INTRODUCCIÓN
Ecuador alberga una elevada diversidad vegetal por superficie de área y el uso de las plantas medicinales es parte de la cultura tradicional (Ríos et al., 2007). Con fines medicinales se registraron 3118 plantas pertenecientes a 206 familias, de las cuales el 26 % se usa para tratar infecciones causadas por bacterias, virus, hongos y parásitos (de la Torre et al., 2008).
El género Lasiocephalus, de la familia Asteraceae, comprende cerca de 27 especies distribuidas en la cordillera de los Andes, sobre los 3500-4800 m.s.n.m., desde Venezuela hasta Bolivia y Perú, con una mayor riqueza de especies en Ecuador (Silva-Moure et al., 2013). La posición taxonómica de las especies del género Lasiocephalus ha cambiado a lo largo del tiempo. Algunos consideran, según estudios filogenéticos, que este género carece de límites morfológicos claros, y consideran a estas especies como un grupo dentro de Senecio (Calvo y Freire, 2016). Lasiocephalus ovatus Schltdl, es una planta herbácea que crece en América del Sur, especialmente en Ecuador y Colombia, tiene como sinónimos: Culcitium uniflorum (Lam.) Hieron., C. reflexum H.B.K., Gnaphalium uniflorum Lam., (Aquino et al., 2002). Ruales y Guevara (2010) describen, en su artículo realizado sobre la flora patrimonial de Quito y sus alrededores (descubierta por la expedición de Humboldt y Bonpland en el año 1802), a la especie L. ovatus como un arbusto de estatus nativa y colectada en la localidad Monte Pichincha (Ruales y Guevara, 2010). Cerón (2006) refiere que esta especie de nombre común "Arquitecta" es una planta medicinal nativa de los Andes ecuatorianos, utilizada por la población para tratar la inflamación, úlcera y próstata, y está dentro de las 273 especies medicinales que se expenden en las hierberías de los mercados (Cerón, 2006). Por otra parte, se utiliza en Colombia en la medicina popular como lavado vaginal para regular el flujo y en Ecuador como diurético, depurativo y para tratar la sífilis (White, 1985). Las hojas se utilizan en forma de decocción como remedio depurativo y diurético en la medicina popular local y por vía tópica para el tratamiento de algunas afecciones inflamatorias de la piel (Aquino et al., 2002).
De Bernardi et al. (1990), indicaron la presencia de los compuestos copaeno, eremofilano, espatulenol y humuleno, en el aceite esencial (AE) de L. ovatus, siendo el único trabajo sobre los componentes volátiles realizado de esta especie. Por otra parte, los reportes sobre el aislamiento de compuestos de extractos de L. ovatus son limitados; así del extracto hexanoico se aislaron derivados de furanoeremofilano (De Bernardi, 1988) y en el extracto etanólico de C. reflexum recolectada en Riobamba-Ecuador, se identificaron seis flavonoides: rutina, quercetin-3-0-β-D-galactopiranosido-4'-0- β -D-glucopiranosido, quercetin-3-0- β -D-glucopiranosido, isorhamnetin-3-0- β -D-galactopiranosido, quercetina y kaempferol. Además en ensayos in vitro el extracto mostró actividad antioxidante e in vivo actividad fotoprotectiva (Aquino et al., 2002). En especies del género Lasiocephalus existe un trabajo realizado por Rondón et al. (2005), quienes analizaron la composición química por CG-EM del AE de las partes aéreas de la especie L. longepenicillatus (Schultz-Bip. ex Sandw.) Cuatrec., recolectada en dos estaciones en Mérida-Venezuela, y reportaron como componentes mayoritarios: D-germacreno (37,79 - 17,33 %), alfa-pineno (26,36 - 19,33 %) y alfa-humuleno (12,29 - 33,54 %).
El propósito del presente estudio fue determinar la composición química y la actividad antimicrobiana del AE obtenido de las partes aéreas de la especie L. ovatus recolectada en la zona de amortiguamiento occidental del parque Nacional Sangay en el sector de los páramos de Cubillin, Provincia de Chimborazo-Ecuador. Este es el primer reporte sobre la actividad antimicrobiana del aceite esencial de la L. ovatus frente a cepas de interés clínico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Las partes aéreas frescas de L. ovatus fueron recolectadas de forma manual en abril de 2017 en la zona de amortiguamiento occidental del parque Nacional Sangay en el sector de los páramos de Cubillin, Provincia de Chimborazo-Ecuador (78°28M8.81"W, 1°44M0.95"S). Una muestra del espécimen fue depositada en el Herbario GUAY (con el código de identificación 024A) tras la identificación botánica realizada por el MSc. Xavier Cornejo de la Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador.
