Artículo original / ORIGINAL ARTICLE

Juan D. Puerta^1*, José A. Usme-Ciro^1,2,*, Juan C. Gallego-Gómez^1,2,3

Correspondencia: Juan Carlos Gallego Gómez. Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Edificio Histórico Manuel Uribe ángel. Teléfono: 57 4 + 219 6014 / 02 - Fax: 57 4 + 219 6444. Medellín (Colombia). juanc.gallegomez@gmail.com

Fecha de recepción: 27 de junio de 2013
Fecha de aceptación: 21 de julio de 2013

Resumen

Objetivo: Construir e implementar un control interno para la detección molecular de micoplasmas en cultivos celulares.

Materiales y métodos: Se alinearon secuencias del RNA ribosomal 16S de las principales especies de micoplasmas reportadas como contaminantes de cultivos, y diseñaron oligonucleótidos para la detección de las mismas. Para la construcción del control interno se amplificó una secuencia espadadora, además de las secuencias de hibridación de los oligonucleótidos usados para detección. La amplificación desde dicho control generó un fragmento con tamaño diferente al obtenido desde una muestra positiva. Posteriormente, para la evaluación del efecto del control interno sobre la amplificación de una muestra positiva se realizó la prueba sobre diluciones seriadas de la muestra, en presencia y ausencia del control interno. Finalmente, se ensayó el protocolo utilizando sobrenadantes de cultivo provenientes de diferentes laboratorios.

Resultados: Se observó alta homogeneidad al comparar los géneros Mycoplasma y Acholeplasma; no obstante se realizó el diseño de oligonucleótidos degenerados para aumentar teóricamente la eficiencia en la detección de todas las especies. Se demostró que la aplicación del control interno no afecta la sensibilidad de detección de la prueba. Los resultados obtenidos con muestras problema resaltan la importancia del control interno al realizar la prueba desde sobrenadantes de cultivo.

Conclusiones: El uso del control interno evita la obtención de resultados falsos negativos, generados por presencia de inhibidores en la muestra. La implementación de la prueba beneficiará los laboratorios en cuyas investigaciones utilicen cultivos celulares y permitirá ejercer un control de calidad, lo cual hará más confiables los resultados/productos obtenidos.

Palabras clave: Detección molecular, pcr, control interno, micoplasma, contaminación, cultivos celulares.

Abstract

Objective: to construct and implement an internal control for molecular detection of mycoplasma in cell cultures.

Materials and Methods: Sequences of 16S ribosomal RNA of the major species of mycoplasma reported as contaminants in cell cultures were aligned, and oligonucleotides for detection were designed. For the construction of the internal control, a spacer sequence as well as sequences for hybridization of the oligonucleotides used for detection, were amplified. Amplification from the internal control and positive samples generated fragments with different sizes. Subsequently, to evaluate the effect of the internal control on the amplification of a positive sample, the assay was performed on serial dilutions of the sample in the presence and absence of the internal control. Finally, the protocol was tested using culture supernatants from different laboratories.

Results: High homogeneity was observed when Mycoplasma and Acholeplasma genera were compared; however, degenerated oligonucleotides were designed to increase the efficiency of detection in all the analyzed species. It was shown that implementation of the internal control does not affect the sensitivity of detection. The results obtained with cell cultures samples highlighted the importance of the internal control. Conclusions: The use of an internal control facilitates the detection of false negative results generated by the presence of inhibitors in the sample. Implementation of the test as a quality control will benefit laboratories using cell cultures, making the results and / or products obtained more reliable.

Keywords: Molecular Detection, PCR, Internal Control, Mycoplasma, Contamination, Cell Cultures.

Introducción

El uso rutinario de cultivos celulares se ha convertido en una realidad, no solamente en laboratorios de investigación científica, sino también en laboratorios de diagnóstio y desarrollo biotecnológico. Aunque en la actualidad se dispone de equipos sofisticados y áreas específicas para la manipulación de cultivos celulares en condiciones de esterilidad, la contaminación por agentes biológicos sigue siendo un problema, que repercute no solo en la pérdida del cultivo, sino también en todos los productos y/o resultados que deriven del mismo.

Es frecuente aislar bacterias y hongos ambientales como agentes contaminantes, los cuales son fácilmente detectados por los cambios macroscópicos (pH, turbidez) y microscópicos (morfología celular) que generan en el cultivo (1). Sin embargo, existen otros tipos de patógenos, igualmente importantes, que no son fácilmente detectables y que logran pasar inadvertidos por largos periodos de tiempo, entre los que se encuentran diversos virus y bacterias intracelulares conocidas como micoplasmas.

