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El género Candida es parte de la microbiota humana, aunque puede producir enfermedad en los sujetos predispuestos que presenten algún grado de inmunosupresión 1. Estas levaduras son agentes causales comunes de infecciones invasoras y localizadas 2.
La candidiasis vulvovaginal es una infección que afecta especialmente a las mujeres en edad fértil, y se presenta al menos un episodio en el 75 % de las mujeres sanas 3. Candida albicans es responsable de la mayoría de los episodios de la candidiasis vulvovaginal, seguida por C. tropicalis o C. glabrata3,4.
Los factores de virulencia de Candida spp. y los relacionados con el huésped, son determinantes en el proceso de interacción entre ellos 1. Estos factores de virulencia incluyen enzimas hidrolíticas que les permite a los agentes patógenos adherirse, penetrar e invadir los tejidos 1. Entre estas hidrolasas están las proteasas que degradan diferentes tipos de proteína como el colágeno y la queratina. Las mejor caracterizadas son del tipo de las aspartil-proteasas, endopeptidasas cuyo nivel de expresión estaría asociado con un incremento de su virulencia y la exacerbación de síntomas 1. Otras enzimas son las fosfolipasas que hidrolizan los glicerofosfolípidos y están relacionadas con la invasión activa de los tejidos 5.
Por otro lado, entre los factores relacionados con el huésped se destaca el exceso de estrógenos en la vagina que, a su vez, determina la colonización por Candida spp., que sería el primer paso hacia la candidiasis vulvovaginal; este cambio aún no es muy bien entendido 3.
El presente estudio tuvo como objetivo determinar las actividades de las fosfolipasas y las proteasas en aislamientos colonizadores y patógenos de mujeres gestantes de Cartagena de Indias, con el fin de contribuir a la compresión de la candidiasis vulvovaginal.
Materiales y métodos
Se determinó la actividad de las fosfolipasas y de las proteasas en 56 aislamientos provenientes de un estudio realizado en mujeres gestantes atendidas en la Clínica de Maternidad Rafael Calvo de Cartagena de junio a diciembre de 2014 3. Los datos sociodemográficos de las 76 mujeres gestantes que participaron en el estudio se muestran en el cuadro 1. En el cuadro 2 se presentan los diagnósticos clínicos y de laboratorio realizados a las pacientes.
Cuadro 1 Datos sociodemográficos de las pacientes gestantes (n=76), portadoras de las cepas aisladas de Candida spp. El porcentaje faltante no respondió la pregunta.
| Edad (años) | Origen % | Educación (años)* % | Ocupación % |
|---|---|---|---|
| Rango | Ciudad | >11 | Amas de casa |
| 16-36 | (Cartagena) | 10,4 | 90,8 |
| 63,2 | |||
| Media | Departamental | 11 | Estudiantes |
| 22,4 ± 6,07 | (pueblos e islas) | 46,1 | 3,9 |
| 36,2 | |||
| Moda | No respondió | 9-10 | Profesionales |
| 21 | 0,6 | 10,5 | 2,6 |
| <9 | |||
| Mediana | 15,6 | Otros | |
| 21 | No respondió (17,4) | 2,6 |
Cuadro 2 Frecuencia de diagnóstico médico frente a resultados de laboratorio en pacientes con diagnóstico de infección o colonización por Candida spp. (n=76)
| Diagnóstico médico | n (%) | Resultados de laboratorio | n (%) |
|---|---|---|---|
| Candidiasis | 22 (28,9) | Candidiasis | 15 (19,7) |
| Vaginosis bacteriana | 44 (57,9) | Vaginosis bacteriana | 12 (15,8) |
| Candidiasis-tricomoniasis | 1 (1,3) | Candidiasis - vaginosis bacteriana | 1 (1,3) |
| Tricomoniasis | 1 (1,3) | Infección bacteriana | 1 (1,3) |
| No diagnosticada | 8 (10,5) | Flora intermedia | 40 (52,6) |
| Microbiota normal | 40 (52,6) 7 (9,2) |
La clasificación de aislamientos colonizadores o patógenos se hizo de acuerdo con los criterios ya establecidos en un estudio previo 3. Los aislamientos conservados a -72 °C, se reactivaron en agar que contenía 4 % de Sabouraud (Merck, Alemania), a 37 °C por 24 horas.
