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Revista colombiana de Gastroenterología

Print version ISSN 0120-9957

Rev Col Gastroenterol vol.29 no.1 Bogotá Jan./Mar. 2014

 

Análisis topológico del interactoma de Helicobacter pylori revela proteínas topológicamente esenciales: identificación de blancos terapéuticos

Andrés Julián Gutiérrez E., Lic. (1), Martín Alonso Bayona R., MsC (2)

(1) Licenciado en Biología, Maestría en Ciencias Básicas Médicas. Docente Investigador Facultad de Medicina U.D.C.A, Coordinador Laboratorio de Biología Molecular, Grupo de Ciencias Básicas y Genética Humana Aplicada (GIBGA). Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales-U.D.C.A, Bogotá, Colombia. E-mail: andresgutierrez@colombia.com

(2) Bacteriólogo, Maestría en Microbiología. Docente Investigador Facultad de Medicina U.D.C.A. Grupo de Ciencias Básicas y Genética Humana Aplicada (GIBGA), Coordinador Área Básico-Médica. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales - U.D.C.A, Bogotá, Colombia. E-mail: mabayona@udca.edu.co

Financiación

Convocatoria interna de Vicerrectoría de investigaciones. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales - U.D.C.A

Fecha recibido:    08-07-13    Fecha aceptado:  19-12-13

Resumen

La Helicobacter pylori ha colonizado la mitad de la población mundial; su infección presenta una prevalencia del 70% al 90% en países en vía de desarrollo y del 25% al 50% en países industrializados. Está establecido que la infección se asocia con el desarrollo de gastritis crónica, úlcera gástrica y duodenal y con cáncer de estómago en el humano. Helicobacter pylori fue la primera bacteria patógena para la cual se dedujo el interactoma y por análisis topológicos se identificaron 702 proteínas involucradas en 1359 interacciones con una cobertura del 97,7% con escala libre; es decir, que el interactoma contiene proteínas topológicamente esenciales. Sin embargo, dichas proteínas y sus asociaciones fisiológicas no han sido descritas, perdiendo de esta manera la posibilidad de identificar posibles blancos terapéuticos. Con el objetivo de identificar proteínas topológicamente esenciales se realizó una reconstrucción del interactoma de la cepa H. pylori ATCC 26695 empleando los complementos BioNetBuilder y NetworkAnalyzer de Cytoscape y la aplicación web cytoHubba. La reconstrucción presentó 896 proteínas y 2416 interacciones con una cobertura del 96% del proteoma ajustada a la distribución de ley de potencias, es decir, presentó escala libre. Usando NetworkAnalyzer y la aplicación Hubba se identificaron proteínas esenciales según los parámetros K y BC; con las que se construyó una subred. El análisis de esta subred mostró que el sistema de secreción tipo IV interactúa con subsistemas metabólicos de lípidos, aminoácidos y ácidos nucleicos por medio de proteínas, para las cuales esta interacción no había sido sugerida. Además, estas interacciones son explicables por perfiles de expresión dependientes del pH, adhesión y homeostasis del hierro; lo cual permite complementar tanto la biología básica de la cepa como postular nuevos blancos terapéuticos putativos.

Palabras clave

Helicobacter pylori, interactoma, teoría de grafos, nodos topológicos, sistema de secreción tipo IV, blanco terapéutico.

INTRODUCCIÓN

La Helicobacter pylori ha colonizado el estómago de la mitad de la población mundial (1, 2); la prevalencia en adultos oscila entre 70% y 90% en países en desarrollo y entre 25% a 50% en países industrializados (3). Se sabe que la infección se asocia con gastritis crónica, úlcera gástrica y cáncer de estómago, mediada la adhesión de las cepas de la bacteria a las células epiteliales del hospedero (1, 2, 4-7). Sin embargo, no todas producen infección (8).

Una red de interacción está compuesta por nodos y por sus conexiones, dichos nodos se pueden distribuir al azar o seguir una distribución específica. Por ejemplo, escala libre (11), lo que significa que existen nodos que están más densamente conectados. La relación entre las propiedades topológicas de los nodos (genes o proteínas) y la esencialidad funcional está bien establecida (42). De hecho, existen programas bioinformáticos que permiten determinar este tipo de nodos a partir de un interactoma; ej. Hubba (33). El interactoma de la cepa ATCC 26695 de Helicobacter pylori mostró 1200 interacciones y cubrió 46% del proteoma (9). Posteriormente, reportaron 702 proteínas y 1359 interacciones con una cobertura del 97,7% (10); además que presentaba escala libre (10-13). También se logró validar bioquímicamente el 76% de dichas interacciones (14). A la fecha, se han caracterizado el complejo ureasa (15, 16), el complejo flagelar (17) y el complejo sistema secretor tipo IV (14, 18-20). Recientemente, se han sugerido interacciones proteicas que podrían retroalimentar la actividad de regulones específicos, por ejemplo Fur, RopD y choque térmico (21); pero ningún estudio ha determinado tanto la esencialidad topológica de proteínas en el interactoma que podrían derivar en la identificación de blancos terapéuticos como en su significado fisiológico.

