Carlos Mario Zuluaga¹, Amanda Consuelo Díaz², Martha Cecilia Quicazán³

¹ Ingeniero Químico, Magister en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad Nacional de Colombia. Estudiante de doctorado de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Colombia. cmzuluagad@unal.edu.co

² Ingeniera de Alimentos, Universidad de la Salle. Doctora en Calidad, Seguridad y Tecnología de Alimentos, Universidad de Zaragoza, España. Profesora Asistente, Universidad Nacional de Colombia. amcdiazmo@unal.edu.co

³ Ingeniera Química, Universidad Nacional de Colombia. Magister en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad de La Habana, Cuba. Profesora Asociada, Universidad Nacional de Colombia. mcquicazand@unal.edu.co

RESUMEN

Una de las técnicas más novedosas en el análisis del aroma de alimentos y otras matrices es la nariz electrónica. Este dispositivo funciona como una imitación del sistema olfatorio humano por medio de sensores con sensibilidades solapadas para diferentes grupos de compuestos químicos volátiles que, mediante el uso de estadística multivariada, permite la diferenciación y clasificación de alimentos así como el establecimiento de parámetros de calidad y control de los procesos. Aunque la técnica cada día es más utilizada en la investigación y en la industria, son pocos los trabajos publicados en la literatura científica que hacen referencia a la validación de su uso como metodología analítica. El objetivo de este trabajo fue el de estandarizar y validar el método de análisis del perfil aromático por nariz electrónica para la diferenciación de productos apícolas: miel, polen y propóleo. La estandarización se logró modificando las condiciones de preparación de la muestra y las variables del sistema, mientras que la validación se realizó mediante el análisis de la repetibilidad, la repetibilidad intermedia del método y el cálculo de la incertidumbre. Los resultados obtenidos muestran que es posible determinar los parámetros adecuados de operación del instrumento para cada uno de los productos apícolas, mientras que los indicadores de validación mostraron que la técnica no presenta diferencias significativas en su respuesta, obteniéndose valores confiables para el uso de este equipo como una herramienta de análisis y control de calidad.

Palabras clave: repetibilidad, repetibilidad intermedia, incertidumbre, perfil aromático, alimentos.

ABSTRACT

The electronic nose is one of the most innovative techniques which had been used in the analysis of food and other aroma matrices. This device imitates the human olfactory system through sensors which are partially specific for different groups of volatile chemicals and differentiating and classifying food (by involving multivariate statistics) and it is also used for establishing quality and control parameters. Although the technique has been increasingly applied in research and industry, few studies have been published in the scientific literature referring to validating its use as an analytical methodology. This work’s main objective was to standardise and validate the aromatic profile analysis method for differentiating apiculture products: honey, pollen and propolis. Standardisation involved modifying sample preparation and system variables while validation involved analysis of repeatability and intermediate repeatability of the method and establishing its uncertainty. The results showed that it was possible to set suitable operational parameters for each apicultural product while validation data showed that this technique did not reveal significant differences as reliable values were obtained when using this device as an analysis and quality control tool.

Keywords: Repeatability, intermediate repeatability, uncertainty, aromatic profile, food.

Recibido: mayo 10 de 2010

Aceptado: julio 17 de 2010

Introducción

Existe una continua necesidad por el desarrollo de métodos analíticos confiables para el análisis de alimentos que puedan ser evaluados con un procedimiento de validación. El Diario Oficial de la Comunidad Europea define validación como: “confirmación mediante examen y puesta a disposición de pruebas efectivas, de que se cumplen los requisitos particulares de un uso específico previsto" (CCE, 2002); en otras palabras, se refiere al proceso de evaluar el rendimiento de un instrumento o metodología cuyo fin último es proveer evidencia objetiva de que el método tendrá una reproducibilidad aceptable y precisa para ser aplicable (Walton, 2001).

Típicamente, cualquier procedimiento analítico debe considerar la siguiente información como un soporte para su evaluación: una descripción del método que incluya detalles de los parámetros operacionales, tales como la preparación de la muestra, el método de extracción, los estándares de referencia y la preparación de reactivos. De igual manera, las características más relevantes cuando se realiza la validación de una metodología analítica son: especificidad, linealidad, precisión, exactitud, rango, límites de detección y cuantificación, y robustez, las cuales pueden ser aplicadas parcial o totalmente dependiendo de la naturaleza de la prueba (APVMA, 2004).

El Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA), de la Universidad Nacional de Colombia, desarrolla el proyecto de investigación Selección de indicadores fisicoquímicos mediante aplicación de nariz electrónica para la catalogación de productos apícolas, financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, cuyo objetivo consiste en mejorar la competitividad de la cadena apícola por medio del establecimiento de las herramientas tecnológicas y científicas que se requieren para caracterizar sus productos, y en un futuro cercano promover un sello de calidad como lo es la denominación de origen para productos de la colmena diferenciados, considerando el gran potencial que tiene esta cadena productiva en el país.

En la primera etapa de desarrollo de este proyecto se estandarizó y validó la metodología de perfil aromático utilizando nariz electrónica para miel, polen y propóleo, cuyos resultados son presentados en este artículo. Una nariz electrónica está formada por cuatro elementos principales: una técnica de extracción de aroma o sistema de flujo de aire que transporta los compuestos volátiles de las muestras al siguiente paso, un arreglo de sensores químicos que transforman el aroma en señales eléctricas, un sistema de instrumentación y control que mide la señal de los diferentes sensores, y el control y automatización del sistema entero (Mannino et al., 2007). El propósito de combinar un arreglo de sensores es proveer una señal global llamada “huella digital” como una respuesta simple que es un aroma característico de la muestra (López-Feria et al., 2008).

El principio básico de funcionamiento de la nariz electrónica consiste en la inyección del headspace (espacio gaseoso ocupado por los compuestos volátiles en el vial) de la muestra colocada en un vial cromatográfico de 20 mL, cuya cantidad no debe exceder en ningún momento más de 1/3 del volumen del vial; la muestra se deja durante un tiempo y temperatura a determinar con el fin de lograr el equilibrio de la concentración de los compuestos volátiles. Una vez inyectado el headspace se obtiene un registro adimensional de relación de conductividades (G/Go) en función del tiempo por cada uno de los sensores de la nariz electrónica, dado por el valor reportado por el sensor en su estado natural (Go) y aquel registrado cuando pasa la sustancia gaseosa a través de él (G) (ver figura 1), la condición esperada es aquella que permita una estabilidad en la respuesta en el menor tiempo.

A pesar de que en la literatura científica ha sido demostrada la utilidad de la nariz electrónica para clasificar y diferenciar de acuerdo con el origen, en el control de procesos y calidad de productos de la industria agroalimentaria (Aleixandre et al., 2008; Ampuero et al., 2004; Benedetti et al., 2004; Cosio et al., 2006; Lammertyn et al., 2004), no se encuentran reportes sobre la estandarización y validación de la metodología de análisis del perfil aromático. La estandarización del método consiste en encontrar aquellos parámetros operacionales y de preparación de la muestra que garanticen una respuesta adecuada y reproducible por parte del equipo. Una vez estos parámetros son hallados, la validación permite evaluar si el método planteado es aplicable; considerando la naturaleza de valoración de esta técnica se estableció que las características más relevantes para la validación son las siguientes: la precisión, la repetibilidad y la repetibilidad intermedia, las cuales garantizan que los datos recolectados son confiables y reproducibles.

La precisión es la capacidad de un instrumento de dar el mismo resultado en diferentes mediciones llevadas a cabo en las mismas condiciones. La repetibilidad (r) está relacionada al rango de valores en los cuales es posible obtener una respuesta del instrumento, al realizarse varias medidas bajo las mismas condiciones de material, equipo, medio ambiente y operador en un período de tiempo corto; su cálculo se realiza mediante la diferencia entre el resultado mayor y el menor del análisis hecho por cada operador y para cada uno de los sensores de la nariz electrónica (ecuación 1) (INS, 2005).

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Entre tanto, la repetibilidad intermedia (R) está relacionada con el rango de valores en los cuales es posible obtener una respuesta del instrumento en el mismo laboratorio pero empleando diferentes operadores, días, equipos o lotes de reactivos; el cálculo es análogo al de repetibilidad, esta vez estableciendo la diferencia entre el resultado mayor y menor de todos los resultados obtenidos (ecuación 2) (INS, 2005).

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Desarrollo experimental

Materiales

Se utilizó una nariz electrónica Airsense Analytics GmbH PEN3 (Schwerin, Alemania); este equipo tiene un arreglo de diez sensores de óxido metálico (MOS), como se muestra en la tabla 1. Las muestras de miel, polen y propóleo fueron entregadas por las asociaciones de apicultores vinculadas al proyecto en mención.

