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Acta Biológica Colombiana

Print version ISSN 0120-548X

Acta biol.Colomb. vol.20 no.1 Bogotá Jan./Apr. 2015

http://dx.doi.org/10.15446/abc.v20n1.41673 

doi:10.15446/abc.v20n1.41673.

Artículo de investigación

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DE AMINOGLICOSÍDEOS DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (DC.) Stapf

Evaluación de la Actividad Antibacteriana y Moduladora de Aminoglucósidos de Aceite Escencial de Cymbopogon Citratus (DC.) Stapf

Evaluation of Antibacterial Activity of Aminoglycosides and Modulating the Essential Oil of Cymbopogon citratus (DC.) Stapf

Bruno F. F. LUCENA2, Saulo R. TINTINO1*, Fernando G. FIGUEREDO1,2, Cícera Datiane DE M. OLIVEIRA3, José J. DOS S. AGUIAR1, Edmilson DO N. CARDOSO2, Pedro E. A. DE AQUINO2, Jacqueline C. ANDRADE1, Henrique D. M. COUTINHO1, Ednardo F. F. MATIAS1.

1 Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri. Rua Cel. Antonio Luis, 1161, Pimenta, 63105-000. Crato, CE, Brasil.
2 Laboratorio de Microbiologia, Faculdade Leão Sampaio. Av. Leão Sampaio, Km 3, CEP 63000-000,Juazeiro do Norte, CE, Brasil.
3 Laboratório de Farmacologia e Química Medicinal, Universidade Regional do Cariri. Rua Cel. Antonio Luis, 1161, Pimenta, 63105-000. Crato, CE, Brasil.
*For correspondence. saulorelison@gmail.com

Received 22th January 2014, Returned for revision 27th April 2014, accepted 29th April 2014.

Citation / Citar este artículo como: Lucena BFF, Tintino SR, Figueredo FG, Oliveira CDM, Aguiar JJS, Cardoso EN, Aquino PEA, Andrade JC, Coutinho HDM, Matias EFF. Avaliação da atividade antibacteriana e moduladora de aminoglicosídeos do óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. Acta biol. Colomb. 2015;20(1):39-45. doi: http://dx.doi.org/10.15446/abc.v20n1.41673.


RESUMO

Vários trabalhos vêm demonstrando a importância do estudo de produtos naturais como fonte alternativa para novos antimicrobianos ou que venham potencializar os já existentes. Neste contexto este trabalho teve como objetivo investigar a atividade antibacteriana e as possíveis interações entre o óleo essencial de Cymbopogon citratus combinados a aminoglicosídeos frente a linhagens padrões e multirresistentes de S. aureus, E. coli e de P. aeruginosa provenientes de isolados clínicos. Um ensaio de microdiluição foi realizado para verificar a atividade antibacteriana e as possíveis interacções entre o produto natural e os antibióticos, utilizando uma concentração sub-inibitória. Através dos resultados foi constatado a interferência sinérgica dos aminoglicosídeos quando associados com o óleo essencial em uma concentração de CIM/8, com redução das CIMs em até quatro pontos frente às linhagens de S. aureus 358, E. coli 27 e P. aeruginosa-143. Mas nenhuma atividade modificadora foi observada frente a P. aeruginosa 78 e P. aeruginosa 91. Através dos resultados pode-se concluir que o óleo essencial de Cymbopogon citratus pode ser uma fonte alternativa de produtos naturais com atividade antibacteriana.

Palavras–chave: Cymbopogon citratus, Escherichia coli, óleo essencial, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

RESUMEN

Varios trabajos están demostrando la importancia del estudio de productos naturales como una fuente alternativa para nuevos antimicrobianos o que puedan mejorar los ya existentes. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue investigar la actividad antibacteriana y las posibles interacciones entre el aceite esencial de Cymbopogon citratus aminoglucósido combinado frente de linajes y patrones de S. aureus multirresistente, E. coli y P. aeruginosa provenientes de aislamientos clínicos. Se realizó una prueba de microdilución para verificar la actividad antibacteriana y posibles interacciones entre el producto natural y antibióticos, usando una concentración sub-inibitória. A través de los resultados se observan interferencia sinérgica de los aminoglucósidos cuando se asocian con el aceite esencial en una concentración de CIM/8, con reducción de CIMs de hasta cuatro puntos contra las cepas de S. aureus 358, E. coli 27 y P. aeruginosa 143. Pero no se observó ninguna actividad modificadora contra P. aeruginosa 78 y P. aeruginosa 91. A través de los resultados se puede concluir que el aceite esencial de Cymbopogon citratus puede ser una fuente alternativa de productos naturales con actividad antibacteriana.