Los micoplasmas, pertenecientes a la clase Mollicutes, han sido divididos en 6 géneros: Mycoplasma, Acholeplasma, Ureaplasma, Spiroplasma, Anaeroplasma y Asteroleplasma, todos de importancia en salud humana, animal o vegetal. Aunque existen alrededor de 120 especies conocidas de micoplasmas, cerca de 20 especies han sido reportadas como contaminantes de cultivos celulares (2), de las cuales M. arginini, M. fermentas, M. orale, M. hyorhinis o Acholeplasma Iaidlawii han sido aisladas en el 95 % de los cultivos contaminados (3-5).

Las especies de micoplasmas se caracterizan por tener un genoma pequeño con poco contenido de GC (6). La carencia de una pared celular les confiere resistencia a muchos de los antimicrobianos más utilizados en cultivos celulares (7-9). Los micoplasmas son bacterias extremadamente pequeñas, su tamaño oscila entre 130 y 300 nm (6), son indetectables con el microscopio de luz y no filtrables con las membranas convencionales de diámetros de poro entre 220 y 450 nm.

Su tasa de replicación en el cultivo es lenta y la mayoría de especies no genera lisis total de las células infectadas, lo cual dificulta su detección temprana. Solo en aquellos cultivos celulares con infección crónica se pueden observar cambios en la morfología celular (10-12), disminución en la tasa de proliferación (13), alteración del metabolismo celular al competir por lo nutrientes presentes en el medio (14, 15), regulación de la respuesta inmune (16), aglutinación de las células infectadas (17), así como también un aumento en la sensibilidad de las células a la infección viral y al tratamiento con drogas (18).

Algunas especies de micoplasmas, entre las que se encuentran Mycoplasma orale, M. fermentans, M. salivarium y M. hominis, están presentes como flora normal en el humano, y por ende, convierten al personal del laboratorio en posible fuente de contaminación (5). Otras fuentes importantes de contaminación que se deben considerar, dado su origen animal, son los reactivos como la tripsina o el suero fetal bovino no certificados para cultivos celulares, a partir de los cuales se han aislado principalmente las especies M. hyorhinis, M. arginini y Acholeplasma laidlawii (5, 19).

En las últimas décadas se han desarrollado diferentes métodos de detección, los cuales varían en complejidad, tiempo y equipamiento necesario. Anteriormente se utilizaban como métodos de rutina para la detección tinciones fluorescentes (tinción de Hoechst o DAPI) (20), autorradiografía con [3H] timidina (21), inmunofluorescencia indirecta (22, 23), o cultivo de colonias en agar sólido, las cuales deben ser vistas con microscopio, observando la característica apariencia de "huevo frito" en algunas especies (24).

Recientemente se ha desarrollado una variedad de inmunoensayos, sin embargo, la mayoría detecta un número reducido de especies, lo que limita la prueba, si se tiene en cuenta la cantidad de especies reportadas como contaminantes de cultivos celulares (24).

Actualmente las pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son las de mayor uso en los laboratorios, puesto que tienen una alta sensibilidad y abarcan un amplio número de especies contaminantes, dependiendo de la región genómica escogida para la amplificación y el diseño de oligonucleótidos degenerados (18, 23, 25). Para la detección de micoplasmas en cultivos celulares se han publicado múltiples protocolos, cada uno con condiciones de especificidad, sensibilidad y simplicidad diferentes (8, 19, 23, 24, 26-30).

Aunque el mayor atractivo de la PCR para la detección de micoplasmas en cultivos celulares es su alta sensibilidad, lo cual permite el uso directo de sobrenadantes como fuente de DNA, sin la necesidad de pasos previos de lisis (por calor o con detergentes) y extracción de ácido nucleico (que incrementan los costos y el tiempo requerido para la obtención del resultado), se debe considerar también que la presencia de sales u otras sustancias en algunas muestras podría causar la inhibición de la PCR, y por tanto, la obtención de resultados falsos negativos.

Por tal motivo se ha venido implementando el uso de un Control Interno (CI) dentro de la reacción de PCR (19, 23, 27, 31, 32), lo cual permite validar los resultados obtenidos de una muestra negativa o detectar alguna falla (por inhibición) en la PCR.

Dicha metodología ha sido implementada también en el diagnóstico molecular de un amplio rango de agentes infecciosos (33-35), principalmente en aquellos casos en los que se utiliza directamente la muestra proveniente del paciente (orina, esputo, suero), la cual podría presentar inhibidores de la reacción.