Las cepas control utilizadas fueron: Candida albicans (ATCC 90028, referencia 0264 P, lote 264-19), Candida tropicalis (ATCC 750, referencia 0847 P, lote 84732-1), Candida glabrata (ATCC 64677, referencia 0226 P, lote 226-234), y Candida guillermondii (ATCC 6260, referencia R4601521 CL 1521, lote 1521).
Las actividades de fosfolipasas y proteasas se evaluaron por triplicado, según lo propuesto por Panizo et al.6, Ombrella et al.7 y Price et al.8. En el estudio para determinar la actividad de fosfolipasa, se utilizó un método semicuantitativo con yema de huevo; para la de proteasas, se usó un método semicuantitativo, utilizando agar de albúmina de suero bovino, para detectar la capacidad del microrganismo de producir la enzima.
Para preparar el inóculo, se recogieron de dos a tres colonias con ayuda de un asa estéril y se añadieron a 5 ml de solución salina estéril, hasta obtener una concentración de células equivalente a 0,5, según la escala de McFarland (aproximadamente 1-5 x 106 UFC/ml).
Para la actividad de fosfolipasa, se inocularon 5 µl de la suspensión de la colonia en tres puntos equidistantes en una placa de 90 mm servida, aproximadamente, con 20 ml del siguiente medio: 65 g de agar Sabouraud glucosado; 58,45 g de cloruro de sodio; 0,0554 g de cloruro de calcio, 80 ml de yema de huevo y agua destilada hasta completar un litro. El pH del medio se ajustó a 6,3.
Todas las pruebas se practicaron por triplicado en días diferentes. Las placas se incubaron a 37 °C en aerobiosis. Las lecturas se hicieron a las 24, 48 y 72 horas 2,3 con un calibrador Vernier. Los cálculos de la actividad de fosfolipasas se hicieron de acuerdo con el método descrito por Price et al.8; el coeficiente de actividad enzimática (Pz) se determinó midiendo el diámetro de crecimiento de la colonia entre el diámetro de la zona considerada como indicadora de la producción de fosfolipasa . Se midieron en diferentes tiempos y se calculó el promedio de los resultados de los triplicados. Tal y como fue descrito para C. albicans6,8, se consideraron resultados negativos aquellos en los que el valor de Pz fue igual a 1 (actividad nula); resultados positivos con actividad débil, aquellos con Pz <1 y ≥0,64; y con actividad fuerte, aquellos con Pz <0,64 8.
Este índice varía entre 0 y 1, y nos da una idea de la actividad enzimática de cada aislamiento. Los valores cercanos a 0 nos indican una máxima actividad de las fosfolipasas, mientras que valores próximos a 1, una baja actividad enzimática.
Para la actividad enzimática de las proteasas, se inocularon 5 µl de la suspensión de la cepa, preparada como se indicó previamente, en un medio que contiene: albúmina sérica bovina como única fuente de nitrógeno [0,5 g de fosfato dipotásico (Merck, Alemania)]; 0,04 g de sulfato de magnesio (Merck, Alemania); 1 g de cloruro de sodio (Merck, Alemania); 0,2 g de extracto de levadura (Oxoid, Reino Unido); 4 g de glucosa (Panreac, España); 0,5 g de albúmina sérica bovina (Merck, Alemania), y 4 g de agar-agar (Merck, Alemania), todo diluido en 200 ml de agua destilada 6,7.
