Perfil de la expresión génica en células sanguíneas aisladas de carpinteros expuestos a solventes orgánicos en Sucre (Colombia)

Gene expression profile in blood cells isolated from carpenters exposed to organic solvents in Sucre (Colombia)

Carlos Vergara Rivera¹, Jesús Olivero Verbel^2,3, Angélica Guerrero Castilla^2,3, Bárbara Arroyo Salgado^2,3, José Luis Marrugo Negrete⁴

¹ Programa de Maestría en Ciencias Ambientales. SUE Caribe (Colombia).
²Grupo de Química Ambiental y Computacional, Facultad de Ciencias Farmacéuticas Universidad de Cartagena. Cartagena de Indias (Colombia).
³Programa de Doctorado en Toxicología Ambiental, Universidad de Cartagena. Cartagena de Indias (Colombia).
⁴Departamento de Química, Universidad de Córdoba. Montería (Colombia).

Correspondencia: Jesús Olivero-Verbel, Ph.D. Grupo de Química Ambiental y Computacional. Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cartagena. Campus de Zaragocilla. Cartagena (Colombia). joliverov@unicartagena.edu.co

Fecha de recepción: 14 de noviembre de 2012Fecha de aceptación: 1 de febrero de 2013

Resumen

Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar la expresión de genes asociados con estrés oxidativo, inflamación y daño al ácido desoxirribonucleico (ADN) en trabajadores de carpinterías en Sucre (Colombia).
Materiales y métodos: Aleatoriamente fueron seleccionados 41 individuos de sexo masculino: 28 expuestos y 13 controles, con edades entre 32.3±7.9 y 33.2±8.4 años, respectivamente. Se colectaron muestras de sangre periférica y se realizaron análisis hematológicos y de marcadores de daño hepático. En 24 individuos expuestos y 10 controles se realizó análisis de expresión génica para marcadores de estrés oxidativo, inflamación y daño al ADN usando reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.
Resultados: Los parámetros hematológicos y de daño hepático estuvieron dentro de los valores de referencia. La expresión génica de la P53 y BCL-2, genes asociados con el daño al ADN, fue significativamente mayor para el grupo expuesto en comparación con el grupo control.
Conclusión: En ausencia de cambios en marcadores hematológicos o de daño hepático, personas expuestas a solventes en Sucre tienen niveles de expresión elevados para los genes P53 y BCL-2. Estos genes podrían ser candidatos útiles como biomarcadores moleculares relacionados con la exposición a solventes.

Palabras clave: Compuestos orgánicos volátiles, exposición ocupacional, células sanguíneas, expresión génica, estrés oxidativo.

Abstract

Objective: The aim of this study was to evaluate the expression of genes related to oxidative stress, inflammation and deoxyribonucleic acid (DNA) damage in carpentry workers from Sucre, Colombia.
Materials and methods: 41 male individuals were randomly selected, 28 exposed and 13 controls, with ages 32.3 ± 7.9 and 33.2 ± 8.4 years old, respectively. Peripheral blood samples were collected and used for hematological and liver damage markers analysis. Gene expression analysis for oxidative stress, inflammation and DNA markers was performed using Real-Time Polymerase Reaction on 24 exposed and 10 controls.
Results: Hematological parameters and liver damage markers were found within the reference values. Gene expression of P53 and BCL-2, genes related to DNA damage, was significantly greater for the exposed group when compared with the control group.
Conclusion: In the absence of hematological or hepatic damage markers, individuals exposed to solvents in Sucre have increased gene expression for P53 and BCL2. These genes may be useful candidates as molecular biomarkers related to solvent exposure.

Keywords: Volatile organic compounds, occupational exposure, blood cells, gene expression, oxidative stress.

INTRODUCCIÓN

Los solventes orgánicos constituyen un grupo conformado por moléculas de naturaleza diversa, tales como alcanos, alcoholes, cetonas, aldehídos, ésteres, éteres y moléculas aromáticas. La alta presión de vapor de estos compuestos permite su incorporación al medio ambiente como compuestos orgánicos volátiles o COVs (1). Estos productos son utilizados ampliamente en múltiples actividades del hogar y en la industria (2), en particular en la elaboración de pinturas, calzado, carpintería y en el sector petroquímico en general (3).