En el presente estudio se construyó una subred de proteínas topológicamente esenciales que se proponen como blancos terapéuticos putativos. También se logró determinar la centralidad topológica del sistema secreción tipo IV y las interacciones proteicas que lo vinculan con subsistemas metabólicos. Estas interacciones ponen de manifiesto asociaciones fisiológicas explicables en el contexto de la expresión de genes bajo condiciones específicas de pH, adhesión y homeostasis del hierro.

MATERIALES Y MÉTODOS

La reconstrucción de la red se desarrolló con las versiones 2.8.2 (22) y 3.0.1 del programa Cytoscape (23). Se utilizó el complemento BioNetBuilder 2.0 (24) con el que se minaron las bases de datos BIND (25), KEGG (26), MINT (27), Intact (28) y DIP 5.0 (29) en busca de datos de interacción de la cepa ATCC 26695 de H. pylori. Todos los nodos de la red fueron nombrados con código Uniprot (30) y se eliminaron los nodos y bucles repetidos.

Los parámetros topológicos evaluados fueron: grado (k), que indica qué tan conectado está un nodo con otros; la intermediación (BC), el número de veces que un nodo es visitado; la centralidad (CC) que indica cuales son los nodos más cercanos al centro de la red (31) empleando el complemento NetworkAnalyzer (32). Para determinar los centros topológicos se compararon los nodos con valores más altos para k y BC con los resultados obtenidos con Hubba http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba/ (33). Con los datos comparados se construyeron dos subredes: la ‘subredk' integrada y la ‘SubredDS', siguiendo el parámetro Double Screen (DS).

Se realizaron análisis de perturbación con el complemento PerturbationAnalyzer (35). Seguidamente, los nodos de la subredk integrada se mapearon contra los resultados obtenidos del análisis de perturbación y se seleccionaron solo aquellos nodos mapeados que presentaron un valor superior a 2 (34). Como control, la subredk integrada fue sometida a un análisis de interferencia usando el complemento Interferece 1,0 (36). Las perturbaciones se realizaron asumiendo que todos los nodos tienen aumentada su concentración 2. Cada nodo de la subredk integrada y la SubredDS fueron mapeados en Uniprot (30), KEGG (26), DEG Database of Essential Genes (37) y se hizo Blast (38) contra una base de datos de humano y en DrugBank (39). Todos los análisis fueron llevados a cabo en una estación de trabajo bioinformática Dell T7600.

RESULTADOS

La red presentó 896 nodos, 2416 interacciones cubriendo el 96% del proteoma. El parámetro K y el número de nodos se correlacionan positivamente (0,901, R2= 0,884), lo que confirma su distribución según la ley de potencias (40) (figura 1). El top 50 de nodos según k mapeados en KEGG (26) indican que el 18% son proteínas hipotéticas, el 25% Cag8, Cag7, CagA y Cag-Alfa del sistema de secreción tipo IV; el 8% rpoBC, SpoT, Ndk y PyrF proteínas reguladoras. También se detectaron las proteínas FlgB, la proteína A del sistema UvrABC, CobB, HcpB, AspB y Bcp de varios subsistemas metabólicos. Finalmente, un 8% correspondió a subsistemas metabólicos de síntesis de ácidos grasos como: AccD, AcpP, proteína similar a la lipasa y FabE. El top 50 para K según cytoHubba es similar, sin embargo, la valoración de cada nodo cambia y existen dos nodos diferentes correspondientes a glnA y feoB, como se muestra en la tabla 1 y figura 1B y C.