Se calculó el coeficiente de actividad enzimática (Pz) como se describió anteriormente y se usó la escala descrita por Panizo et al. para medir la actividad fosfolipasa que se agrupa en cinco clases: negativa 1, débil (0,9 a 0,99), media (0,89 a 0,8), alta (0,79 a 0,7) y muy alta (menor de 0,69). Se compararon las actividades enzimáticas entre los aislamientos colonizadores y los patógenos, para lo cual se utilizó la prueba de ji al cuadrado, mediante el programa estadístico SPSS™, versión 25. Los valores de p menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
En el estudio se observó que los aislamientos presentaron mayor actividad de fosfolipasas que de proteasas. Se encontró una actividad de fosfolipasa muy alta (cercana a 0) en 34 (60,71 %) de los aislamientos, alta en 5 (8,92 %), débil en 1 (1,78 %), media en ninguno y negativa (igual a uno) en 16 (28,57 %) del total (n=56) de aislamientos estudiados (n=56) de los cuales, 41 (73,21 %) correspondían a cepas colonizadoras y 15 (26,78 %) a cepas patógenas. En el cuadro 3 se muestran las frecuencias y porcentajes por especies.
Cuadro 3 Frecuencia y porcentaje de especies de Candida spp, colonizadoras y patógenas (n=56). Los cultivos fueron positivos en 54 pacientes, pero en dos muestras hubo crecimiento de dos especies.
| Especies | Colonizadora (n=40) | Patógena (n=16) |
|---|---|---|
| n (%) | n (%) | |
| Candida albicans | 24 (60) | 10 (62,5) |
| Candida tropicalis | 3 (7,5) | 1 (6,3) |
| Candida krusei | 2 (5,0) | 1 (6,3) |
| Candida parapsilosis | 2 (5,0) | 1 (6,3) |
| Candida dubliniensis | 1 (2,5) | 1 (6,3) |
| Candida glabrata | 2 (5,0) | 0 |
| Candida lusitaniae | 1 (2,5) | 0 |
| Candida norvegensis | 1 (2,5) | 0 |
| Candida spp. | 4 (10) | 2 (12,5) |
Al comparar las actividades de fosfolipasas entre los aislamientos colonizadores y los patógenos, no hubo diferencia significativa en los dos grupos (p=0,671). Cuando se evaluó la actividad enzimática entre especies, se encontró que la actividad de las fosfolipasas fue muy alta en 27 aislamientos de C. albicans (cuadro 4).
Cuadro 4 Actividad de fosfolipasas de especies de Candida spp. en el total de aislamientos evaluados (n=56). Los valores altos son cercanos a cero y, los negativos, iguales a 1.
| Actividad de fosfolipasas | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Negativa | Débil | Media | Alta | Muy alta | Total | |
| Especie | ||||||
| Candida albicans | 2 | 1 | 0 | 4 | 27 | 34 |
| Candida dubliniensis | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Candida tropicalis | 2 | 0 | 0 | 0 | 3 | 5 |
| Candida parapsilosis | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 |
| Candida krusei | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3 |
| Candida glabrata | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| Candida lusitaniae | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Candida norvengensis | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Candida spp. | 4 | 0 | 0 | 0 | 2 | 6 |
| Total | 16 | 1 | 0 | 5 | 34 | 56 |
La actividad de proteasas fue negativa en 39 (69,64 %) cepas, débil en 1 (1,78 %), media en 1 (1,78 %), alta en 1 (1,78 %) y muy alta en 14 (25 %) del total de 56 aislamientos estudiados (n=56). No hubo diferencias significativas en la actividad de proteasas, entre los aislamientos colonizadores y los patógenos (p=0,366). Según las especies, la actividad de proteasas fue muy alta en 8 aislamientos de C. albicans (cuadro 5). Los resultados sobre la actividad de ambas enzimas en los aislamientos colonizadores y los patógenos, se muestran en las figuras 1 a 4.