Palabras clave: Cymbopogon citratus, Escherichia coli, aceite esencial, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

ABSTRACT

Several works demonstrated the importance of the study of natural products as an alternative source for new antimicrobial drugs or for modulators for these ones. In this point, the aim of this was to investigate the antibacterial activity and the possible interactions between the essential oil of Cymbopogon citratus alone and in association with aminoglycosides against standard and clinically isolated strains of multidrug-resistant bacteria such as S. aureus, E. coli and P. aeruginosa by microdilution method. The results indicated a synergism between the antibiotics and the essential oil with a subinhibitory concentration (MIC/8), reducing the minimal inhibitory concentration (MIC) sixteen times against the multidrug-resistant strains of S. aureus 358, E. coli 27 and P. aeruginosa 143, but none modulatory activity was observed against P. aeruginosa 78 and P. aeruginosa 91 strains. By our results, can be concluded that the essential oil of Cymbopogon citratus can be an interesting source of natural products with antibacterial and/or modulatory antibiotic activities.

Keywords: Cymbopogon citratus, Escherichia coli, essential oil, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.


INTRODUÇÃO

Em todo o mundo, há um grande número de cepas bacterianas resistentes a múltiplas drogas, principalmente no ambiente hospitalar, aumentando a morbidade, custos inerentes a cuidados de saúde, e as taxas de mortalidade devido a infecções (Dias e Monteiro, 2010). A maioria das bactérias têm múltiplos mecanismos de resistência a qualquer droga e, uma vez resistente, pode rapidamente dar origem a um grande número de descendentes resistentes (Gold e Moellering, 1996). A resistência bacteriana pode ser transferida por mecanismos diversos, podendo estabelecerse entre microrganismos de uma mesma população ou de diferentes populações, como da microbiota animal para humana e vice-versa (Baccaro et al., 2002).

A capacidade de desenvolver resistência aos agentes antibacterianos é uma característica observada entre os microorganismos em geral. Enquanto isso, as bactérias são capazes de desenvolver diferentes mecanismos de resistência, os quais são codificados geneticamente, em que os genes de resistência podem ser adquiridos através de mutação e de transferência de material genético (Carneiro, 2006). O desenvolvimento de infecções em seres humanos, incluem uma diversidade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, conforme descrito abaixo, mostrando resistência aos agentes antibacterianos.

As bactérias do gênero Staphylococcus são distribuídas na natureza, bem como na microbiota normal da pele e das mucosas de animais e aves. Algumas espécies de Staphylococcus são geralmente reconhecidos como agentes etiológicos de infecções oportunistas em muitos animais e seres humanos (Nostro et al., 2004; Coutinho et al., 2009). Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus e S. haemolyticus são as espécies que são os agentes causadores mais importantes de infecções humanas e hospitalares. Além de causar diferentes tipos de intoxicações, S. aureus representa o agente etiológico mais comum de infecções purulentas (por exemplo, furúnculo, carbúnculo, abcesso, miocardite, endocardite, pneumonia, meningite, artrite bacteriana) (Verhoeff et al., 1999).

A espécie Pseudomonas aeruginosa é responsável por uma variedade de infecções, tais como aquelas que atacam a pele, trato urinário, olhos e ouvidos. A ampla distribuição ambiental de Pseudomonas é assegurada por seus requisitos não-exigentes de seu crescimento, além de ter inúmeros fatores estruturais, enzimas e toxinas que potencializam a sua virulência, tornando-se resistentes aos antibióticos mais comuns (Murray et al., 2004).

A Escherichia coli é uma das principais bactérias causadoras de doenças infecciosas em seres humanos. É conhecida por sua produção de enterotoxinas, cujas propriedades têm sido amplamente investigadas, sendo que a atividade de suas citotoxinas e seu papel na infecção humana foram identificados principalmente em infecções do trato urinário (Matias et al., 2010).