En este estudio se presenta la construcción e implementación de un CI para la detección molecular de micoplasmas a partir de cultivos celulares. Los resultados demuestran su utilidad y desempeño a diferentes concentraciones, así como la carencia de efectos negativos en la sensibilidad de la detección. Finalmente, se pone a disposición dicho CI y se recomienda su implementación para la evaluación periódica de la presencia de micoplasma en cultivos celulares.

Metodología

1. Diseño de oligonucleótidos

Se alinearon secuencias de DNA que codifican para el RNA ribosomal 16S, reportadas para las especies M. hyorhinis (Número de Acceso GenBank: AF258792), M. salivarum (M24661), M. orale (M24659), M. arginini (M24579), M. fermentans (NC_014921), M. buccale (MBU83502), M. hominis (NC_013511.1) y Acholeplasma laidlawii (CP000896), utilizando el paquete Clustal X2 (36), con los parámetros por defecto y corrección por alineamiento manual. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de las secuencias utilizadas, se optimizó el oligonucleótido MYB previamente diseñado (37), por medio de la introducción de sitios degenerados y para mejorar teóricamente la eficiencia de hibridación en la especie A. laidlawii, como miembro importante de micoplasmas contaminantes.

2. Diseño y construcción del Control Interno

Para el diseño del CI se utilizó una secuencia espaciadora proveniente del Virus Dengue 2 NGC, la cual fue amplificada con los oligonucleótidos CI_MYA_F (5'-gagaagcttggc-gaatgggtgagtaacacgaccaacgccggaaccata-3') y CI_MYB_R (5'-gaggaattccggataacgcttgcgacctatgctgcctcacccatctcta-3'). La región subrayada corresponde a la secuencia de los oligonucleótidos MYA y MYB, situados en su extremo 5^X correspondiente. La región 3' (en cursiva) permitió la amplificación específica a partir del genoma de Virus Dengue.

La mezcla de reacción de PCR (25 jl) consistió en 75 mM Tris-HCl, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01%(v/v) Tween 20, 1,5 mM de MgCl₂, 10 pmoles de cada oligonucleótido, 400 jM de cada dNTP, 1,25 unidades de Taq DNA Polimerasa (fermentas) y 1 jl de DNA plas-mídico (genoma de Virus Dengue clonado. Datos no publicados). Se utilizó el siguiente perfil térmico: 94°C por 5 minutos (desnaturalización inicial), seguido por 35 ciclos 94°C por 1 minuto (desnaturalización), 50°C por 1 minuto (annealing), 72°C por 1 minuto (extensión) y un ciclo de extensión final de 72°C por 10 minutos. El producto de PCR fue separado por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y visualizado bajo luz ultravioleta. El tamaño esperado del fragmento fue de 638 pb.

El fragmento obtenido fue posteriormente purificado a partir del gel de agarosa por medio del estuche comercial QlAquick Gel Extraction (QIAGEN). Para la clonación en el vector pGEM-T easy (Promega) se usaron 5 unidades de T4 DNA ligasa (fermentas) y una proporción 1:1 de inserto:vector. El producto de ligación fue usado para la transformación de bacterias E. coli DH5-a ultracompetentes (38). Posteriormente, las colonias recombinantes seleccionadas con el antibiótico ampicilina fueron expandidas en medio LB líquido y el DNA plasmídico purificado por medio del estuche comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Los clones positivos fueron chequeados por PCR y secuenciación (Macrogen Inc. Corea).

3. Evaluación del efecto del Control Interno sobre la sensibilidad de la prueba para la detección de micoplasmas

Sensibilidad en la detección del Control Interno

Se realizaron diluciones seriadas del CI, de la siguiente forma: 100ng/|jl (2,55*10¹⁰ moléculas del plásmido) - 1*10^-8ng/μl Para cada reacción se utilizó 1 μL de la dilución correspondiente. Con este ensayo se determinó la máxima sensibilidad de la técnica y la concentración de plásmido que debe ser utilizada en posteriores experimentos. Las condiciones de reacción de PCR fueron las mismas utilizadas anteriormente, excepto por la utilización de los oligonucleótidos MYA y MYB_D. El perfil para esta reacción fue: 94°C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos 94°C por 30 segundos, 60°C por 1 minuto, 72°C por 40 segundos y un ciclo de extensión final de 72°C por 10 minutos. Los fragmentos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y visualizados bajo luz ultravioleta. El tamaño esperado del fragmento fue de 638 pb.

Sensibilidad de detección de una muestra positiva

Utilizando una muestra positiva, previamente evaluada por otro método (datos no publicados), se realizaron diluciones seriadas 1/10 - 1/10.000. Las condiciones de PCR fueron las mismas utilizadas en la detección del CI. El tamaño del fragmento esperado fue entre 438 y 465 pb.