Entre los productos comerciales con mayor contenido de solventes orgánicos está el tíner, el cual es empleado como diluyente de pinturas. Este líquido es una mezcla compleja de sustancias (4), con mucha variabilidad en su formulación (5), y entre sus componentes mayoritarios están el tolueno, metil-etil-cetona, heptano, hexano y acetona (6), entre otros.

La exposición a solventes orgánicos representa uno de los mayores riesgos potenciales en la salud de millones de trabajadores de diversos sectores laborales, quienes pueden sufrir afectación en proporciones variables (2), con consecuencias médicas, sociales y legales (4,7).

En Colombia, la exposición a solventes no solo involucra a los trabajadores que tienen contacto directo con estas sustancias, sino también a la población en general, que puede exponerse luego de manipulaciones y disposiciones inapropiadas de estos productos, generándose así un problema de salud pública (8). Sin embargo, a nivel del país se han encontrado pocos estudios y referencias sobre esta problemática (2).

Los solventes orgánicos son potencialmente tóxicos, y una vez inhalados sus blancos principales son el sistema nervioso central y periférico (9). Las propiedades tóxicas de estas sustancias son atribuidas en parte a su naturaleza hidrofóbica, que les confiere alta afinidad por los tejidos (4), aunque varios de ellos son considerados iniciadores y promotores de carcinogénesis (10). La exposición a los solventes orgánicos puede generar cuadros clínicos neurotóxicos agudos y crónicos (7, 11), dentro de los cuales es frecuente encontrar pérdida de la memoria, dificultades en la concentración, fatiga, cambios de la personalidad, cefalea e irritabilidad. Otras manifestaciones incluyen rinitis prolongada, conjuntivitis, tos, producción de moco, disnea, sibilancias y síntomas laríngeos (12).

La toxicidad asociada con la exposición a solventes orgánicos ha sido estudiada empleando diversos biomarcadores; por ejemplo, evaluando la presencia de micronúcleos de células bucales (13), la expresión génica de enzimas relacionadas con el metabolismo de xenobióticos (15), la actividad enzimática de transaminasas y fosfatasa alcalina (FA) (3), valorando la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas de cromosomas (16), cuantificando metabolitos en orina (10), identificando mediadores de inflamación en células pulmonares y monocitos (17), así como determinando la frecuencia de translocaciones cromosómicas, asociadas a leucemia mieloide aguda y linfoma folicular (18), entre otros.

En este estudio fueron valoradas las alteraciones en la expresión de los genes asociados a daño al ADN, inflamación, estrés oxidativo y proliferación celular, empleando linfocitos de sangre periférica de personas expuestas a solventes orgánicos en la industria artesanal de la mueblería en el departamento de Sucre.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio fue realizado con 41 hombres, trabajadores de carpinterías y talleres de pintura en madera en tres municipios (Sincelejo, Sampués y Corozal) del departamento de Sucre; y se incluyó además un grupo de referencia cuya actividad económica no estaba asociada con solventes orgánicos. Para cada municipio fue conformado el grupo de trabajadores expuestos a solventes, los cuales fueron analizados frente al grupo no expuesto o control.

Los individuos expuestos a solventes cumplieron con los siguientes criterios: 1) Manipulación directa de los solventes orgánicos con un tiempo de exposición mínimo de dos años. 2) Ausencia de historia personal de cáncer. 3) Ningún registro de enfermedades infecciosas en los tres meses previos al estudio (10). Los trabajadores del grupo de referencia incluyeron individuos que cumplían los requerimientos 2 y 3 pero que no tenían manipulación directa ni exposición a solventes. Así, en total 28 (edad: 32.3 ± 7.9 años) y 13 (edad: 33.2 ± 8.4 años) individuos fueron incluidos en los grupos de exposición a solventes y control, respectivamente, para análisis hematológicos.

La evaluación de marcadores de daño hepático y el análisis de expresión de genes asociados con estrés oxidativo y daño al ADN, mediante PCR en tiempo real, fue practicada a 24 individuos expuestos y 10 controles. Adicionalmente, se aplicó una encuesta para caracterizar la exposición laboral de los pintores a solventes, previa firma del consentimiento informado.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Córdoba (Montería, Colombia).

A cada individuo se le extrajo una muestra de sangre periférica por punción venosa empleando tubos Vacutainer™ con EDTA. Las muestras fueron almacenadas y transportadas al laboratorio bajo refrigeración (4-8°C).