No que diz respeito à crescente importância dada à infecções bacterianas em comunidades hospitalares e para o desenvolvimento progressivo da resistência antimicrobiana, um grande número de estudos têm sido realizados com produtos naturais em busca de uma nova perspectiva no tratamento de infecções bacterianas. Muitas plantas foram avaliadas não apenas pela sua atividade antimicrobiana direta, mas também como um agente modificador de resistência (Gibbons, 2004). A utilização de óleos essenciais de plantas como agentes antimicrobianos mostra uma possibilidade de que os microrganismos irão adquirir baixa resistência para a sua ação, por serem misturas complexas, tornando muito difícil adaptação microbiana (Daferera et al., 2003).

Vários compostos de produtos químicos, de fontes naturais ou sintéticas, tais como a partir de fenotiazinas ou produtos naturais, possuem atividade direta contra muitas espécies de bactérias, aumentam a atividade de um antibiótico específico, invertem a resistência natural de bactérias específicas a determinados antibióticos, promovem a eliminação de plasmídeos a partir de bactérias e inibem a função de transporte da membrana de plasma no que se refere a determinados antibióticos (Gunics et al., 2002).

Nessa perspectiva, o uso de produtos naturais como espécie Cymbopogon citratus (DC.) Stapf no controle da resistência bacteriana, torrna-se uma alternativa relevante. Ela é uma herbácea e pertence a classe Liliopsida, a ordem Poales e à família Poaceae (Lorenzi e Matos, 2002; Santos et al., 2009). Espécie vegetal conhecida popularmente no Brasil como capim-santo, capim-limão, capim-cheiroso, capimcidreira, capim-cidrão, citronela-de-java, erva-cidreira e capim-cidró. Seu uso principal é como anti-hipertensivo, antiasmático, antitérmico, antisséptico, antiparasitário, antirreumático, miorrelaxante e antiespasmódico. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de evidenciar atividade antibacteriana e moduladora de antibiótico, pelo óleo essencial de Cymbopogon citratus, através da técnica de microdiluição contra cepas padrões e multirresistentes de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.

MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismos

As linhagens bacterianas utilizadas foram: E. coli: EC– ATCC 10536, EC–27; S. aureus: SA–ATCC 25923, SA–358; P. aeruginosa: PA–ATCC 15442, PA–91, PA–143 e PA–78 com perfil de resistência identificado na Tabela 1. Todas as linhagens foram mantidas em infusão de coração em Agar (HIA, Difco Laboratories Ltda.). Antes dos ensaios, as linhagens foram cultivadas por 24h a 35#ºC em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI, Difco Laboratories Ltda).

Folhas de Cymbopogon citratus foram coletadas às 8h30min, no Sítio Gavião, distrito do município de Juazeiro do Norte, Ceará, Brasil no mês de dezembro/2011. O material vegetal foi identificado e uma exsicata foi depositada em herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) do Departamento de Ciências Biológicas (URCA), sob registro n#º 4018.

Obtenção do óleo essencial de Cymbopogon citratus

O óleo essencial foi obtido utilizando-se o sistema de hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger modificado por Gottlieb e Magalhães (1960). As folhas frescas de C. citratus foram colocadas em balão de vidro de 5L, acrescida de 3L de água destilada e aquecidas por 2h. Após esse período, a mistura água/óleo obtida foi separada, tratada com sulfato de sódio anidro, filtrada e o óleo obtido (OECC) foi mantido sob refrigeração até o momento das análises. Para os testes foi utilizado solução preparadas a partir do óleo essencial sob uma concentração de 10 mg/mL, dissolvidos em DMSO (Dimetilsulfóxido, Sigma-Aldrich®), em seguida diluídos com água destilada estéril para uma concentração de 1024 μg/mL.

Teste de atividade antibacteriana e atividade modulatória do antibiótico

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada em ensaio de micro-diluição em caldo (NCCLS, 2003) utilizando-se um inoculo de 100 μL de cada linhagem, suspensas em caldo BHI que apresentava uma concentração de 105 UFC/mL em placas de micro-titulação com 96 poços, com diluições em série ½. Em cada poço foi adicionado 100μL de solução de cada amostra. As concentrações finais do produto natural variaram entre 512 – 8 μg/mL. Para os controles foram utilizados os antibióticos padrões amicacina, neomicina e gentamicina cujas concentrações finais variaram entre 2500 μg/mL – 2,44μg/mL. As CIMs foram registradas como as menores concentrações para a inibição do crescimento.

