DOI: http://dx.doi.org/10.18273/revmed.v29n2-2016011

Hibridación genómica comparativa: su
interpretación y uso como herramienta
diagnóstica en retardo mental inespecífico y
síndromes de microdeleción/microduplicación

Stephania Posada Guiran^*
Victoria Andrea Osorio M^**
Lizeth Gabriela Garzón Guerrón^*
Julián Ramírez-Cheyne^***

^* Estudiante VIII semestre de Medicina. Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Libre. Cali. Colombia.
^** Estudiante VII semestre de Medicina. Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Libre. Cali. Colombia.
^*** Médico. Profesor Universidad del Valle. Profesor Universidad Libre. Cali. Colombia.

Correspondencia: Dr. Julián Ramiréz Cheyne. Dirección: Calle 4B # 36-00. Universidad del Valle, Sede San Fernando. Edificio 116. Departamento de Morfología. Laboratorio de Citogenética. Cali. Colombia. Correo electrónico: juracheyne@gmail.com
Artículo recibido el 27 agosto de 2015 y aceptado para publicación el 16 de abril de 2016.

RESUMEN

En Colombia el cariotipo por bandeo es todavía la prueba inicial más usada en el estudio de pacientes con retardo mental o con anomalías congénita múltiples. Sin embargo, las técnicas moleculares, particularmente la hibridación genómica comparativa con microarrays, han permitido identificar un número creciente de síndromes de microduplicación o microdeleción en estos pacientes, de modo que mundialmente esta es hoy en día la tecnología de elección para evaluar alteraciones del número de copias. Se realiza esta revisión de la literatura con el objetivo de brindar al personal médico información actualizada acerca de la interpretación y el papel de la hibridación genómica comparativa con microarrays como herramienta diagnóstica en retardo mental inespecífico, síndromes de microdeleción/ microduplicación y análisis cromosómico prenatal. MÉD.UIS. 2016;29(2):137-44.

Palabras clave: Hibridación Genómica Comparativa. Discapacidad intelectual. Deleción Cromosómica. Duplicación Cromosómica. Diagnóstico Prenatal.

Comparative genomic hybridization: its interpretation and use as a diagnostic tool in
nonspecific mental retardation and microdeletion/microduplication syndromes

ABSTRACT

In Colombia the banding karyotype is still the initial test used in the study of patients with mental retardation or with multiple congenital anomalies. However, molecular techniques, particularly comparative genomic hybridization with microarray have identified a growing number of microdeletion or microduplication syndromes in these patients, so that globally this is the technology of choice nowaday for evaluating copy number alterations. This literature review is aimed at providing to medical personnel the latest information regarding the interpretation and role of comparative genomic hybridization as a diagnostic tool in nonspecific mental retardation, microdeletion/ microduplication syndromes and prenatal chromosomal analysis. MÉD.UIS. 2016;29(2):137-44.

Keywords: Comparative Genomic Hybridization. Intellectual Disability. Chromosome Deletion. Chromosome Duplication. Prenatal Diagnosis.

¿Cómo citar este artículo?: Posada S, Osorio VA, Garzón LG, Ramírez-Cheyne J. Hibridación genómica comparativa: su interpretación y uso como herramienta diagnóstica en retardo mental inespecífico y síndromes de microdeleción/microduplicación. MÉD.UIS. 2016;29(2):137-44.

INTRODUCCIÓN

El retraso mental es un desorden clínico con gran impacto para la salud pública y la sociedad; sin embargo, su etiopatogenia es poco entendida. Se define como un daño significativo de las funciones cognitiva y adaptativa, con inicio antes de los 18 años de edad. Puede hacerse evidente durante la infancia o en la niñez temprana como retraso del desarrollo, pero es mejor diagnosticado durante los años escolares¹. A nivel mundial se ha estimado una prevalencia aproximada del uno al cuatro porciento. En Latinoamérica la prevalencia puede ser cuatro veces mayor, por su asociación a factores como la desnutrición, las complicaciones obstétricas y perinatales, la prematurez, la intoxicación por plomo, las infecciones del sistema nervioso central y la pobreza^2,3.

Las causas genéticas de discapacidad intelectual pueden estudiarse con diferentes técnicas. En Colombia, aunque la citogenética molecular se aplica desde los noventa⁴, el cariotipo por bandeo es todavía la prueba inicial más usada, y cuando este resulta normal, las pruebas siguientes incluyen citogenética molecular o genética molecular. No obstante, en los últimos cinco años, siguiendo la tendencia mundial, se ha venido incrementando en el país el uso de la Hibridación Genómica Comparativa con microarrays (aCGH, por sus siglas en inglés) como prueba inicial para estos casos⁵. En pacientes con Retardo Mental (RM) el uso de esta tecnología ha permitido la identificación de un número creciente de Síndromes de Microduplicación o Microdeleción (MMS, por sus siglas en ingles)⁶, cuya aparición se facilita por secuencias de ADN repetitivas que predisponen a recombinaciones homólogas desiguales y son responsables de los rearreglos cromosómicos recurrentes^7-9.

