocultivo TET, CHL Europeo-español No aplica.
20 2016 Hemocultivo TET, CHL Europeo-español No aplica.
21 2016 Hemocultivo Sensible Estados Unidos SRR8740431
22 2016 Hemocultivo TET, AMP Estados Unidos SRR8740430
23 2016 Hemocultivo TET, AMP Europeo-español SRR8740429

SRA: Sequence Read Archive ; CHL: cloranfenicol; NAL: ácido nalidíxico; TET: tetraciclina; CAZ: ceftazidima; AMP ampicilina; STX: trimetoprim-sulfametoxazol

Caracterización molecular

Para determinar cuáles de los aislamientos identificados como S. enterica subsp. enterica serovar (1,4,[5],12:i:-) correspondían a la STVM, se utilizó la PCR descrita por Echeita, et al.20, la cual se basa en la amplificación de la región intergénica de los genes del operón que codifica para la primera fase flagelar fliB-fliA.

Los aislamientos de Typhimurium específicamente tienen una inserción de un fragmento IS200 en esta región intergénica, lo que resulta en la amplificación de una banda de 1.000 pb, en tanto que la amplificación de esta región para los otros serovares de Salmonella genera un fragmento de 250 pb 20 (cuadro 3).

Cuadro 3 Oligonucleótidos utilizados en este estudio 

Blanco genético Oligonucleótidos Secuencia 5’-3’ Tamaño de amplicón (pb) Referencia
Región entre fliA y fliB fliA-fliB-F ctg gcg acg atc tgt cga tg 1.000 20
fliA-fliB-R gcg gta tac agt gaa ttc ac
fljA fljA-F ttc att agg tcc cct ccg g 1.049 11
fljAB-R att cag ccc cgt gaa ttc ggg
fljB fljBH-F ttt acc gtc tac gcc acc c 551 11
fljBH-R ggt act aca ctg gat gta tcg g
hin hinF-F tgg cta cta ttg ggt ata ttc ggg 473 11
hinF-R aat tca ttc gtt ttt tta tgc ggc

La secuencia hacia adelante se indica con "F" y la secuencia inversa con "R'.'

Se seleccionaron 54 aislamientos de los confirmados como STVM (cuadro 4) para evaluar la presencia de los genes del operón fljAB mediante tres juegos de iniciadores que amplifican las regiones intergénicas comprendidas entre los tres genes del operón (cuadro 3), según lo descrito por Soyer, et al.11, como se observa en la figura 1. En los 14 aislamientos estudiados con secuenciación de genoma completo, los genes del operón fljAB se analizaron in silico usando la herramienta bioinformàtica del Pathosystems Resource Integration Center (PATRIO: https://www.patricbrc.org/) 21.

Cuadro 4 Identificación de los genes del operón f¡AB mediante PCR en 54 aislamientos confirmados como STVM. Se muestran las configuraciones de los genes con relación a los clones descritos y el tipo de muestra clínica del cual fueron recuperados. 

Estructura del operón fljAB Muestra
Linaje clonal fljA fljB hin n (%) Materia fecal Hemocultivo Orina Otras muestras
Europeo-español - - - 35 (64,8) 16 15 1 3
Estados Unidos - - + 7(13) 1 5 1 0
Endémico - + + 7(13) 4 2 0 1
Inconsistente + + + 3 (5,6) 3 0 0 0
Variante atípica - + - 2 (3,7) 1 1 0 0
Total 54 25 23 2 4

Figura 1 Organización genética del operón fljAB en Typhimurium. El tamaño de amplificación (pb) esperado para los genes del operón se encuentra señalado por flechas de color azul flanqueadas por el nombre de los respectivos oligonucléotidos. 

Análisis estadístico

Mediante la prueba de ji al cuadrado (estadísticamente significativo: p<0,05), se determinó la relación entre el tipo de muestra (hemocultivo o materia fecal) en el que se recuperó el aislamiento STVM y la identificación del clon europeo-español por ser el predominante.

Caracterización fenotípica

De los 54 aislamientos de STVM caracterizados, se seleccionaron 23 representativos de diferentes tipos de muestra y clones para evaluar la curva de crecimiento y hacer las pruebas de motilidad (cuadro 2). Se utilizó el medio Luria Bertani para imitar las condiciones del intestino delgado, donde la bacteria tiene todos los nutrientes a su disposición y una alta osmolaridad 17.