Para avaliar o óleo essencial como modulador da ação antibiótica, a CIM de antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, foram avaliados na presença e na ausência do óleo essencial em micro-placas estéreis. Os antibióticos foram avaliados nas concentrações variando de 2500 μg/mL – 2,4 μg/mL.

As amostras foram misturadas em caldo BHI 10% em concentrações sub-inibitórias, obtidos e determinados após a realização de teste de avaliação da CIM, sendo que para o teste de modulação a concentração da solução do óleo essencial foi reduzida 8 (oito) vezes (CIM/8). A preparação das soluções de antibióticos foi realizada com a adição de água destilada estéril em concentração dobrada (5000µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes de 100μL diluídos seriadamente 1:1 em caldo BHI 10%. Em cada cavidade com 100μL do meio de cultura continha a suspensão bacteriana diluída a 105 UFC/mL (1:10). Os mesmos controles utilizados na avaliação da CIM para o óleo foram utilizados durante a modulação (Coutinho et al., 2009). As placas preenchidas e incubadas a 35#ºC por 24 horas e após esse período a leitura foi evidenciada pelo uso de rezazurina. Os ensaios foram realizados em triplicada e os resultados foram expressos como média das repetições.

RESULTADOS

O óleo essencial avaliado no presente trabalho, após todo o procedimento de preparação, apresentou rendimento de 0,49%. Alguns trabalhos demonstraram que as temperaturas elevadas influenciam na qualidade do óleo essencial do Cymbopogon citratus, por mostrarem concentrações mais elevadas do citral no horário de 08h às 13h e que o rendimento desse óleo é de 0,28 a 0,50% da massa de folhas tanto secas como frescas (Nascimento et al., 2000).

Um ensaio piloto utilizando apenas o DMSO foi realizado, mas nenhuma atividade antibacteriana ou moduladora foi verificada, indicando não apresentar toxicidade.

A tabela 3 mostra a interferência do óleo sobre a atividade de aminoglicosídeos frente às linhagens de SA–358 e a EC–27, demonstrando uma interferência na atividade dos antibióticos, com redução das CIMs. Os efeitos mais representativos foram na associação do OECC na concentração de 128 μg/mL (CIM 1/8) com os antibióticos, observando modulação da atividade da amicacina associada ao OECC frente à EC–27, com redução da CIM de 312,50 para 39,06μg/mL e frente a SA–358 com redução da CIM de 78,12 para 4,88 μg/mL.

Já a tabela 4 mostra a interferência do óleo sobre a atividade de aminoglicosídeos frente à linhagem de P. aeruginosa, demonstrando uma interferência na atividade dos antibióticos, com redução das CIMs frente a P. aeruginosa 91. O efeito mais representativo foi na associação do OECC na concentração de 128 μg/mL (CIM 1/8) com os antibióticos no meio de cultura, observando um reforço na atividade da amicacina associada ao OECC frente à EC–27 com redução da CIM de 312,5 para 39,06 μg/mL. No entanto, não foi obsevado interferência da atividade antibiótica quando associado às outras duas linhagens de P. aeruginosa. Resultado este que corrobora com de Bassolé (2011), que não avaliou modulação da atividade antibacteriana pela técnica de difusão em disco.

DISCUSSÃO

Segundo pesquisas já realizadas, óleo essencial de C. citratus apresenta diversas classes de metabólitos secundários que apresentam uma ampla variedade de atividades biológicas como a antimicrobiana (Shah et al., 2011). A elucidação do óleo segundo Shah et al., (2011), demonstrou a presença de diversos compostos potencialmente bioativos no óleo, como fenóis, terpenos, alcoóis, cetonas, ésteres e principalmente aldeídos tem sido constantemente registrado. Além do isolamento, foram identificados novos triterpenóides das folhas de C. citratus que são o cymbopogone e o cymbopogonol. Flavonóides e compostos fenólicos como luteolin, isoorientin 2''-O-rhamnoside, quercetina, kaempferol e apiginina. Os componentes fenólicos elimicina, catecol, ácido clorogênico, ácido cafeico e hidro-quinona também foram isolados (Shah et al., 2011). Possui o citral e mirceno como principais compostos (Ming et al., 1996).