Aceite esencial (AE)
Las hojas frescas de L. ovatus (4400 g) cortadas en pequeñas piezas y sumergidas en agua fueron licuadas y sometidas al proceso de hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger. El material vegetal estuvo en ebullición durante 4 h a una temperatura de 70 °C; el rendimiento fue de 0,05 % calculado con base en la masa del material fresco utilizado. El AE colectado fue secado con sulfato de sodio anhidro y almacenado en un vial de vidrio ámbar con tapa de rosca en un refrigerador a -4 °C hasta su análisis. A partir del aceite puro se preparó una solución concentrada de 100 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO), previo a la realización de los ensayos de actividad antimicrobiana.
Análisis químico del AE
El análisis se realizó en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 6890 serie II acoplado a un detector de masa Hewlett Packard 5973, equipado con un inyector automático HP y una columna capilar HP-5 de fenilmetil-polisilosano (30 m de largo por 0,25 mm de diámetro interno, con un espesor de pared de 0,25 µm). La energía de la fuente de ionización fue de 70 eV con un rango de barrido de 40-500 amu a 3,9 scans/s. Se comenzó con una temperatura de 60 °C con un incremento de temperatura de 4 °C/min hasta llegar a 260 °C. Se utilizó helio como gas portador, a un flujo de 0,9 mL/min ajustado a una velocidad lineal de 34 m/s. Se colocó una muestra de 1,0 µL de 2 % de solución del aceite en n-heptano con un reparto de 1:100 v/v.
Determinación de los componentes
Los constituyentes del AE fueron identificados por comparación de sus espectros de masa con los de referencia de la base de datos Wiley (6ta edición). La composición porcentual de las muestras se calculó a partir de las áreas de los picos CG y los índices de Kovats se calcularon comparando los índices de retención del aceite esencial con los datos de componentes estándar (serie de n-parafinas C7-C22) que fueron inyectados después del aceite bajo las mismas condiciones, o con los encontrados en la literatura (Davies, 1990; Adams, 2007).
Cepas microbianas
La actividad antimicrobiana del AE se realizó frente a cepas de la Colección de Cultivo Tipo Americano con sus siglas en inglés ATCC (American Type Culture Collection) que fueron proporcionadas por el Laboratorio de Investigación de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de Chimborazo. El ensayo incluyó las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Enterococcus faecalis ATCC 29212; las bacterias Gram-negativas Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Klebsiella pneumoniae ATCC 700603; y la levadura Candida albicans ATCC 10231, las cuales fueron mantenidas en agar nutritivo (AN), a excepción de E. faecalis que por sus exigencias metabólicas lo fue en agar cerebro corazón (agar BHI) y C. albicans en agar Dextrosa Sabouraud (ADS). Las placas fueron conservadas a 4 °C, llevándose a cabo resiembras periódicas. Los cultivos bacterianos se realizaron en caldo nutritivo (CN) a excepción de E. faecalis que se cultivó en caldo infusión cerebro corazón (BHI) y la levadura en medio líquido Sabouraud (MLS), y se incubaron a 37 °C durante 24 h en agitación orbital.