Para simular las condiciones dentro del macròfago, se preparó el medio mínimo M9 con glucosa al 20 % como única fuente de carbono 17. Se emplearon los medios nutritivos Luria Bertani y mínimo M9 para las curvas de crecimiento en medio líquido a las 24 horas y las pruebas de motilidad en agar blando al 0,3 % a las 8 y las 24 horas, hechas por triplicado siguiendo a Bogomolnaya, et al.22. Las proteínas de membrana externa (Outer Membrane Proteins, OMP) se obtuvieron de los aislamientos de STVM sembrados en los medios mínimo M9 y nutritivo Luria Bertani hasta una DO600 de 0,6 y se corrieron en SDS-PAGE con acrilamida/bisacrilamida al 10 %, según lo descrito por Villarreal, et al.23.

Resultados

En Colombia circulan aislamientos de Typhimurium de la variante monofásica (STVM).

El 61 % (n=174) de los 286 aislamientos serotipificados como Salmonella entérica subsp. entérica serovar (1,4,[5],12:¡:-) entre el 2015 y el 2018, correspondieron a STVM (cuadro 1); el 39 % (n=112) restante, sin expresión de la segunda fase flagelar, podrían estar relacionados con otros serotipos de fórmula antigénica similar a Typhimurium como el serovar Lagos (4,[5],12:i:1,5), el serovar Agama (4,12:i:1,6), el serovar Tsevie (4,12:i:e,n,z16), y el serovar Tumodi (1,4,12:i:z6) (11), aunque esto no se confirmó.

De los 174 aislamientos confirmados como STVM, 81 (46,5 %) provenían de muestras de materia fecal, 66 (38 %) de hemocultivo, 11 (6,3 %) de orina, 9 (5,2 %) de otras muestras y 7 (4 %) no contaban con información registrada.

Se analizó la estructura del operón fljAB en 54 de ellos mediante PCR y secuenciación de genoma completo (cuadro 4) y se encontró que el 64,8 % (n=35) presentaba una deleción total del operón, similar a la reportada en el clon europeo-español 24. Siete (13 %) aislamientos perdieron la parte inicial del operón (ausencia del gen fljA) y conservaron los otros dos genes fljB-hin; estas modificaciones, que no son muy comunes, se identificaron como clones endémicos. De estos, el 5,6 % (n=3) portaba el operón completo y el restante 3,7 % (n=2) correspondía a las denominadas variantes monofásicas "atípicas" de Typhimurium, según lo descrito por Hopkins, et al.25, las cuales portan el gen que codifica para la proteína flagelar de segunda fase (fljB), pero no la expresan al no poseer el promotor del operón fljAB ni el represor de la proteína FliC (cuadro 4, figura 2).

Figura 2 Esquema que representa los patrones de deleción de genes en el operón fljAB. A) Estructura del operón fljAB de la cepa de referencia Typhimurium ATCC 14028. B) Deleción completa del operón fljAB en el clon europeoespañol. C) Arreglo genético del clon estadounidense. D) Arreglo genético de la variante endémica atípica que conserva el gen fljB y el gen hin. E) Variante inconsistente que conserva el operón fljAB completo. F) Variante atípica que conserva el gen fljB. Se indica el porcentaje de cada linaje derivado del cuadro 3

No se observó correlación estadística entre el tipo de muestra del aislamiento (hemocultivo, materia fecal) y el clon europeo-español (p=0,910; OR=0,937) (cuadro 4).

En los 23 aislamientos seleccionados para las pruebas de curva de crecimiento y motilidad, se observó resistencia a tetraciclina en el 87 % (20/23), a cloranfenicol en el 478 %, a ácido nalidíxico en el 30,4 % y a ampicilina en el 26 %. Nueve aislamientos fueron resistentes a tres antimicrobianos y la combinación predominante fue la de tetraciclina, cloranfenicol y ácido nalidíxico en el 21,7 % de ellos (cuadro 2).

El crecimiento bacteriano de estos aislamientos, evaluado tanto en medio nutritivo Luria Bertani como en medio mínimo M9, no se vio afectado en comparación con la cepa de referencia ATCC 14028 (no se presentan los datos), con excepción de los aislamientos provenientes de muestras de orina (denominados 7 y 9), los cuales alcanzaron una DO a 600 nm de 0,136 y 0,803, respectivamente, después de 24 horas, lo que sugiere que hubo inhibición del crecimiento en el medio mínimo.

Estos dos aislamientos también presentaron motilidad disminuida o nula en el medio Luria Bertani a las 24 horas (figura 3). En el medio mínimo M9, se evidenció una disminución de la motilidad en la mayoría de los aislamientos en estudio; por otra parte, la cepa del aislamiento 1 presentó mayor motilidad comparada con la cepa de control, en tanto que las de los aislamientos 7, 9 y 20 presentaron motilidad disminuida o nula (figura 3).