Na determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo essencial testado contra linhagens padrões e multiresistentes de E. coli, S. aureus e P. aeruginos, como demonstrado na tabela 2, foi verificado que o óleo apresentou a mesma CIM frente as linhagens testadas de ≥1024 μg/mL com exceção da CIM de 512 μg/mL frente a SA – ATCC 25923, não demonstrando atividade clínica relevante de acordo com os limites estabelecidos pelo protocolo (Houghton et al., 2007). No entanto, a amostra associada aos aminoglicosídeos demonstrou modulação da atividade antibacteriana dos antibióticos.

Os mecanismos pelos quais os produtos naturais podem inibir o crescimento de microorganismos são diversos, e pode ser em parte devido à natureza hidrofóbica de determinados componentes. Esses referidos componentes podem interagir com a dupla camada lipídica da membrana celular e afetar a cadeia respiratória e a produção de energia (Nicolson e Evans, 1999), ou até mesmo tornar a célula mais permeável aos antibióticos, levando à suspensão da atividade vital da celular (Burt, 2004). A interferência com os sistemas de enzimáticos de bactérias pode ser também um potencial mecanismo de ação (Wendakoon e Sakaguchi, 1995). Podem ser obtidos tais mecanismos de ação pela combinação de extrato com antibióticos à concentração sub-inibitória aplicada diretamente ao meio de cultura (Coutinho et al., 2010a).

Produtos naturais derivados de plantas medicinais vêm sendo utilizados como fonte de novos compostos bioativos em especial para o tratamento de doenças infecciosas. Portanto, é real a possibilidade de utilizar plantas como fonte de novos compostos bioativos que sejam eficazes contra bactérias resistentes aos antibióticos convencionais (Butler e Buss, 2006). Sejam esses produtos de origem vegetal ou animal, podem alterar o efeito de antibióticos, seja aumentando ou reduzindo suas atividades, podendo assim, serem denominados modificadores da atividade antibiótica (Rodrigues et al., 2009; Tintino et al., 2013).

A atividade sinérgica observada pode ser devido à presença de dois dos três principais componentes do óleo, os componentes α-citral (geranial) e β-citral (neral) que apresentam uma reconhecida atividade antibacteriana frente a linhagens Gram-positivas e Gram-negativas, já o terceiro principal componente do óleo o mirceno, não apresentou nenhuma atividade antibacteriana observável (Martins et al., 2004). O citral é tido como sendo o responsável pelas atividades inseticidas e germicidas. No cultivo brasileiro, o teor de citral nos óleos essenciais de C. citratus está em torno de 75 a 86% (Martins et al., 2004). Os taninos e os flavonoides são sintetizados por plantas em resposta a infecções microbianas (Ho et al., 2001; Figueredo et al., 2013), sendo capazes de alterar a parede celular ou destruir a membrana plasmática facilitando absorção das drogas (Matias et al., 2010; Figueredo et al., 2013).

A diferença na atividade moduladora do óleo essencial contra as linhagens de P. aeruginosa, possivelmente se deve a presença de mecanismos de resistência como bomba de efluxo, produção de enzimas que clivam o anel ß-lactâmico (ß-lactamases), mudanças nas PBP, entre outros (Bush, 2002; Enright et al., 2002).

A atuação dos produtos naturais potencializando a ação de antibióticos frente a bactérias multirresistentes tem sido demonstrado em vários estudos (Coutinho et al., 2009; Coutinho et al., 2010a; Coutinho et al., 2010b). A "herbal shotgum" ou — "synergistic multi-effect targeting" é uma estratégia que refere ao uso de plantas e drogas em uma abordagem usando extratos combinados afetando diversos alvos do microrganismo ao mesmo tempo, com elementos terapêuticos colaborando sinergicamente ou antagonicamente. Isto tem sido demonstrado não apenas a partir da combinação de extratos, mas também de produtos naturais ou extratos e produtos sintéticos ou antibióticos (Wagner e Ulrich-Merzenich, 2009).

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho, indicam que o óleo essencial de Cymbopogon citratus é uma fonte alternativa de produto natural com ação antibacteriana, já que possui a presença de compostos com reconhecida atividade antibacteriana como terpenos, além de indicar a possibilidade do uso desse óleo combinado a antibióticos utilizados na clínica frente a linhagens Gram-positivas e Gram-negativas.

AGRADECIMENTOS

A Faculdade Leão Sampaio, ao CNPq e Funcap pelo apoio financeiro e à Universidade Regional do Cariri pela disponibilização de materiais e espaço físico.


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