El cariotipo con 550 bandas G permite la identificación de alteraciones numéricas, también llamadas aneuploidías, y del mayor número de alteraciones estructurales con tamaño mínimo de cinco megabases. La aplicación de las técnicas moleculares, como el aCGH, en el estudio cromosómico han permitido diagnosticar reorganizaciones crípticas por debajo de la resolución del microscopio óptico^10,11.

Mundialmente, el aCGH se ha convertido en la tecnología de elección para evaluar alteraciones del número de copias, también llamadas Variaciones del Número de Copias (CNV, por sus siglas en inglés), asociadas a características como RM, retraso del desarrollo, autismo o dismorfismo¹² . Es importante que los médicos se documenten sobre la utilidad, indicaciones y características operativas del aCGH, ya que debido a sus ventajas sobre el cariotipo y otras técnicas moleculares es probable que se consolide como la prueba de primera línea para el análisis cromosómico en los próximos años, incluso en el escenario del diagnóstico prenatal de fetos con dismorfismo¹³ . El objetivo de este artículo es realizar una revisión acerca de la interpretación y uso del aCGH como herramienta diagnóstica en RM inespecífico, MMS y análisis cromosómico prenatal haciendo una comparación con el cariotipo.

METODOLOGÍA DE BÚSQUEDA

Se realizó una búsqueda en las bases de datos PubMed- MEDLINE y Google Scholar, usando los términos MeSH "Comparative Genomic Hybridization"; "Intellectual Disability"; "Chromosome Deletion", "Chromosome Duplication"; "Prenatal Diagnosis". Se combinó el primer término con cada uno de los demás usando el operador booleano AND. Se incluyeron artículos publicados desde 1998.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA CON MICROARREGLOS

TÉCNICA

En el aCGH, el ADN del paciente y un ADN control son marcados, mezclados en proporción 1:1 e hibridados junto con un ADN de un donante normal. Esta hibridación in situ con fluorescencia, hecha en placas con pozos de secuencias genómicas definidas, resulta en un color amarillo de las regiones no afectadas por CNV, mientras que los colores verdes y rojos indican pérdidas o ganancias del ADN del paciente respectivamente. Además se pueden detectar polimorfismos de nucleótidos que proveen información adicional sobre pérdida de heterocigosidad, indicando deleción o disomia uniparental. El aCGH es usado como método para revisar todo el genoma y la resolución depende del número y tamaño de las sondas usadas^14-6.

INTERPRETACIÓN

Con los problemas técnicos resueltos, hoy el reto principal es la interpretación. La decisión más crítica es si una CNV es considerada benigna o patológica.
Para esto, se emplea un sistema de tres categorías para clasificar las CNV halladas en un aCGH: probablemente patógena, probablemente benigna o Variante de Significancia Desconocida (VUS, por sus siglas en inglés)^16-18. La asignación de una CNV a una de estas categorías puede hacerse revisando la literatura y usando buscadores genómicos que muestran las CNV patológicas y benignas reportadas¹⁹; adicionalmente, muchos laboratorios mantienen sus propias bases de datos.

Si una CNV no ha sido reportada previamente, el proceso de clasificación involucra el análisis del tamaño, contenido y asociación con fenotipos anormales, teniendo varias consideraciones generales. Así, se clasifican como alteraciones candidatas para ser responsables de los trastornos o patológicas, aquellas que implican pérdidas, tienen gran tamaño, son ricas en genes o son de novo; se clasifican como alteraciones candidatas para no ser responsables de los trastornos o benignas aquellas que no contienen genes, contienen genes que no se ha demostrado que sean sensibles a la dosis, las cercanas a otras alteraciones reportadas como benignas o las heredadas de un padre normal; finalmente, se clasifican como VUS las que contienen uno o más genes con funciones mal definidas, contienen elementos reguladores o las que no encajan en las otras dos categorías²⁰. Ha habido cierta preocupación entre los laboratorios clínicos por la posibilidad de malinterpretaciones del término de VUS que supongan un carácter más benigno de lo previsto.