En el top 50 del parámetro BC el 30% son proteínas hipotéticas, un 8% son proteínas reguladoras, 6% del aparato flagelar como FlgB, PflA y FliS; un 10% corresponde a sistemas de reparación del ADN, replicación y degradación de ARN como la proteína A del sistema UvrABC, MutS2, TopA, rpoD y la Ribonucleasa J; un 6% al metabolismo sintético de lípidos como la proteína similar a lipasa, AcpP, FabE, un 8% a proteínas del metabolismo de aminoácidos como CobB, SdaA, AspB y la Delta-1-pirrolina-5-carboxilato deshidrogenasa y un 24% por HcpB, feoB, selA, la proteína de unión al sustrato del transportador ABC, la 6-carboxi-5,6,7,8-tetrahidropterina sintetasa, TktA, CopA y proteínas del sistema de secreción y el complejo ureasa como son CagA, Cag 8, Cag 7, Cag Alfa y el canal ureI respectivamente. El mapeo entre los resultados del análisis de perturbación y top 50 K-B mostraron que: hcpB, flgB, rpoBC, CagA, Cag7, Cag alpha, Cag3, SpoT, UvrABC, Cag16, Cag8, AccD, AcpP, AspB, bcp, FabE, feoB, pyrF, queD, GppA y ureI son las proteínas topológicamente esenciales del interactoma de la cepa ATCC 26695 de Helicobacter pylori acompañadas de proteínas hipotéticas. Los análisis de interferencia mostraron que la red se fragmenta cuando alguno de estos centros topológico es eliminado (tabla 2, figura 2C).

El parámetro DS de cytoHubba agrupa los nodos en diferentes clústeres. El clúster 1 representa el metabolismo de piruvato, propanoato, síntesis de ácidos grasos y metabolismo central. De este, los nodos sin homólogo humano son: ppsA, FabH, la carboxinospermidina, FabE, Pta, porG que además es esencial en DEG (DEG10080201 (E= 5e-93)), porA, porB y porD. El clúster 2 representa el metabolismo de aminoácidos y del nitrógeno; solo dos proteínas no tienen homólogos humano: panD y murl. El clúster 3 representa el metabolismo de ácidos nucleicos y aminoácidos puntuales. Dentro de las proteínas sin homólogos humanos están: la SurE y Gpt. El clúster 4 representa sistemas de replicación, reparación, recombinación; los nodos significativos según DEG son: la proteína (dnaN DEG10080082 (E= 0,0)), la proteína HP1247 (DEG: DEG10080237 (E= 0,0)), la proteína ropZ DEG (DEG10080134 (E= 2e-36)) y HolB DEG (DEG10080229 (E= 8e-94)). Finalmente, el clúster 5 representa el sistema de secreción tipo IV, además evidencia interacciones con la proteína queD y el Clúster 6 que representa el sistema ATP sintetasa (figura 2B).

DISCUSIÓN

Tener escala libre (40) significa que los nodos del interactoma siguen la distribución de ley de potencias (41); se sabe que estos nodos son esenciales, organizan la red y están conservados evolutivamente (42-46). Se identificaron nodos topológicos para el sistema de secreción tipo IV (SSTIV), la maquinaria flagelar, el sistema de respuesta al estrés, para sistemas de recombinación, reparación y transcripción, para homeostasis de Hierro, protección contra especies reactivas de oxígeno y para el sistema ureasa.

La subredk muestra que el sistema de secreción tipo IV (SSTIV) es un eje topológico central (figura 1 y 2) para el cual las proteínas Cag7, Cag8, Cag3, Cag16, Cag18, Cag Alfa y CagA son nodos topológicos para los que se han confirmado interacciones experimentalmente (18, 47). Estos nodos cumplen funciones esenciales para la dinámica molecular del SSTIV. Puntualmente, Cag18, Cag19 y Cag7 reconocen integrinas del huésped que favorecen la secreción de CagA (51-53) cuya translocación está mediada por Cag16 (54) y de esta manera CagA puede destruir la barrera epitelial y modificar vías de señalización del hospedero (48). Además, Cag3 es esencial para el ensamblado del SSTIV (49) y Cag Alfa facilita el transporte de sustratos (50).

Se sugiere que las interacciones entre CagA, Cag3, Cag8, Cag7 y Cag16 por un lado podrían regular el ensamblado del SSTIV y por el otro, vincularlo fisiológicamente con la homeostasis a metales, la aclimatación al medio ácido, la adhesión a la célula hospedera y el ensamblado flagelar. Estas sugerencias se apoyan en datos de expresión. Por ejemplo, cag16 y cag8 aumentan su expresión a pH 4.5 sin urea (55), la expresión de cag3 está influenciada por Fur y por la adhesión (56, 21) y cagA aumenta su expresión a pH 2.5 y es inducida por FlgS (57, 58). A su vez, la expresión de cag3 y cagA está regulada por hierro en fase logarítmica de crecimiento (59) y esta situación se repite con otros genes cag cuyas proteínas no fueron identificadas aquí como nodos esenciales (21). Este estudio muestra que estas interacciones proteicas siguen un patrón fisiológico que podría implicar la existencia de formas de regulación del SSTIV que no han sido estudiadas y que estas proteínas podrían ser consideradas como blancos terapéuticos putativos.

