Área de estudio

El estudio se llevó a cabo en las localidades rurales y urbanas de los municipios del Área Metropolitana del Valle de Aburrá, ubicado entre la latitud 6°03'18"N - 6°26'34"N y longitud 75°38'37"O - 75°19'38"O. La densidad poblacional en los municipios del estudio, de acuerdo con el censo nacional del 2018, es de 3'555.938 habitantes, distribuidos en 2'184.192 viviendas, con una media de 3,1 personas por hogar ¹¹.

Criterios de inclusión y exclusión

El estudio vinculó por participación voluntaria a propietarios de animales de compañía -perros, gatos o ambos- que se encontraban dentro del periodo de 14 días de incubación de la COVID-19; estos casos se confirmaron como positivos por pruebas moleculares RT-qPCR o pruebas de antígeno, practicadas por un laboratorio avalado por el Instituto Nacional de Salud para diagnosticar el SARS-COV-2, de acuerdo con lo establecido en las directrices del Ministerio de Salud y Protección Social de Colombia ¹².

En los casos en que se requirió utilizar contención química, se excluyeron los animales que por anamnesis tuvieron historial de falla renal, hepática o ambas, o que presentaron signos de anemia en la valoración clínica general o eran hembras gestantes, para evitar contraindicaciones en las mascotas por efectos secundarios de los fármacos.

Reclutamiento de los casos y variables epidemiológicas

Se utilizó una pieza publicitaria que se difundió en las diferentes redes sociales. El primer filtro de las personas interesadas se hizo por medio de un sondeo telefónico y electrónico que evidenciara y asegurara los criterios de inclusión a la investigación. Posteriormente, se agendó un encuentro virtual utilizando la plataforma de uso abierto Google Meet, en el cual se informó, diligenció y aceptó por medio digital el consentimiento informado. Se registraron datos demográficos, el cuadro clínico de la persona, los antecedentes médicos, la frecuencia del contacto con la mascota, y los datos del animal doméstico, como: raza, edad, sexo, signos clínicos aparentes en las últimas dos semanas, antecedentes de morbilidades, y plan de vacunación y desparasitación. Finalmente, se programaron el día y la hora para tomar la muestra de la mascota.

Toma de muestras y transporte

Para la atención de las mascotas y el muestreo, se empleó el equipamiento de protección personal, de acuerdo con las directrices del Ministerio de Salud y Protección Social ¹³. La mascota se evaluó por medio de un examen físico general, en el que se tomó la temperatura rectal y, luego de una correcta sujeción física, se obtuvo la muestra para los análisis moleculares. Esta se obtuvo mediante frotis nasofaríngeo y orofaríngeo, moviendo circularmente el escobillón por un tiempo entre 20 y 30 segundos por cavidad, y, de acuerdo con la metodología descrita por Shi, et al.¹⁴,

Los dos hisopos de marca Nasal Swab-Goodwood Medical Care Ltd. (Ref. GW-1237NP China) utilizados por mascota, se almacenaron en un mismo medio de transporte viral (Instituto Colombiano de Medicina Tropical - CES, Sabaneta, Colombia) y se rotularon con el código asignado a cada animal. Posteriormente, se transportaron refrigerados y, en menos de 5 horas, se almacenaron a -80 ± 5 °C en el ultracongelador del Laboratorio de Diagnóstico Clínico Veterinario de la Unilasallista Corporación Universitaria, para su posterior análisis. La metodología de toma y conservación de las muestras siguió las directrices de la guía "Considerations for sampling, testing, and reporting of SARS-CoV-2 in animals" versión 7 de la Oficina Internacional de Epizootias ¹⁵.

En los casos de mascotas agresivas, con fobias, estrés o ansiedad que dificultaron la contención física, se aplicó, con el consentimiento del propietario, acepromazina a 10 mg/ml/kg, combinada con tramadol a 50 mg/ mlL por vía parenteral.