Figura 3 Evaluación de la motilidad en aislamientos clínicos de STVM. La motilidad se evaluó a las 8 y 24 horas de incubación a 37 °C en placas con agar blando (0,3 %) y suplemento de LB (fila superior) o medio mínimo M9 (fila inferior). En la figura se muestran los aislamientos 1, 7, 9, 20, los cuales registraron diferencias en la motilidad con respecto a la cepa de control ATCC 14028, y el aislamiento 6 a manera de comparación general del comportamiento de los restantes 17 aislamientos. 

No se observó un cambio aparente en la expresión de las principales porinas (OmpC, OmpF, OmpD y OmpA) de las STVM, con excepción de los aislamientos 7, 8 y 9, en los cuales se observó que la porina OmpD desapareció en el medio mínimo M9, y hubo una disminución aparente en la porina OmpA en las muestras 6 y 7 (figura 4).

LB: crecimiento en Luria Bertani; M9: crecimiento en medio mínimo M9

Figura 4 Patrones electroforéticos de preparaciones de proteínas de membrana externa separadas por SDS-PAGE al 10 % y teñidas con azul de Coomassie a partir de los aislamientos que mostraron diferencias en la motilidad (aislamientos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9) en comparación con la cepa de control ATCC 14028. Se observa una disminución en la expresión de OmpD en el medio mínimo en los aislamientos 7, 8 y 9. Al margen derecho de la imagen, se observa una sección del marcador de peso molecular. 

Discusión

La variante monofásica de Typhimurium ha circulado a nivel mundial durante las últimas dos décadas 9, y representa el tercer serovar más aislado en la Unión Europea, en tanto que en Estados Unidos es de los más frecuentes entre los 20 serovares más comunes 5,6,26,27. Este serotipo se identificó por primera vez a finales de los 80 en aves de corral de Portugal 28 y, a partir de entonces, se ha convertido en uno de los principales serotipos asociados con la cadena alimentaria porcina, lo que sugiere una transmisión directa de la infección en humanos a partir del consumo de productos contaminados derivados del cerdo en Europa, Estados Unidos y China 10,29-32.

Además de Estados Unidos, en países del resto de América como Canadá y Brasil, la STVM también se encuentra en los cinco primeros lugares de aislamientos provenientes de muestras de humanos, en tanto que el 100 % de los aislamientos de animales de engorde en estos países corresponde a dicha variante 33,34, En Argentina solo existe un reporte reciente de su presencia en granjas de cerdos 35. En Colombia, en solo cinco años desde su primera identificación en aislamientos clínicos, la variante monofásica se ubicó en el cuarto lugar de la vigilancia, lo que evidencia su capacidad de diseminación 14. La variante STVM fue confirmada recientemente en aislamientos clínicos recuperados de hemocultivos con los secuenciotipos ST19 y ST34, resistentes a uno o dos antimicrobianos, lo que los diferencia de los clones español y europeo multirresistentes 15.

En el presente estudio, se confirmaron los resultados obtenidos previamente sobre la presencia de esta variante en el país, pues el 61 % de los aislamientos amplificaron el marcador para STVM, así como el predominio de los clones europeo-español. La caracterización por PCR y la secuenciación de genoma completo también evidenciaron que el clon estadounidense y el clon endémico ocuparon el segundo lugar, así como la presencia de clones identificados como variantes inconsistentes y atípicas. La detección de esta gran variedad de clones en el país sugiere múltiples fuentes de infección asociadas, probablemente, con las diferentes cadenas pecuarias. Nuestros resultados concuerdan con el panorama mundial de diseminación del clon europeo de la STVM, el cual ha reemplazado a los otros dos 36.

Desde el punto de vista epidemiológico, la STVM tiene una estrecha relación con la cadena porcícola, principalmente en Europa y Estados Unidos, lo que sugiere una relación directa entre estos productos alimenticios y las infecciones en humanos. También se recupera de otras fuentes, como el ganado y las aves, lo que demuestra que es una variante con un amplio rango de huéspedes 9.