Recientemente se ha sugerido que algunas CNV previamente consideradas benignas, pueden tener implicaciones patogénicas, por lo cual actualmente la mayoría de laboratorios incluyen en sus reportes las CNV benignas²¹. Muchos laboratorios utilizan un umbral de tamaño, desde 50 hasta 500 kilobases para reportar deleciones y desde 150 hasta 500 kilobases para reportar duplicaciones¹⁷. Esta aproximación reduce las VUS pero puede erróneamente excluir CNV clínicamente significativas de menor tamaño²².

COMPARACIÓN CON EL CARIOTIPO

El cariotipo es una técnica operador dependiente y el resultado tarda en promedio 14 días. En Colombia tiene un costo aproximado de 200 dólares, en Europa y Estados Unidos 300 euros y 500 dólares, respectivamente¹³ En 2010 se publicó un documento de consenso²³ y un artículo de análisis económico²⁴ sugiriendo al aCGH como primera prueba diagnóstica, reemplazando el cariotipo en pacientes con problemas neurológicos, autismo, déficit cognitivo o recién nacidos con anomalías congénitas de etiología desconocida. Análisis posteriores comparando aCGH, cariotipo, MLPA y QF-PCR, encontraron ventajas del aCGH sobre las otras pruebas, al examinar todo el genoma con mejor resolución para la detección de pérdidas o exceso de material genético²⁵.

Aunque el resultado del aCGH está disponible en cuatro a siete días, el proceso es sistematizado y no es operador dependiente, este puede arrojar resultados no concluyentes como VUS, no detecta rearreglos balanceados, ni poliploidias (sí detectados por el cariotipo), no detecta mutaciones puntuales (tampoco detectadas en el cariotipo)²⁶, y tiene como importante problema el costo, que en Colombia oscila entre 1500 y 3000 dólares, y en Europa y Estados Unidos es aproximadamente 500 euros y 1500 dólares respectivamente¹³.

ETIOLOGÍA DEL RETARDO MENTAL IDIOPÁTICO

Las alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales, además de originar RM, se asocian a problemas del crecimiento, dismorfismo facial, malformaciones estructurales cardíacas, urogenitales y de las extremidades; al conjunto de estas características se le denomina fenotipo cromosómico. En particular, el RM se ha asociado a alteraciones en prácticamente todos los cromosomas. La citogenética estándar con 400-500 bandas, encuentra anomalías en el 40% de pacientes con RM grave y en el 10% de pacientes con retardo mental leve²⁷. Un estudio canadiense encontró un 27% de diagnóstico positivo del aCGH sobre un 19% del cariotipo al usarlos para evaluar pacientes con RM²⁸. En la mayoría de los trabajos, la trisomía 21 es la principal causa, seguida del síndrome X frágil²⁹.

El RM idiopático es aquel al cual se le realiza historia clínica, pruebas genéticas y otros estudios sugeridos, y no se logra obtener una causa definitiva que lo explique. En la población mundial más del 50% de los casos de RM leve se clasifican como idiopáticos³⁰. En Colombia no se conoce la epidemiología de esta entidad³¹. Una proporción importante de los afectados tienen anomalías cromosómicas submicroscópicas o defectos en genes únicos que juegan un papel en la etiología, predominando las aneuploidías cromosómicas, alteraciones estructurales con pequeñas deleciones terminales e intersticiales, duplicaciones terminales e intersticiales, los cromosomas marcadores extras, las traslocaciones desequilibradas y las traslocaciones recíprocas aparentemente equilibradas^32-4.

Desde 1995, se reconoce que una causa significativa de RM idiopático la constituyen las alteraciones crípticas de regiones subteloméricas que producen ganancias o pérdidas y provocan desequilibrio de dosis génica³⁵. La frecuencia de alteraciones subteloméricas en casos de RM idiopático es del 5 al 7%^33,36,37; sin embargo, se ha encontrado que en pacientes con RM idiopático, las anomalías cromosómicas intersticiales son incluso más frecuentes que las subteloméricas^38-40.

Estas alteraciones son difíciles de detectar en el cariotipo³⁶, y se requieren técnicas moleculares de cribado genómico como el aCGH, que ha probado su validez para hallar desequilibrios submicroscópicos^41-3. Aunque esta técnica tiene la desventaja de no detectar reorganizaciones equilibradas ni mosaicismos de bajo porcentaje, es en la actualidad la que, estando al alcance del laboratorio clínico, permite una valoración más extensa del genoma.