Análisis experimental y diagnóstico en el laboratorio

Controles internos de la PCR

Como control interno, para asegurar que las muestras efectivamente hayan recuperado ácidos nucleicos del animal, se amplificó por PCR en tiempo real un fragmento de gen constitutivo de p-actina de perro y gato, utilizando las secuencias de los cebadores descritos en el cuadro 1. La reacción se amplificó con 10 μl de 2X fast- q-PCR SYBR® (Finnzymes, Espoo, Finlandia), con una concentración final de 400 nM de cada cebador y 6,4 μl de agua libre de nucleasas (Fisher BioReagents, USA); además, se agregaron 2 μl de ARN/ ADN extraído con el reactivo vNAT Viral Nucleic Acid Buffer.

Las condiciones del termociclador se establecieron según la metodología descrita por Peleg, et al.¹⁸ para amplificar la p-actina canina y, según lo descrito por Yamashita-Kawanishi, et al.¹⁹, para las muestras de los gatos. Se calcularon la mediana del umbral de ciclos (Cycle Threshold, Ct) y la temperatura de fusión (Tm).

Todos los montajes de PCR incluyeron un control positivo (SARS-CoV-2 plásmido) incluido en el kit para la detección del virus. Para la RT-PCR de p-actina canina, se utilizó ADN de la cepa E. canis (NCBI: MT472834)). Tanto en las extracciones como en las PCR, siempre se incluyó agua libre de nucleasas como control negativo.

Detección molecular de SARS-CoV-2

Se empleó la técnica RT-qPCR como tamizaje de detección de carga viral, amplificando el gen RdRp del SARS-CoV-2 y siguiendo las instrucciones del fabricante del kit comercial Logix Smart ^TM Coronavirus (COVID-19) de la marca Co-Diagnostic Inc (Salt Lake City, USA), en el termociclador para PCR en tiempo real Rotor-Gene Q de la marca Qiagen © (Hilden, Alemania).

Las muestras positivas se sometieron a una segunda RT-qPCR, utilizando el kit comercial 1copy™ COVID-19 qPCR Triplex Kit de la marca 1drop Inc (Gyeonggido, República de Corea) para amplificar los genes N y E de SARS-CoV-2. Para la amplificación de mínimo dos genes, las muestras confirmadas como positivas fueron procesadas por PCR anidada, utilizando los marcadores universales para la región RdRp de los coronavirus (cuadro 1). La primera amplificación de RT-PCR se llevó a cabo utilizando Verso 1-Step qRT-PCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU). Cada 25 μl de reacción contenían 0,25 μl de verso Enzime Mix, 12,5 μl 2X 1-Step qPCR Mix, 1,25 Ul de RT Enhancer, 0,2 μM de cada cebador (pan-CoV outF y pan-CoV R), 2 μl de muestra y agua libre de nucleasas hasta completar el volumen de 25 μl. Las condiciones térmicas de la PCR se establecieron a 55 °C durante 30 minutos para la transcripción inversa; seguidos de una incubación a 95 °C durante 15 minutos. Posteriormente, 30 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 54 °C por 30 segundos y 68 °C por 60 segundos. Finalmente, una extensión de 68 °C durante cinco minutos.

La segunda PCR convencional se practicó en un volumen final de 50 μl, utilizando 2 μl de producto amplificado de la primera RT-PCR, 1U de TopTaq DNA Polymerase (Qiagen, Chatsworth, CA EE. UU), 1x TopTaq PCR Buffer, 1X coralload, 0,2 μM de cada cebador (pan-CoV_inF y pan-CoV_R), 200 μM de cada dNTP, y agua ultrapura para completar el volumen final de 50 μl. La PCR se hizo utilizando un protocolo de ciclado de 94 °C durante tres minutos, y 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante un minuto y 72 °C durante 37 segundos, seguido de un ciclo de 72 °C durante 10 minutos. Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis de gel de agarosa Tris Acetato-EDTA al 2 %, y se visualizaron mediante tinción con ADN GelRed 20X (Biotium®, Fremont, CA, USA). Las muestras que presentaron productos de PCR visibles correspondientes a 600 pares de bases (pb), se consideraron positivas para el RdRp de SARS-CoV-2.