Una parte de la muestra fue utilizada para los análisis hematológicos y enzimáticos y la otra para la extracción de linfocitos y posterior análisis de expresión génica.

Para el análisis de hemograma diferencial fue empleado un equipo Counter 19 CP (Laboratorios SAIC, Wiener Lab, Río Bamba, Rosario, Argentina), el cual permitió determinar el número de leucocitos (WBC), porcentaje de hemoglobina (HGB), número de glóbulos rojos (RBC), hematocrito (HCT), volumen medio corpuscular de glóbulos rojos (MCV) y plaquetas (PLT).

La medición de las enzimas hepáticas, FA (fosfatasa alcalina), ALT (alanina aminotransferasa) y AST (aspartato aminotransferasa) fue realizada en un equipo Micro Lab 200 y Metro Lab 1.600 (Laboratorios SAIC, Wiener Lab, Río Bamba, Rosario, Argentina), empleando kits comerciales, de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Los linfocitos fueron aislados de la muestra de sangre utilizando HISTOPAQUE®1077 (Sigma -Aldrich). 6 mL de sangre fueron mezclados con 5 mL de Ficoll y centrifugados a 2000 rpm durante 20 minutos a 20°C. El anillo de células generado en la capa intermedia fue extraído y lavado con PBS (fosfato buffer salino) a fin de obtener el botón de linfocitos, los cuales fueron aislados y almacenados en crioviales a una temperatura de -80°C.

El ácido ribonucleico (ARN) de los linfocitos fue extraído empleando RNeasy® Mini Kit (Quiagen, California, USA), teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN fue determinada usando un Nanodrop® (Thermo Scientific Wilmington, DE, USA), y su integridad fue valorada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % (19). La síntesis del ADN complementario o ADNc fue realizada a partir de 1 µg de ARN empleando QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA, USA). Los cambios en la expresión génica fueron determinados utilizando reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), incluyendo a la β-actina como gen de referencia. Cada muestra fue corrida por duplicado en el termociclador Light Cycler® 1.5 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, USA), con 10 µL Master Plus SYBR® Green I (ROCHE), 50 ng de ADNc y cebadores específicos para cada uno de los genes evaluados (tabla 1).

Las condiciones para los ensayos de RT-PCR fueron las siguientes: Incubación: 15 min a 95°C (1 ciclo); Amplificación: 15 seg a 94°C, 20-30 seg a 50-60°C y 10-30 seg a 72°C (40 ciclos). La expresión relativa de cada gen fue calculada por el método ΔΔCT (20) controles negativos sin adición de ADNc.

Todos los datos fueron presentados como medias ± error estándar (EE). ANOVA fue utilizado para realizar las comparaciones entre las medias de los diferentes grupos empleando Tukey como post-test. Valores de P<0.05 fueron considerados como estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos fueron realizados usando el soft ware Prisma 5.0.

RESULTADOS

De acuerdo con la encuesta realizada al grupo de individuos expuestos, el 73 % está en contacto directo con solventes con una frecuencia de exposición mayor a 7 horas diarias, durante 6 días a la semana, en condiciones de espacio abierto, siendo el tíner el producto más utilizado (97.4 %), seguido de selladores (91 %), pinturas (88.5 %) y gasolina (62.8 %).

Para este mismo grupo, el 50 % de los individuos utiliza protección respiratoria, y de estos, la gran mayoría (95 %) carece de filtros para polvo y vapores. De forma similar, el 97 % de los trabajadores no utiliza guantes de seguridad, aspecto que también constituye un riesgo importante de exposición dérmica a los solventes. Con relación al cambio de ropa de trabajo, el 59 % de la población se cambia diariamente, el 30.7 % dos veces por semana y el 10.3 % una vez por semana. Finalmente, el 42.9 % refirió que consume alimentos en el área de trabajo.

Todos los trabajadores reportaron consumo de alcohol (100 %) y solo 7.1 % son fumadores activos.

La evaluación subjetiva de la presencia de signos y síntomas generales entre el grupo expuesto a solventes permitió establecer la presencia de dolores de espalda (71.4 %), cefaleas (50 %), irritación ocular (35.7 %), lagrimeo (28.6 %) y alteraciones de la piel y alergias (20 %), entre los más frecuentes.

Desde el punto de vista neurológico, cabe destacar la alta frecuencia de debilidad general (42.9 %), alteraciones en el estado de ánimo (28.8 %) y hormigueo en las manos (28.6 %).