Parámetros de estandarización

Para cada producto apícola se siguió el mismo procedimiento, variando tanto las condiciones propias del producto (peso de muestra) como de operación del equipo (temperatura de acondicionamiento del vial, tiempo de estabilización del headspace y flujo de gas en la cámara de sensores), en tres etapas (figura 2). La primera evaluó el factor de peso de muestra con tres niveles (1, 2 y 3 g), la segunda valoró dos factores: tiempo y temperatura de estabilización del headspace con cuatro niveles cada uno (5, 10, 15 y 20 min) y la tercera consideró el factor de flujo de gas a la cámara de los sensores con tres niveles (60, 100 y 200 mL/ min), y para cada nivel se realizaron tres réplicas; las condiciones más adecuadas se seleccionaron con base en la respuesta más estable y menor variabilidad de los sensores en el tiempo. Una vez obtenido el valor más adecuado en una etapa, se utilizó como parámetro en la siguiente.

Se utilizó como factor de criterio en las etapas de estandarización el valor obtenido del coeficiente de variación (CV), el cual es una medida de dispersión útil para relacionar el promedio con la desviación estándar (s), de acuerdo con la ecuación 3:

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Parámetros de validación

Para la validación de la metodología analítica se evaluó la repetibilidad y la repetibilidad intermedia de cada producto (miel, polen y propóleo), con diversos analistas y en diferentes días; estos parámetros fueron a su vez establecidos para cada uno de los sensores de la nariz electrónica. Se efectuaron cinco réplicas por ensayo; para la evaluación de la repetibilidad intermedia se hizo la prueba t-student con la finalidad de conocer si las diferencias eran estadísticamente significativas entre analista y días distintos, para un valor de significancia α = 0,05, utilizando el paquete estadístico de Microsoft Excel^®. Se utilizó la ecuación 4 en el cálculo de la incertidumbre debido a la precisión (U) con los datos de desviación estándar (SD) y el número de veces que se analiza la muestra (N) (Maroto et al., 2003; Reutemann y Huber, 2003):

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Resultados

Estandarización

Los resultados obtenidos en la etapa de estandarización para miel, polen y propóleo se muestran en las tablas 2, 3 y 4 respectivamente, de manera resumida, presentando únicamente los valores máximos y mínimos encontrados a partir de las respuestas de los diez sensores de la nariz electrónica. En miel (tabla 2), la variación en el peso de la muestra (etapa I) permitió establecer que a mayor cantidad de muestra, mayor el coeficiente de variación de respuesta en el último segundo de los sensores, también se observó que la estabilidad de respuesta de éstos a lo largo del tiempo era mayor, con un peso de muestra de 3g, por lo que se utilizó dicha cantidad en las etapas posteriores. La variación de la temperatura y tiempo de acondicionamiento del vial permitió establecer que la mejor respuesta era obtenida con un tiempo de 20 min a 40 °C, y que a pesar de no tener las respuestas de los sensores con la menor variabilidad, sí mostraba una respuesta estable en un tiempo de análisis inferior a las demás; esta etapa también permitió establecer que un tiempo de análisis de 150 s es suficiente para garantizar la estabilidad de respuesta. En la última etapa se encontró que la respuesta es afectada por la cantidad de gas que entra a la cámara; por lo tanto, en la espera de resultados confiables, una menor variablidad es hallada cuando se trabaja con flujos bajos como 60 mL/min.

En polen (tabla 3) la etapa I mostró una señal estable de sensores a lo largo del tiempo con un peso de muestra de 2 g, de manera similar se encontró que la cantidad de muestra afecta considerablemente la repetibilidad en la respuesta. La etapa II permitió deducir que el calentamiento del vial no logra una reducción en el tiempo de análisis de manera considerable, comparada a temperatura ambiente, donde un tiempo de estabilización del headspace de 15 min es suficiente para obtener una respuesta adecuada, con poca variabilidad y en un tiempo corto de inyección, de 220 s. A diferencia de lo encontrado en el análisis de la miel, los flujos altos de gas a la cámara de sensores permiten obtener una respuesta más estable; valores superiores a 200 mL/ min tienen una variabilidad mínima.

En propóleo (tabla 4), la etapa I fue llevada a cabo con pesos de muestra de 1 y 2 g, ya que debido al tamaño de la matriz, cantidades superiores ocupaban más de 1/3 del tamaño del vial, y adicionalmente era poco factible la reducción del tamaño de la muestra, ya que partículas muy pequeñas causan daños severos a los sensores del equipo; se encontró que 2 g dan respuestas estables con menor variabilidad. La etapa II permitió observar que el calentamiento es innecesario para obtener una respuesta de señal estable, pues se obtuvieron valores de relación de conductividades similares a temperatura ambiente, siendo un tiempo de estabilización del vial de 15 min aquel que ofrecía una respuesta de señal menos variable a lo largo del tiempo; en esta misma etapa fue determinado que un tiempo de análisis equivalente a 180 s es suficiente para lograr una estabilidad total para los diez sensores.