Secuenciación y análisis filogenéticos

Los productos positivos de la RT-PCR fueron purificados y secuenciados en el Laboratorio de Secuenciación y Análisis Molecular (SSiGMol) del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Se purificaron utilizando BigDye XTerminator Purification Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) y se secuenciaron en el equipo ABI 3500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), con un capilar de 50 cm y mediante la técnica de electroforesis capilar.

Las secuencias nucleotídicas obtenidas se ensamblaron y editaron en los programas Chromas, versión 2.6.6 (Technelysium Pty Ltd) y Bioedit de licencia abierta (Nucleics, Hong Kong, China) ²⁰. Las alineaciones se realizaron utilizando MUSCLE, y se ajustó el modelo Jukes y Cantor (1969) de sustitución de ADNc para calcular las puntuaciones BIC (criterio de información bayesiano) y los valores de máxima verosimilitud (lnL), utilizando el programa MEGA versión 11 ²¹.

Los valores de bootstrap se calcularon después de 1.000 repeticiones, y el análisis filogenético se hizo con los programas MEGA, versión 11, IQ Tree COVID-19 - versión 2.1.3. ²², y iTol, versión 6.3.2 ²³. Se utilizaron las bases de datos de NCBI Genbank y GISAID para descargar las secuencias de referencia Human Wuhan-Hu-1 266-21555 (NC045512), las secuencias de cada linaje del virus reportadas en Antioquia, una secuencia de las primeras reportadas en Colombia, y las secuencias disponibles de SARS-CoV-2 reportadas en gatos o perros. Las dos secuencias encontradas en el estudio se ingresaron y se encuentran disponibles con los siguientes códigos de acceso: OK444145 y OK556702 en GenBank, y EPI_ISL_5155468 y EPI_ ISL_5321779 en GISAID.

Interpretación de los casos

Según los criterios establecidos por la Oficina Internacional de Epizootias, los resultados se calificaron como: i) positivo confirmado, respecto de aquella muestra donde se amplificaron mínimo dos genes con o sin secuenciación, ii) caso no concluyente, cuando se amplificó un solo gen, y iii) negativo, para las muestras en las que no se amplificó ningún gen objetivo, ¹⁵.

Análisis estadístico

Se hizo el análisis descriptivo de las características de los participantes del estudio y sus mascotas, y se registraron las frecuencias y los porcentajes para las variables categóricas. La concordancia de los dos métodos de extracción del material genético empleado para detectar el SARS-CoV-2, se analizó mediante el índice kappa con un nivel de significancia del 95 % y una p menor de 0,05. Asimismo, se estimaron las medianas del umbral de ciclos (Ct) para cada uno de los genes objetivos de la RT-qPCR. Finalmente, se procedió calculando la prevalencia puntual y la tasa de morbilidad. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa estadístico SPSS® v. 25, y JASP 0.14.1.0 (software gratuito).

Consideraciones éticas

El proyecto fue aprobado por el Comité de Bioética de Unilasallista Corporación Universitaria (radicado 31082020). Con firmas digitales de todos los propietarios de los animales, se obtuvo el consentimiento informado para obtener los datos de la encuesta y aceptar las políticas de confidencialidad, y, además, el consentimiento para el examen clínico y la toma de muestras de sus mascotas.

Características epidemiológicas de los casos de COVID-19 y sus mascotas

Entre el segundo semestre de 2020 y el primer semestre del 2021. se recolectaron 80 muestras de casos de COVID-19. La mayoría de los participantes fueron mujeres menores de 29 años para el 50 % de las observaciones. Las técnicas moleculares de RT-qPCR representaron la mayor frecuencia (66,3 %) entre los diferentes métodos diagnósticos para confirmar el SARS-CoV-2.