Efecto del Control Interno en la sensibilidad de detección de una muestra positiva

Una vez determinada la cantidad óptima de DNA plasmídico del CI, se realizó una nueva reacción con 0.001 pg del CI y diluciones seriadas de una muestra positiva para micoplasma. Las condiciones de la PCR fueron las mismas utilizadas en los ensayos anteriores. Los tamaños del fragmento esperados fueron de 438 - 465 pb (muestra positiva) y 638 pb (CI).

4. Prueba piloto de detección de micoplasma en muestras problema

Se utilizaron muestras problema, provenientes de varios grupos de investigación. Para cada muestra se adicionó 1 pg de CI y se realizó la PCR bajo las mismas condiciones de reacción utilizadas en los ensayos previos.

Resultados

Oligonucleótidos para la detección de micoplasmas

Para el diseño de los oligonucleótidos se tuvieron en cuenta las especies frecuentemente reportadas como contaminantes de cultivos celulares (figura 1). Con las secuencias del gen del RNA ribosomal 16S alineadas se delimitó la región de hibridación de los oligonucleótidos, previamente diseñados (37), y se establecieron las modificaciones necesarias para cubrir la variabilidad presente en estos, así como para permitir la inclusión de A. laidlawii.

Al realizar el alineamiento se observó una alta homogeneidad en la región de hibridación para ambos oligonucleótidos, MYA y MYB, en todas las especies analizadas. No obstante, fue necesaria la inclusión de sitios degenerados cerca al extremo 3` del primer reverso MYB, teniendo en cuenta la frecuencia de purinas (adenina, guanina) o pirimidinas (timina, citosina) presentes en ellas y con el fin de obtener una mayor eficiencia en la amplificación de las diferentes especies de micoplasmas. La secuencia del oligonucleótido posterior a la inclusión de los sitios degenerados fue: MYB_D 5'-CGATAACGCYCVMCCTATG-3'. Donde (Y) equivale a 87,5 % de timina y 12,5 % de citosina; (V) a 87,5 % de purinas y 12,5 % de citosina y (M) a 87,5 % de adenida y 12,5 % de citosina.

La inclusión del Control Interno no afecta la sensibilidad del método

Luego de la construcción del CI (figura 2) fue necesario evaluar su efecto en la sensibilidad de la prueba de detección de Mycoplasma spp al ser implementado. Inicialmente se determinó la cantidad mínima de moléculas de plásmido (CI) para utilizar en cada reacción.

Como se evidencia en la figura 3A, utilizando una mínima cantidad de moléculas por reacción (2,55 moléculas) se logró observar la banda del tamaño esperado, lo cual demuestra no solo la alta sensibilidad del método, sino también la eficacia de los oligonucleótidos previamente diseñados.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se utilizará la concentración de 1 pg de CI por reacción en los posteriores experimentos. Posteriormente se evaluó la sensibilidad de la prueba, utilizando diluciones seriadas de una muestra positiva, proveniente de un cultivo celular contaminado con micoplasma, en la cual se obtuvo amplificación hasta la dilución 1/100 (figura 3B).

Finalmente se evaluó el efecto del CI sobre la sensibilidad en la amplificación de una muestra positiva al adicionarlo en el mismo tubo de reacción. El resultado obtenido demuestra la amplificación de la muestra positiva en las mismas diluciones del ensayo anterior.

No obstante, en la máxima dilución se observa una leve disminución en la intensidad de la banda del fragmento obtenido (figura 3C). Estos resultados apoyan la implementación del CI como herramienta para descartar posibles "falsos negativos", generados por la presencia de inhibidores de la reacción provenientes de la muestra problema.

Prueba piloto para la detección de micoplasmas

Utilizando muestras problema, provenientes de cultivos celulares, se realizó la PCR para la detección de micoplasma adicionando a cada tubo de reacción 1 pg de CI (Figura 4).

El resultado demostró la eficacia de la prueba para detectar la presencia de micoplas-ma y evidencia además la utilidad de la implementación del CI.

En el carril 4 de la figura se observa una muestra con resultado negativo, en la cual no hubo amplificación del CI. Este resultado, al ser reproducible (n=3), sugiere la presencia de inhibidores de la PCR en dicha muestra y la convierte, por ende, en un potencial "falso negativo".

Este tipo de muestras requiere un tratamiento especial e idealmente la extracción de DNA total a partir del cultivo celular, previo a la prueba de detección molecular de micoplasmas.

Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4

Discusión

La contaminación por micoplasmas en cultivos celulares es, sin duda, uno de los problemas más importantes en los laboratorios a nivel mundial. Su presencia, además de poner en riesgo la viabilidad del cultivo afectado, conlleva la obtención de resultados, diagnósticos y productos biológicos (citoquinas y anticuerpos) poco confiables (5). De ahí la importancia de realizar de manera rutinaria en el laboratorio pruebas de detección que permitan hallar oportunamente cultivos y/o reactivos contaminados con micoplasmas (19, 24, 29).

Hasta ahora se han desarrollado muchas técnicas para la detección de micoplasmas en cultivos celulares, siendo las más utilizadas aquellas basadas en la técnica de PCR, debido a sus múltiples ventajas, entre las que se incluyen su alta sensibilidad, especificidad y facilidad de implementación en la mayoría de laboratorios.

Aunque las especies de micoplasmas de mayor importancia en cultivos celulares, pertenecientes a los géneros Mycoplasma y Acholeplasma, muestran alta homogeneidad a nivel de secuencias nucleotídicas, la eficiencia en la amplificación podría ser incrementada mediante la inclusión de varias parejas de oligonucleótidos (8, 20, 28, 39) o mediante el uso de oligonucleótidos degenerados (25, 27), como es el caso del oligo-nucleótido MYB_D, en el cual la inclusión de sitios degenerados cerca al extremo 3' asegura el "annealing" completo en los genomas de las especies de mayor importancia, así como también de aquellas especies no tan frecuentes pero que igualmente implian un riesgo para el laboratorio.

Adicional a esto, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos en diferentes estudios en los que se demuestra el beneficio que se obtiene al utilizar un CI dentro de cada reacción, debido a que aumenta la probabilidad de detectar resultados "falsos negativos" (40-41), se planteó el desarrollo de un CI, el cual podría ser usado en el mismo tubo de reacción en el que se evalúa la muestra problema, ya que amplifica un fragmento que difiere en tamaño con respecto a una muestra positiva sin afectar la eficiencia de la reacción.

El uso de 1 pg de CI no mostró disminución significativa de la sensibilidad en la detección, como se observa en los resultados obtenidos con la muestra positiva; sin embargo, estudios futuros deberían enfocarse en demostrar el efecto de diferentes concentraciones de CI sobre la sensibilidad de la técnica.

Igualmente, este tipo de control es especialmente útil en pruebas como la aquí presentada, puesto que no se utiliza DNA purificado, sino sobrenadantes de cultivo, los cuales eventualmente podrían contener inhibidores de la reacción y llevar a la obtención de resultados "falsos negativos". La implementación de dicho control también permite disminuir el riesgo de obtención de resultados "falsos positivos" por contaminación cruzada al manipular muestras de cultivos contaminados con micoplasmas como controles positivos de reacción.

Aunque la mayoría de protocolos basados en el método de PCR consideran necesario realizar pasos previos de extracción o purificación del DNA, estos pasos implicarían un gasto adicional de tiempo y dinero, y se convierten en la principal limitante para su implementación como prueba de uso rutinario.

Por lo tanto, en este estudio se presenta un protocolo basado en PCR, de rápida ejecución, el cual no requiere pasos previos de purificación de DNA. Cabe resaltar que aunque teóricamente la sensibilidad puede ser menor al utilizar sobrenadantes de cultivo como fuente de DNA molde para la PCR, en lugar de DNAs purificados, al ser un protocolo versátil, económico y de fácil realización podría ser implementado de manera periódica en los laboratorios, y por ende, aumentaría la probabilidad de detectar dichas muestras positivas que inicialmente fuesen consideradas negativas.

En conclusión, la implementación de la prueba molecular para la detección de micoplasmas, incluyendo la utilización del CI, beneficiará a gran cantidad de laboratorios cuyas investigaciones se basen en el uso de cultivos celulares. Dicha prueba permitirá ejercer un control de calidad de las líneas celulares (certificándolas como libres de micoplasmas) y hará más confiables los resultados y/o productos derivados de las mismas.

Agradecimientos: A los diferentes grupos de investigación que facilitaron muestras para el análisis.

Conflictos de intereses: Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Financiación: Esta investigación fue financiada por la Universidad de Antioquia y el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias), mediante los proyectos 1115-45921525, 1115-40820511 y 1115-49326198.

Notas

¹Viral Vector Core and Gene Therapy, Grupo de Neurociencias (SIU), Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia).

²Grupo de Medicina Molecular y de Translación, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia).

³Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia). Director del Viral Vector Core and Gene Therapy, Grupo de Neurociencias (SIU), Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia). Juanc.gallegomez@gmail.com.

^* Ambos autores contribuyeron de igual manera en este trabajo.

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