En la comparación de los parámetros hematológicos entre los grupos expuestos con relación al grupo control no se encontró diferencias significativas entre sus medias (tabla 2).

Los resultados de la actividad enzimática de fosfatasa alcalina mostraron valores significativamente superiores en el grupo de individuos expuestos provenientes de Sampués al compararlo con el grupo control (figura 1). No obstante, el incremento observado no está por encima de los valores considerados como de referencia (45-213 UI/L).

La actividad enzimática de ALT y AST no mostraron diferencias significativas entre los grupos del estudio.

El perfil de expresión génica para diversos genes marcadores de toxicidad se presenta en la figura 2.

La expresión de ARNm para los genes BCL-2 y P53 fue significativamente mayor para el grupo expuesto de Sampués en comparación con el grupo control. Adicionalmente, en comparación con el grupo control, TNFα, P27 y SOD1 mostraron ligera sobreexpresión en el grupo expuesto de Sampués, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas.

DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio indican que los individuos expuestos a solventes orgánicos en los talleres de muebles en el departamento de Sucre utilizan indiscriminada-mente productos como el tíner, pinturas, selladores y gasolina, omitiendo el uso de elementos de protección personal y de bioseguridad, en particular guantes, filtros especiales para vapores y ropa de tipo industrial.

Estas mismas tendencias de comportamiento han sido reportadas en individuos con condiciones laborales similares en el departamento de Cundinamarca, lo cual refleja, en parte, la ausencia de programas de capacitación relacionados con los riesgos de esta actividad laboral.

Lo anterior redunda en el desconocimiento por parte de los trabajadores de aspectos básicos sobre la sobretoxicidad asociada con la inadecuada manipulación e incontrolada exposición a los componentes químicos relacionados con las pinturas (10).

De forma similar a lo reportado en otros trabajos, los resultados de la evaluación hematológica no mostraron diferencias significativas entre el grupo control y los individuos expuestos (21, 22). No obstante, algunos estudios de exposición a solventes han encontrado aumentos estadísticamente significativos del número de leucocitos y bajas concentraciones de hemoglobina en comparación con individuos no expuestos, aunque estos datos, en principio, poseen poca significancia clínica al encontrarse dentro de los valores de referencia establecidos (23).

Las discrepancias en los resultados hematológicos por acción de la exposición a solventes orgánicos en los diversos estudios sugieren una variabilidad de efectos debidos a diferencias en el tiempo de exposición, concentración química del solvente y tipo específico del contaminante. Por ejemplo, el benceno es considerado como agente carcinogénico clase 1(14), nocivo para la salud inclusive a bajas concentraciones (24), y cuya exposición genera alteraciones en los sistemas respiratorio, reproductivo, inmunológico y nervioso, así como diversos trastornos hematológicos (25-27).

Al cuantificar la actividad de las enzimas hepáticas, el aumento de fosfatasa alcalina en uno de los grupos de individuos expuestos a solventes coincide con reportes de estudios realizados en trabajadores en cuyo ambiente existe tolueno y otros solventes (22, 28), quienes además de tener aumentos de este marcador reportan incrementos en los niveles de ALT y AST (28,29). Sin embargo, estas últimas enzimas también pueden encontrarse dentro de los valores de referencia, tal y como fue registrado para este trabajo (3).

Estudios histopatológicos han reportado la relación entre la exposición laboral a solventes orgánicos y las lesiones hepáticas, sin embargo, alteraciones celulares en etapas tempranas podrían no ser detectadas debido a la baja sensibilidad de los biomarcadores enzimáticos.

Las diferentes concentraciones ambientales de los contaminantes, la susceptibilidad individual y las específicas capacidades metabólicas individuales podrían explicar las divergencias en los niveles reportados de estos marcadores Por lo anterior, sería de importancia implementar un perfil de evaluación hepático más amplio, que incluya otros parámetros bioquímicos, tales como la gamma-glutamil-transpeptidasa, bilirrubina y niveles de ácidos biliares totales, entre otros (30, 31).

Al estudiar los cambios en la expresión de genes asociados con el daño al ADN se encontró sobreexpresión de ARNm para los genes BCL-2 y P53 en el grupo de individuos de Sampués (P<0.05).