SÍNDROMES DE MICRODUPLICACIÓN O MICRODELECIÓN

Las consecuencias fenotípicas de las alteraciones cromosómicas no están obligatoriamente asociadas al tamaño. Se sabe que el efecto fenotípico de una anomalía cromosómica pequeña, depende más del locus y función de los genes implicados que del tamaño³³. Así, un RM puede originarse por alteraciones cromosómicas grandes como las detectables por cariotipo (cinco a diez megabases) o pequeñas como las detectables por aCGH (cinco a diez kilobases)¹³.

Los síndromes de genes contiguos son causados por ganancia o pérdida de regiones cromosómicas submicroscópicas específicas. Dado que hoy se sabe que aunque varios genes estén involucrados, es posible que solamente uno sea sensible a la dosis y por tanto el causante del fenotipo, la denominación "síndromes de genes contiguos" ha sido reemplazada por MMS. Las técnicas moleculares, particularmente el aCGH, han permitido identificar un número creciente de MMS, principalmente en pacientes con RM^6,27. En la Tabla 1 se muestran algunos MMS y sus características principales.

Teóricamente, para cada síndrome de microdeleción hay un síndrome de microduplicación recíproco. Sin embargo, se ha estimado una relación síndromes de microdeleción:síndromes de microduplicación de 2,5:1, y se ha reportado que solo para el 21% de los síndromes de microdeleción hay un síndrome recíproco de microduplicación⁴⁴. En general, se puede afirmar que los MMS suelen incluir el RM dentro de sus fenotipos y que las microduplicaciones parecen producir fenotipos más leves o ninguno comparados con sus microdeleciones recíprocas⁴⁵.

CAUSAS DE RECURRENCIA DE MMS

La base de la recurrencia de deleciones, duplicaciones, inserciones, inversiones y translocaciones, es la arquitectura del genoma humano¹⁹, específicamente la presencia de elementos repetitivos que permiten recombinaciones intercromátide, intercromosoma o intracromosoma ilegítimas durante la meiosis o la mitosis. Esta inestabilidad genómica no solamente causa MMS, sino que tiene gran impacto en la evolución del genoma y la flexibilidad para ganar nuevas funciones génicas o efectos directos por la dosis génica^54,55. La ocurrencia de rearreglos genómicos recurrentes puede estar mediada por diferentes mecanismos, los cuales se muestran en la Tabla 2.

Dado que una causa común para microdeleciones y microduplicaciones recurrentes es la presencia en el genoma de innumerables repeticiones que pueden causar recombinación homóloga no alélica, el número total de MMS recíprocos puede ser mucho mayor al que ahora se conoce⁶³.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA CON MICROARRAYS VERSUS CARIOTIPO EN EL ANÁLISIS CROMOSÓMICO PRENATAL

El diagnóstico prenatal busca establecer el estado de salud del embrión o feto. Este puede ser no invasivo como la ecografía y las pruebas en sangre materna, o invasivo como la biopsia de vellosidad corial, la amniocentesis o la cordocentesis¹¹; indicados estos últimos cuando la probabilidad de encontrar un diagnóstico anormal es mayor que el riesgo de complicación por el procedimiento⁶⁴.

El cariotipo detecta prenatalmente alteraciones cromosómicas numéricas como trisomías, monosomías, poliploidias, y defectos estructurales como pérdidas o ganancias de material genético de cinco megabases, junto con translocaciones balanceadas. El cariotipo ha sido la prueba de oro en el análisis cromosómico prenatal en los últimos cuarenta años⁶⁵. Sin embargo, recientemente se ha venido incrementando el uso de la aCGH y se han realizado comparaciones con el cariotipo, encontrando que las frecuencias de diagnóstico prenatal con cariotipo son de 2,55% a 4,16%, y para aCGH de 5,3%, a 15%. En general, en el diagnóstico prenatal el cariotipo tiene una sensibilidad de 73,36% y una especificidad de 99,86%, y los aCGH una sensibilidad de 98,21% con especificidad de 99,75%⁶⁶.

CONCLUSIONES

Las técnicas moleculares, particularmente el aCGH, tienen mayor rendimiento diagnóstico que el cariotipo convencional en pacientes con RM idiopático debido a que permiten la detección de anomalías submicrocópicas, así como la identificación de un número creciente de MMS. Adicionalmente, el aCGH tiene mayor sensibilidad y una especificidad similar para diagnóstico prenatal de anomalías cromosómicas. Es probable que el aCGH se consolide como la prueba de primera línea para el análisis cromosómico en los próximos años. Incluso, ya se ha sugerido al aCGH como primera prueba diagnóstica, reemplazando el cariotipo en pacientes con problemas neurológicos, autismo, déficit cognitivo o recién nacidos con anomalías congénitas de etiología desconocida.

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