De los 80 casos con diagnóstico de COVID-19, cinco (6,3 %) pacientes fueron hospitalizados e ingresaron en una unidad de cuidados intensivos, siete (8,8 %) cursaron la enfermedad sin síntomas aparentes, y 68 (84,9 %) exhibieron signos clínicos leves sin complicaciones y se aislaron en sus casas. En cerca del 50 % de los casos, no se reportaron enfermedades concomitantes asociadas; en el resto, se presentaron enfermedades crónicas cardiovasculares, respiratorias y metabólicas.

Las viviendas eran ocupadas por 3 (± 2) personas, en promedio, y la razón de infección en la vivienda fue, en promedio, de un infectado por cada persona en contacto con un positivo pero negativa para SARS-CoV-2 (1:1). En la mayoría de los casos, la persona infectada se aisló junto con su mascota. Las frecuencias epidemiológicas de estas variables se muestran en el cuadro 2.

De las 80 mascotas, 31 (38,8 %) fueron gatos y (61,2%) 49 perros. La edad fue de 4 (± 3) años en promedio, incluyéndose desde un cachorro de 6 meses hasta un geriátrico, de 17 años para el caso de los gatos y de 12 años para los perros.

En 56,3 % de las mascotas no se diagnosticaron comorbilidades, mientras que 11,3 % presentaron, enfermedades infecciosas gastrointestinales y trastornos digestivos en algún momento de su historia clínica. Por otra parte, en el 32,4 % restante se reportaron trastornos metabólicos o infecciones respiratorias. En el examen médico veterinario previo a la toma de la muestra, el 71,2 % no presentó signos clínicos aparentes, el 18,8 % tuvo episodios de tos y estornudos, el 7,5 % mostró signos gastroentéricos como diarrea y vómito, y el 2,5 %, secreciones conjuntivales (cuadro 3).

Pruebas diagnósticas para confirmar la infección natural en mascotas

En todas las muestras de gatos y perros se amplificó el fragmento de p-actina como control interno, asegurándose la recuperación de material genético del animal, con una mediana de umbrales de ciclos de 30,45 (RIQ=1,8-24,5) y temperatura de fusión de 73,2 °C para muestras de gatos y de 82,2 °C para las de gatos.

Cuatro muestras de gatos (Cat 010, Cat 014, Cat 017 y Cat 025) y dos de perros (Dog 042 y Dog 043) extraídas con la solución tampón vNAT Viral Nucleic Acid Buffer, amplificaron en el primer tamizaje por RT-qPCR para el gen RdRp. Además, el material extraído por el método MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation, además de amplificar las anteriores muestras, identificó otros tres gatos positivos (Cat 004, Cat 015 y Cat 019) y otros ocho perros positivos (Dog 005, Dog 007, Dog 010, Dog 015, Dog 019, Dog 024, Dog 034 y Dog 040).

Las medidas simétricas presentaron una moderada concordancia entre los dos métodos (p=0,000; IC_95% k=0,462). Para confirmar los casos, las muestras positivas se analizaron con los cebadores (primers) de los genes E y N. De los siete resultados no concluyentes en gatos, seis se confirmaron con los genes E y N; y, de los 10 no concluyentes en perros, únicamente tres se confirmaron amplificando el gen E y, en dos de ellos, también se amplificó el gen N (cuadro 4).

El promedio del umbral de ciclos fue de 32,16±4,4 para el gen RdRp, de 31,17± 5,1 para el N y de 33,57±4,3 para el E (figura 1). En cuanto a la RT-PCR anidada para el gen RdRp, de entre las anteriores muestras que amplificaron para mínimo dos genes, las muestras Cat 010, Cat 014, Cat 015, y Cat 017 generaron una banda entre 600 y 700 pb. La muestra Cat 019 generó una banda de aproximadamente 100 pb. Ninguna de las tres muestras de perros positivos confirmados PC amplificaron mediante esta prueba.