El gen BCL-2 es considerado un proto-oncogen relacionado con procesos malignos de las células B, que causa supervivencia de las células debido a bloqueos en los procesos de apoptosis y alteraciones en la proliferación celular (32). De esta manera, los cambios en la regulación de este gen están asociados con procesos carcinogénicos en células expuestas a estireno (33, 34).

Por otro lado, el gen P53 codifica una proteína cuya función es modular el control del ciclo celular, deteniéndolo en el estado transitorio entre la fases G1 y S, a fin de proporcionar el tiempo para que actúen los sistemas de reparación del ADN y de esta manera asegurar la integridad y plasticidad genómica (34, 35).

La alteración en la expresión de P53 ha sido relacionada con daño genómico, defectos en los procesos de reparación de material genético y acumulación de daño genotóxico (36, 37).

La sobreexpresión de P53 encontrada en este estudio coincide con datos similares reportados en individuos con exposición ocupacional a benceno (38) y con estudios en linfocitos humanos sometidos a niveles elevados de estireno-7,8- óxido, en los cuales existe retraso en el ciclo celular, probablemente por alteración de los mecanismos de señalización que llevan a la reparación genómica (34).

Con base en el comportamiento de la expresión de P53 en individuos expuestos, este gen podría considerarse un buen candidato como biomarcador funcional en la detección y vigilancia de riesgos laborales ocasionados por solventes orgánicos (38), así como una herramienta para el diagnóstico inicial de alteraciones de cambios génicos sutiles en la exposición crónica a estos compuestos, en particular cuando los marcadores bioquímicos ostentan valores dentro de los parámetros de referencia.

La sobreexpresión génica de BCL-2 y P53, presentada específicamente en el grupo expuesto del municipio de Sampués, podría estar relacionada con mayores tiempos de exposición y la presencia de alta densidad de talleres en el área urbana.

Aunque la expresión de SOD no tiene diferencias significativas cuando se compara con el control, la tendencia hacia la sobreexpresión en los grupos de individuos expuestos a solventes orgánicos podría relacionarse con la generación de especies reactivas de oxígeno, generadas en el metabolismo de estos compuestos químicos.

La expresión de la proteína SOD está asociada con la respuesta antioxidante a nivel celular (39), y ha sido utilizada como indicador bioquímico de estrés oxidativo causado por agentes como el tolueno, xileno, etanol, metanol, formaldehído y benceno, cuya activación a intermediarios reactivos pude conducir a la formación de radicales libres y agotamiento de la protección antioxidante (29).

Una tendencia similar a la sobreexpresión fue observada para el gen TNF en el grupo de Sampués.

La expresión génica elevada de TNF se ha relacionado con el aumento de la respuesta inflamatoria aguda y crónica (40), y con el desarrollo de procesos asociados con el envejecimiento celular, senescencia prematura y eventos de apoptosis celular (41).

CONCLUSIÓN

La exposición a solventes orgánicos en el departamento de Sucre está asociada con sobreexpresión de los genes P53 y BLC-2, lo cual podría sugerir alteraciones y daño al ADN. Este proceso es concomitante con un ligero incremento en la actividad sérica de la fosfatasa alcalina para uno de los municipios evaluados.

Aunque los valores de marcadores bioquímicos y hematológicos están dentro de los intervalos de referencia, es necesaria la utilización de otras metodologías diagnósticas, que incluyan el análisis de expresión génica, a fin de observar alteraciones moleculares que no pueden detectarse mediante pruebas convencionales tanto bioquímicas como hematológicas.

Los programas de capacitación ambiental y riesgo profesional por parte de las autoridades pertinentes son intervenciones prioritarias para la salud de los trabajadores de los talleres.

Deben mejorarse las condiciones de protección personal, el manejo de solventes orgánicos y limitar el tiempo de exposición en cumplimiento de la legislación vigente, sobre la manipulación y exposición a estos compuestos químicos.

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos al proyecto "Exposición humana a disolventes orgánicos en fábricas de muebles en la Costa Atlántica colombiana: impacto sobre la expresión de genes asociados con daño al DNA" y a la población de trabajadores, administrativos y pintores de carpinterías de Sucre por su valiosa colaboración. Colciencias-Universidad de Córdoba-Universidad de Cartagena.

Conflicto de interés: Los autores declaran no tener conflicto de interés.

Financiación: Este proyecto fue financiado por el Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Francisco José de Caldas (Colciencias), contrato n° 733- 2009. Universidad de Córdoba - Colciencias.

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