Actividad antimicrobiana
La determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI), concentración mínima bactericida (CMB) y concentración mínima fungicida (CMF) frente a las cepas microbianas se realizó mediante el método de microdilución en medio líquido en placas de 96 pozos (Moujir, 2011). De la solución concentrada del AE en DMSO se prepararon diluciones en medio de cultivo (CN o BHI en el caso de las bacterias y Sabouraud para la levadura) al doble de la concentración inicial requerida, a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas a mitades. Las concentraciones oscilaron entre 50 y 6400 µg/mL y la proporción de DMSO nunca excedió el 1 % v/v. Se añadió a cada pozo la suspensión microbiana asegurando una densidad celular inicial de 1-5x105 UFC/mL. Cada ensayo fue realizado por triplicado y se incluyeron controles negativos en pozos conteniendo solo medio líquido, y otros controles con la misma concentración de células en el medio sin tratar con el AE y tratadas con DMSO (en la máxima concentración usada) para garantizar un crecimiento microbiano óptimo y que el disolvente no tuviera ningún efecto sobre el crecimiento microbiano, respectivamente. Posterior a la incubación durante 24 horas a 37 °C en agitación orbital se tomaron alícuotas (100 µL) de todos los pozos sin crecimiento visible, que fueron subcultivadas en placas con AN, agar BHI o ASD. Después de la incubación durante 24 h a 37 °C, se realizaron los recuentos de las colonias (células viables) con el fin de establecer la CMI como la mínima concentración del aceite a la cual no hubo crecimiento y CMB o CMF como la mínima concentración del aceite que produjo la muerte del 99,9 %, de la población inicial.
RESULTADOS
Composición química del aceite esencial
La Tabla 1 muestra el análisis químico del AE de L. ovatus realizado por Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS) que reveló 27 compuestos que representan el 95,45 % del total identificados. El aceite está conformado por varios grupos moleculares dentro de los cuales se encuentra el de monoterpenos oxigenados (52,17 %) que constituye la principal fracción, representada por el alcanfor (40,48 %) como el compuesto más abundante. Los monoterpenos hidrocarburos (16,20 %) constituyeron el segundo grupo, con los compuestos 1,6-dimetilhepta-1,3,5-trieno (4,69 %) y canfeno (4,53 %) como los más representativos. 1,2,5,5-Tetrametil-1,3-ciclopentadieno (11,90 %) y para-menta-1,5-dien-8-ol (5,23 %) fueron otros componentes que se presentaron en porcentajes notables.
a Lista de compuestos según la elución en columna capilar DB-5 MS; TR: tiempo de retención; b IK calculado; c IK de la literatura (Adams, 2007)
Actividad antimicrobiana
Los resultados en la Tabla 2 muestran la actividad antimicrobiana del AE evaluada frente a seis cepas de interés clínico, dos bacterias Gram-positivas, tres Gram-negativas y la levadura Candida albicans, en la que se observa un rango de CMI del AE de 200-6400 µg/mL. Se puede apreciar que de las bacterias Gram-positivas ensayadas Staphylococcus aureus resultó ser la más sensibles a la acción del AE, con una CMI de 200-400 µg/mL y una CMB de 800 µg/mL, ya que la actividad inhibitoria que se registró frente a Enterococcus faecalis arrojó datos de CMI que superan ocho veces (1600-3200 µg/mL) el efecto frente a S. aureus. En cuanto a la acción del AE frente a las bacterias Gram-negativas ensayadas éste mostró un perfil antibacteriano diferente, inhibió en mayor proporción a Escherichia coli con CMI de 200-400 µg/mL, además mostró una CMB de 800 µg/mL, seguido de Pseudomonas aeruginosa con CMI de 800-1600 µg/ mL y Klebsiella pneumoniae que mostró baja sensibilidad al aceite. La actividad del AE evaluada frente a la levadura C. albicans evidenció poco efecto sobre la proliferación de este microorganismo, ya que la CMI determinada fue de 16003000 µg/mL, asimismo la CMF arrojó un valor elevado (6400 µg/mL).
DISCUSIÓN
En la literatura científica existe solo un reporte acerca del análisis de la composición química del AE de L. ovatus realizado por De Bernardi et al. (1990) quienes indicaron la presencia de los compuestos β-patchouleno, β -cariofileno y humuleno, los cuales difieren de los encontrados en este estudio. Los componentes de los aceites volátiles pueden variar según el clima, tipo y manejo de suelo, luz solar, temperatura y humedad de diferentes ecosistemas (Maffei, 1988; De Almeida et al., 2009; Ghelichnia, 2018). Las investigaciones sobre la composición del AE de especies del género Lasiocephalus son escasas. En la especie L. longepenicillatus fueron reportados α-pineno, mirceno, n-decanal, 1-trideceno, carvacrol, (-)-α-gurjuneno, β -bourboneno, үg-curcumeno, germecreno D y trans- β -farneseno (Rondón et al., 2005).