Figura 1 Distribución de los ciclos de cuantificación para los genes objetivos de SARS-CoV-2 en las muestras de gatos y perros 

Secuenciación y análisis filogenético

Dos de los seis productos positivos de gatos lograron secuenciarse. Al ingresarlas en el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), las secuencias virales del RdRp de las muestras Cat 010 (OK444145 -EPI_ISL_5155468) y Cat 017 (OK556702 - EPI_ISL_5321779), presentaron identidad genética, del 100 % (190/190) con respecto a la secuencia de referencia Wuhan-WIV04 (EPI_ISL_402124), y del 99 % (175-176) respectivamente para las secuencias Cat 010 y Cat 017. En la secuencia CAT 017, se encontró un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con un cambio en la posición 647, con sustitución del aminoácido serina (S) por isoleucina (I), o sea, la mutación NSP12 S647I.

De las 53 secuencias genéticamente idénticas según mutaciones no sinónimas que incluye el árbol filogenético, 41 se recuperaron de los linajes de SARS-CoV-2 reportados en Antioquia hasta el 20 de octubre de 2021. La secuencia consenso de Cat 017 mantuvo una identidad genética del 99 % a tres secuencias virales de humano: EPI_ISL_1629756, EPI_ISL_4666420 y EPI_ISL_739668, de los linajes B.1.398, B.1.36.19 y B.1.575.1, respectivamente, y todas pertenecientes al clado GH de SARS-CoV-2 (figura 2). Las secuencias humanas corresponden a pacientes del mismo municipio donde se encontraron los gatos positivos.

Figura 2 Árbol filogenético inferido utilizando las 54 secuencias previamente recuperadas en el GenBank y GISAD, mediante el método de máxima verosimilitud. Se muestra el árbol con la mayor probabilidad logarítmica (-1.141,39). Este análisis involucró 58 secuencias de aminoácidos. Hubo un total de 197 posiciones en el conjunto final de datos. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbour-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares, estimadas utilizando el modelo JTT, y luego seleccionando la topología con un valor de probabilidad logarítmico superior. 

La primera secuencia humana fue recolectada el 17 de diciembre de 2020 en el Hospital Universitario San Vicente Fundación, de una mujer de 19 años; la segunda data del 21 de octubre de 2020, adquirida de un joven de 21 años y registrada por el Laboratorio Departamental de Salud Pública de Antioquia, y la tercera se obtuvo el 22 de octubre de 2020 de una mujer de 61 años en el Instituto Nacional de Salud. Al ensamblar las secuencias de aminoácidos en Jalview 2.11.1.4, la misma posición de SNP S647I se presentó en las mismas tres secuencias de mayor identidad (figura 3).

Figura 3 Alineamiento de residuos visualizada con Jalview (http://www.jalview.org/) que muestra la secuencia referencia de SARS-CoV-2 (NC045512), algunos de los linajes reportados en Antioquia (EPI tomados de la base de datos EpiFlu™ de GISAID) y las secuencias de los gatos del estudio. Los aminoácidos en la posición 27, resaltados en blanco con el esquema de coloración de Clustalx, muestran los cambios de serina (S) por isoleucina (I); siendo la posición donde el aminoácido se conserva mínimamente. 

Descripción epidemiológica de los casos confirmados en animales

De los casos confirmados, el 66,7 % fueron animales machos y el 33,3 % hembras. La edad promedio fue de tres años de vida.

Respecto a enfermedades preexistentes, en un caso, el propietario reportó que su gato presentó peritonitis infecciosa felina un año atrás; en un perro de raza American bully se reportó hipotiroidismo y, en un pastor alemán, síndrome de mala absorción. Sin embargo, en el examen clínico general, el 55,5 % de los casos presentó un estado general aparentemente saludable, excepto un gato y un perro que presentaron vómito y diarrea en los cinco días anteriores a la toma de la muestra.

Cuatro de los 9 casos estuvieron en contacto directo con sus dueños positivos para COVID-19, de los cuales uno fue asintomático y los otros humanos presentaron signos leves de la enfermedad, al igual que los que cumplieron con el aislamiento. Cuatro casos de los animales positivos se presentaron al finalizar el primer pico de la pandemia en el país (octubre 2020), otros cuatro, a finales de diciembre de 2020 y enero 2021 (segundo pico), y uno, a mediados de abril (tercer pico) (cuadro 4).