Hasta la fecha en el país, no hay estudios que reporten la presencia de STVM en la cadena porcícola; sin embargo, dado que el consumo de alimentos contaminados es una de las fuentes de la enfermedad diarreica aguda, una hipótesis es que estos aislamientos provienen principalmente de cerdos y están asociados con el clon español, cuyo principal reservorio es el cerdo 37. En este sentido, es importante mencionar los múltiples reportes de Typhimurium en comidas rápidas callejeras, en carne de pollo cruda 38,39, carne de cerdo 40 y alimentos listos para el consumo humano 41, que podrían ser el antecedente para la aparición y rápida diseminación de la STVM, ya que su evolución a partir de aislamientos de Typhimurium ha sido confirmada por varios autores mediante diversas técnicas moleculares y secuenciación de genoma completo en los últimos tiempos 20,25,37,42.

Para verificarlo, se requieren estudios de búsqueda de la STVM en granjas, animales o alimentos derivados de cerdos, pues con base en los hallazgos que aquí se presentan, se esperaría una estrecha relación con los aislamientos analizados.

En cuanto a las características fenotípicas de los aislamientos de STVM, por lo general, la ausencia de la segunda fase flagelar no altera el crecimiento ni la motilidad de los aislamientos evaluados. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Crayford, et al., quienes observaron que los aislamientos monofásicos conservan la habilidad de adherirse e invadir las células epiteliales del intestino de cerdo in vitro43.

Sin embargo, algunas particularidades observadas en este estudio llaman la atención: el aislamiento 1, considerado inconsistente, tuvo una motilidad incrementada en el medio mínimo M9 y, aunque contenía los tres genes del operón fljAB, no expresó la segunda fase flagelar, lo cual puede deberse a un bloqueo del promotor que controla la expresión de fljB y fliC o a mutaciones puntuales en estos genes 12, en tanto que los aislamientos 7 y 9, provenientes de muestras clínicas de orina, correspondieron a clones diferentes, presentaron motilidad disminuida o nula, así como una disminución en la expresión de OmpD en el medio mínimo M9.

Dados los alcances de este estudio, no se pudo establecer una asociación directa entre las características de los aislamientos y el tipo de muestra o infección del cual fueron recuperados, para lo que se requerirán más estudios. Las infecciones urinarias por Salmonella no son frecuentes y este tipo de muestra se puede recuperar por colonización directa de la uretra o por diseminación hematógena a partir del aparato gastrointestinal 44. El papel de la porina OmpD en infecciones urinarias por Salmonella se desconoce; sin embargo, se ha demostrado que su represión puede ser necesaria para una eficiente proliferación intracelular de Salmonella45, así como para favorecer la supervivencia dentro del macrófago y aumentar la infección sistémica en modelos en ratón 46, lo que sugiere que la represión de OmpD en la STVM podría requerirse en infecciones urinarias. Será necesario hacer otros estudios para aclarar este punto.

Por último, en el estudio se demostró la circulación de STVM en aislamientos clínicos colombianos relacionados con los clones europeo-español y estadounidense, con una posible fuente de transmisión zoonótica y las características fisiológicas descritas para Typhimurium, excepto en dos aislamientos recuperados de muestras de orina. Estos hallazgos sugerirían una relación entre la STVM y su virulencia, lo cual debe confirmarse en futuros estudios.

Agradecimientos

Este trabajo fue desarrollado en el laboratorio del Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud - Colombia, y en colaboración con el "Proyecto 10.000 genomas de Salmonella" de la Universidad de Liverpool. Agradecemos la colaboración de los investigadores Jay C. D. Hinton y Blanca Pérez Sepúlveda de la Universidad de Liverpool, por la secuenciación de los genomas de Salmonella.

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Contribución de los autores: Paloma Cuenca-Arias: desarrollo de los experimentos Lucy Angeline Montaño: caracterización de aislamientos José Miguel Villarreal: diseño de los experimentos y discusión de resultados Magdalena Wiesner: desarrollo y diseño de los experimentos y discusión de resultados Todo los autores participaron en el análisis de los resultados y en la escritura del manuscrito.

Financiación: Esta investigación fue financiada por Colciencias, proyecto SIGP 210471250745, por los fondos internos del Instituto Nacional de Salud de Colombia y por el Global Challenges Research Fund (GCRF) (Data & Resources Grant BBS/OS/GC/000009D) otorgada al Earlham Institute y a la Universidad de Liverpool, Reino Unido.

Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Recibido: 20 de Febrero de 2020; Aprobado: 29 de Julio de 2020

*Correspondencia: Magdalena Wiesner, Grupo de Microbiología, Subdirección de Investigación Científica y Tecnológica, Dirección de Investigación en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle 26 N° 51-20, CAN, Bogotá, D.C., Colombia Teléfono: (571) 220 7700, extensión 1558 mwiesner@ins.gov.co; mawire@gmail.com

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