Cuadro 5 Actividad de proteasas de especies de Candida spp. en todos los aislamientos evaluados (n=56). Los valores altos son cercanos a cero y los negativos, iguales a 1.
| Actividad de fosfolipasas | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Negativa | Débil | Media | Alta | Muy alta | Total | |
| Especie | ||||||
| Candida albicans | 23 | 1 | 1 | 1 | 8 | 34 |
| Candida dubliniensis | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Candida tropicalis | 3 | 0 | 0 | 0 | 2 | 5 |
| Candida parapsilosis | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| Candida krusei | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 |
| Candida glabrata | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| Candida lusitaniae | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| Candida norvengensis | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| Candida spp. | 5 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 |
| Total | 39 | 1 | 1 | 1 | 14 | 56 |
Figura 1 Actividad de fosfolipasas por especie de Candida spp. en los aislamientos colonizadores (muy alta < 0,69; alta = 0,79-0,70; media = 0,89-0,80; débil = 0,9-0,99; negativa = 1)
Figura 2 Actividad de proteasas por especie de Candida spp. en los aislamientos colonizadores (muy alta < 0,69; alta = 0,79-0,70; media = 0,89-0,80; débil = 0,9-0,99; negativa=1
Figura 3 Actividad de fosfolipasas por especie de Candida spp. en aislamientos patógenos (muy alta <0 ,69; alta = 0,79-0,70; media = 0,89-0,80; débil = 0,9-0,99; negativa = 1)
Discusión
La virulencia de las especies de Candida depende de diferentes factores, entre los cuales se destacan las enzimas hidrolíticas con actividades de esterasas, fosfolipasas, hemolíticas y proteolíticas, que facilitan la adhesión e invasión de los tejidos 1,9,10. La actividad de fosfolipasas se ha determinado en diferentes estudios de candidiasis vulvovaginal 4,7,11,12. Fule et al. solo encontraron actividad de fosfolipasa en C. albicans y no en especies no albicans; el 56,6 % de los aislamientos mostraron un coeficiente muy alto 4. En el presente estudio, se halló una actividad muy alta en 27 aislamientos de C. albicans, pero también, en aislamientos de C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei y otras especies de Candida.
En el estudio de Shirkani et al. no se encontró correlación entre la actividad de fosfolipasa y la candidiasis vulvovaginal 13. En el presente estudio, tampoco se hallaron diferencias significativas entre los aislamientos de Candida colonizadores y los causantes de candidiasis vulvovaginal. En un estudio de Abu-Lubad en mujeres jordanas, se encontró una mayor actividad de fosfolipasas en C. albicans12, de la misma forma que se reveló en el presente estudio.
Son varios los estudios en los que se ha analizado la actividad de las proteasas en casos de candidiasis vulvovaginal 6,7,11,12. Por un lado, en el estudio ya mencionado de Fule et al., se halló una alta actividad de proteasa en todos los aislamientos, particularmente en los de C. albicans (97,1 %). En cuanto a la correlación con la candidiasis vulvovaginal, sí encontraron una asociación significativa con la actividad de proteasas 4. En el presente estudio, no se encontró una diferencia significativa entre los aislamientos colonizadores y los patógenos. Bassyouni et al. encontraron una alta actividad de proteasa en 82,5 % de los aislamientos de C. Asimismo, Abu-Lubad et al. encontraron que el 88,1 % de los aislamientos tenía una alta actividad de proteasa 12. En el presente estudio, solo el 25 % de los aislamientos estudiados mostró una muy alta actividad de proteasa, y esta se presentó en C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae y Candida spp.
En conclusión, se observa un mayor porcentaje de la actividad de fosfolipasas como factor de virulencia en los aislamientos estudiados (60,71 %), pero no se encontró una diferencia significativa entre los grupos de aislamientos colonizadores y los patógenos. En los aislamientos estudiados, solo se detectó un 25 % de actividad de proteasas. Es probable que la actividad de fosfolipasa sea la que cumple un papel preponderante en el proceso de interacción entre huésped y parásito. Sin embargo, serían necesarios otros estudios que permitan una mejor comprensión de este proceso de patogénesis.