Dentro de la maquinaria flagelar se identificaron dos proteínas como nodos topológicos que se proponen por primera vez como blancos terapéuticos putativos. Por un lado, la proteína FliS (60) fundamental para el ensamblado flagelar por que previene la polimerización prematura de flagelinas; de hecho, mutantes para FliS quedan paralizados y aflagelados (61-63) y por otro, la proteína FlgB ubicada entre el peptidoglicano y la membrana interna importante en la formación del conducto para la unidad flagelar móvil (60). Fisiológicamente, la expresión flgB aumenta tanto a pH 4,5 sin urea (55) como al adherirse a la célula (56), pero contradictoriamente, no está influenciada por FlgS (57) que se supone es su regulón maestro. De hecho, son HspR, HrcA y Fur los que influencian positivamente la expresión de flgB vinculando la proteína con respuesta al estrés y a la homeóstasis de iones metálicos y una vez posibilitando la generación de nuevas hipótesis para trabajos experimentales. Por otra parte, la expresión de fliS está regulada por HrcA haciéndolo un gen que responde a eventos de estrés y por sigma 28; es decir, es un gen de regulación flagelar tipo III (21).

Por otro lado, en inanición y a bajo pH H. pylori produce ppGpp; un regulador que coordina adaptaciones para supervivencia (66) y los nodos topológicos SpoT, GppA y NdK identificados aquí representan la maquinaria enzimática completa para su procesamiento metabólico (64). Específicamente, bajo situación limitante de aminoácidos, choque aeróbico o exposición a medio ácido la adaptación ocurre mediante SpoT (65). Las cepas mutadas para SpoT no crecen en fase estacionaria, entran tempranamente a forma cocoide y no pueden sobrevivir a condiciones de estrés (65). Tanto la expresión de SpoT como de GppA se ven significativamente reprimidas cuando la bacteria se encuentra en su fase de crecimiento más virulenta (67, 58, 55). Experimentalmente, se determinó que SpoT es una proteína esencial para la cepa de la bacteria (tabla 2). Estas proteínas se pueden considerar como blancos terapéuticos muy novedosos puesto que permiten hipotetizar sobre el hecho de atacar las formas ambientales de la bacteria.

Otro de los nodos topológicos es la proteína A del sistema UvrABC. Tanto en E. coli como en H. pylori, esta proteína es la primera que reconoce los fragmentos de ADN a reparar (70, 71) y cepas mutantes para este gen no sobreviven en luz ultravioleta y recombinan menos (72). Seguidamente, dentro de la maquinaria transcripcional se identificó un nodo correspondiente con la proteína RpoBC codificada por un gen fusionado que contiene las subunidades β y β´ de la ARN polimerasa; la cual es plenamente funcional (68).

Finalmente, mencionar una serie de nodos topológicos miembros de una serie de sistemas variados. La proteína HpcB miembro de la familia de proteínas que hidrolizan anillos de penicilina y derivados del ácido cefalosporánico. Estructuralmente HpcB se considera única y se propone como una nueva familia de proteínas de unión a penicilina (69). Se sabe que el hierro es fundamental para la homeostasis de Helicobacter pylori; de hecho, la red de regulación transcripcional más intrincada está gobernada por Fur (21). Uno de los nodos corresponde a FeoB el principal transportador de hierro esencial para crecimiento y virulencia (73). Seguidamente, se identificó la proteína BCP una peroxiredoxina que protege la bacteria de especies reactivas de oxígeno; cepas mutantes para BCP no sobreviven en presencia de superóxidos y de hidroxiperoxidos orgánicos. Además, mueren después de tres semanas de colonización (74). Las proteínas AccD y AccP son necesarias para el metabolismo microaerofílico de H. pylori (75). Finalmente, la proteína UreI, un canal para urea ubicado en la membrana interna cuya expresión, aumenta cuando el medio disminuye de pH 7,4 a 4,5 sin urea (76, 55, 58) y a pH 4,5 FlgS controla su expresión (57). Se proponen los nodos FabE, QueD, AspB, CobB y PyrF como centros topológicos, además, se expone según DS que las proteínas FabE y QueD interactúan con Cag7, Cag8 y Cag12. En el presente artículo se expusieron las proteínas consideradas nodos topológicos para el interactoma de la cepa ATCC 26695 de Helicobacter pylori y se proponen como nuevos blancos terapéuticos debido a su papel en la fisiología de la bacteria.

Agradecimientos

A la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales por la financiación del proyecto y al Doctor Carlos Barragán por sus sugerencias con la escritura del artículo.

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