El análisis del AE de L. ovatus muestra que, de los diferentes compuestos identificados los terpenoides son los más abundantes, que se presentan como sesquiterpenos y especialmente como monoterpenos. En este sentido, varios autores han destacado el papel decisivo de los diferentes monoterpenos (Swamy et al., 2016). Estas consideraciones pueden explicar por qué los aceites esenciales con un alto nivel de monoterpenos demuestran una mejor acción contra los microorganismos que aquellos con niveles más bajos de monoterpenos (Cristiani et al., 2007; Bassolé yJuliani, 2012).
La actividad antimicrobiana de los AEs se puede explicar por el carácter lipofílico de los monoterpenos contenidos en ellos. Los monoterpenos actúan alterando la membrana citoplasmática microbiana, que pierde así su alta impermeabilidad para protones e iones más grandes; si se produce una alteración de la integridad de la membrana, entonces sus funciones no solo como barrera sino también como matriz para las enzimas y transductor de energía se ven comprometidas (Sikkema et al., 1994; 1995; Gill and Holley, 2006; Turia et al., 2006).
La actividad antibacteriana del AE de L. ovatus frente a S. aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922 fue moderada (CMI de 200-400 µg/mL). Algunos autores consideran la actividad antimicrobiana alta cuando los valores de CMI son inferiores a 100 µg/mL, moderada de 100 a 500 µg/mL, débil de 500 a 1000 µg/mL, o ninguna cuando es superior a 1000 µg/mL (Holetz et al., 2002). La actividad antibacteriana evidenciada en esta investigación puede deberse a la presencia de algún constituyente mayoritario como el alcanfor (40,48 %) o el 1,2,5,5-tetrametil-1,3-ciclopentadieno (11,90 %) o a la acción sinérgica de sus principales constituyentes; no está claro si la actividad antibacteriana de los aceites esenciales se debe a la interacción y la sinergia entre las docenas de compuestos en su perfil químico, o si se deriva de la acción de las principales moléculas presentes en los niveles más altos (Swamy et al., 2016).
Existen muchas aplicaciones farmacéuticas para el alcanfor tales como analgésico tópico, antiséptico, antiespasmódico, antipruriginoso, antiinflamatorio, antiinfeccioso, rubefaciente, anticonceptivo, mucolítico, expectorante leve, descongestionante nasal, supresor de la tos y otros. Se absorbe fácilmente a través de la piel y también se puede administrar por inyección, inhalación e ingestión. También tiene otras propiedades como regenerador celular y neurotóxico (Hamidpouri et al., 2013). Se ha informado que el alcanfor es uno de los agentes antimicrobianos más eficientes de varias plantas (Magiatis et al., 2002). La actividad antibacteriana del alcanfor ha sido reportada previamente en la literatura (Gupta y Saxena, 2010; Sokovic et al., 2010; Hsouna et al., 2013; Coté et al., 2017), y se ha señalado que el mecanismo de acción del alcanfor sobre el crecimiento de microorganismos incluye la desestabilización de la estructura de la bicapa fosfolipídica, la interacción con las enzimas y proteínas de la membrana y su acción como intercambiador de protones que reduce el gradiente de pH a través de la membrana (Xu et al., 2005). Contrario a esto, Kotan et al. (2007) encontraron que el alcanfor fue inefectivo como antibacteriano.
Según la revisión bibliográfica realizada, este es el primer estudio que muestra la actividad antibacteriana del AE de L. ovatus. Los AEs que tienen efectos inhibitorios contra los microorganismos se valoran porque no se ha demostrado la resistencia o la adaptación de estos microorganismos a los aceites esenciales en los últimos años (Lis-Balchin, 2006). Con estos resultados, se espera contribuir al estudio de especies del género Lasiocephalus de Ecuador.
CONCLUSIONES
En esta investigación se evaluó la composición química y la actividad antimicrobiana del AE de la especie L. ovatus usada en la medicina tradicional ecuatoriana. La determinación de los componentes químicos, que complementa la información publicada hasta el momento, revela que el alcanfor es el compuesto mayoritario. Este aceite posee una actividad importante frente a S. aureus y E. coli, pero frente a E. faecalis, P. aeruginosa, K. pneumoniae y la levadura C. albicans la actividad inhibitoria es baja. El aceite de esta especie podría constituir una fuente natural de antibacterianos que sea aprovechada en el desarrollo de fármacos antiinfecciosos.