Validación

Con los parámetros de análisis determinados en la etapa de estandarización para cada producto, se realizó la validaci ón del método. Los resultados obtenidos en el cálculo del coeficiente de variación y repetibilidad son mostrados en la tabla 5 para miel, polen y propóleo respectivamente; se presentan los rangos de valores máximos y mínimos encontrados a partir de los resultados de los diez sensores de la nariz electrónica.

Entre tanto, en la tabla 6 se presentan el rango de valores obtenidos para la repetibilidad intermedia, incertidumbre y estadístico t para el análisis de promedios, con un valor crítico de ± 2,7764.

En términos generales, se observa que la repetibilidad en el análisis de compuestos volátiles por nariz electrónica tiene una reducida variabilidad. Algunos autores reportan valores de referencia para la evaluación de la precisión del método con base en los coeficientes de variación para métodos cromatográficos y volumétricos menores a 2% (Boqué et al., 2008; Reutemann y Huber, 2003), espectrofotométricos menores a 3% (Perel et al., 1978) y microbiológicos inferiores al 5% (Nguz, 2007). En promedio, los resultados obtenidos para el análisis de perfil aromático con nariz electrónica oscilan entre 7 al 10% para miel, 1 al 4% para polen y 2 al 7% para propóleo; esto permite establecer que las muestras líquidas presentan una mayor variablidad en la respuesta.

Los resultados de la prueba t para el análisis de la precisión entre analistas diferentes y días diferentes muestra para todos los casos que no hay diferencias estadísticas entre ellos, permitiendo establecer que el análisis del perfil aromático de productos apícolas mediante el uso de una nariz electrónica ofrece resultados repetibles en cada uno de los sensores. Los valores de incertidumbre son especialmente bajos para analistas diferentes en polen y propóleo; en miel, la incertidumbre supera el 1% en la mayoría de casos. En días diferentes, la incertidumbre para la respuesta de los sensores en el caso de polen y propóleo vuelve a ser baja, pero en miel los valores superan el 5% en la mayoría de sensores.

Al comparar valores con otros métodos analíticos de alto grado de imprecisión, la metodología es confiable, teniendo en cuenta la especificidad y selectividad de este tipo de análisis en comparación con los métodos cromatográficos capaces de separar compuestos, mientras que esta metodología identifica patrones o “huellas digitales”, las cuales son agrupaciones de sustancias con características comunes, detectados por los sensores mediante un cambio en una relación de conductividades; la nariz electrónica no funciona con respuestas lineales, es decir, sus respuestas están supeditadas a una serie de condiciones establecidas en la estandarización que permiten la respuesta más estable posible en el menor tiempo de análisis.

Conclusiones

La estandarización de la metodología de determinación del perfil aromático en miel, polen y propóleo fue llevada a cabo, encontrándose que las condiciones más adecuadas de operación son:

La validación de las metodologías analíticas permitió establecer que estadísticamente los métodos son precisos y repetibles, mediante el análisis de la medición del perfil aromático en días diferentes y con analistas diferentes; los valores de incertidumbre en la repetibilidad y repetibilidad intermedia para los sensores de la nariz electrónica en miel oscilan entre 1 al 10%, en polen entre 0,5 al 5% y propóleo entre 0,2 al 5%, lo cual permite concluir que la miel es la matriz con la que los sensores ofrecen la respuesta más variable; generalmente las muestras líquidas presentan este comportamiento, mientras que las matrices sólidas tienden a generar una incertidumbre menor. Estos resultados son un paso inicial para futuras aplicaciones de la nariz electrónica en varios campos, especialmente en el de control de calidad; varios laboratorios del mundo actualmente se enfocan en el desarrollo de nuevas tecnologías para la evaluación del comportamiento aromático de sustancias, con el objetivo de encontrar instrumentos que tengan respuestas más precisas, para lo que aún se requiere una mayor investigación.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo prestado para la realización de este trabajo al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA), de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural; a la Asociación de Apicultores de la Región del Sumapaz; a la Asociación de Apicultores de Boyacá; a la Asociación Apícola Comunera; a la Asociación de Apicultores Conservacionistas de la Sierra Nevada de Santa Marta; al Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores, del Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias); y al Programa de Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín.

Referencias

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