1.1 Los alimentos y su relación con la salud

La alimentación es una necesidad imperante de los seres humanos. Sin embargo, los alimentos pueden albergar diferentes peligros para la salud al contaminarse por agentes físicos, químicos y biológicos durante sus diferentes etapas de producción, almacenamiento, transporte y elaboración previos a su consumo, generando enfermedades que son consideradas como un serio problema y un reto para la salud pública alrededor del mundo debido a las elevadas tasas de incidencia, mortalidad y repercusiones económicas negativas del sector productivo y de salud por el desarrollo y acciones de implementación de estrategias de control, vigilancia y prevención en materia de salud pública, animal e industria alimentaria ^1-4. Para tales fines, en la producción de alimentos nutritivos e inocuos, se han utilizado nuevas tecnologías, buenas prácticas agrícolas, buenas prácticas pecuarias, buenas prácticas de manufactura, control de calidad y medidas de higiene y seguridad, así como sistemas preventivos como la ejecución del análisis de peligros y puntos críticos de control (HACCP, por sus siglas en inglés) ^5,6. La inocuidad es un concepto atribuido a todo alimento que no ocasiona daño ni enfermedad a la persona que lo consume y que junto con las características nutricionales, organolépticas y comerciales constituye la calidad integral del mismo ²⁾ y debe ser el factor común y prioritario a lo largo de la cadena productiva.

Las enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA) se definen como aquellas que son producto del consumo de agua y/o alimentos que presentan agentes nocivos ya sea de naturaleza física, química o biológica para la salud del consumidor. Los síntomas de estas enfermedades son diversos, presentándose de manera general: náuseas, vómito, diarrea, dolor abdominal y fiebre; en algunos casos presentan complicaciones severas como la sepsis, meningitis, aborto, síndrome de Reiter o muerte ⁷. Existen diferentes ETA las cuales se clasifican en: I. intoxicaciones, derivadas del consumo de alimentos en los que se encuentra una toxina o veneno formado en tejidos de plantas o animales o metabolito derivado del crecimiento microbiano. II. infecciones originadas por la ingestión de alimentos con microorganismos patógenos vivos, generando la invasión, multiplicación y alteración de los tejidos del huésped y III. toxiinfecciones que es la enfermedad que combina la infección con la intoxicación con cierta cantidad de microorganismos no invasivos capaces de producir y/o liberar toxinas durante su desarrollo en el intestino del huésped ^8,9.

Se han reportado aproximadamente 250 agentes causales de ETA en los cuales se encuentran bacterias, virus, hongos, parásitos, priones, toxinas y metales ^1,4,5. De los cuales los de mayor frecuencia asociados a estas enfermedades son contaminantes o agentes de origen biológico; tal es el caso de bacterias como: Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Clostridium perfringes, E. coli, Shigella spp., Yersinia spp., Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Vibrio spp., entre otros ^2,5,7,10.

La dimensión e impacto, alrededor del mundo, de las ETA es generalmente desconocida, habiendo numerosos países con sólo estimaciones ⁵. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima a nivel global una incidencia de 1 500 millones de casos de diarrea al año, debido a la cual 3 millones de niños por debajo de los 5 años de edad fallecen ^4,11. En los Estados Unidos, a través del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) se reportaron para el 2013 un total de 19.056 infecciones alimentarias, 4.200 hospitalizaciones y 80 defunciones ⁷. En Chile se registraron en el 2013 cerca de 1.164 brotes con 7.841 casos. En la Unión Europea, se registraron 5.648 brotes en 2011, resultando en 69.553 casos, 7.125 hospitalizados y 93 decesos ⁵. Mientras que, en Colombia en 2014, a través del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, se reportaron 9.730 casos ⁷ y en México en 2008, el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) brindó 2 millones 188 consultas médicas por enfermedades gastrointestinales, siendo los estados de Chihuahua, Coahuila, Jalisco, Michoacán, Guerrero y Oaxaca donde hubo mayor ocurrencia ¹⁰.

Algunos de los factores que han contribuido a la aparición de estas enfermedades son la globalización del mercado, la aplicación de nuevos procesos de fabricación y de nuevos productos, los cambios de hábitos alimentarios en la sociedad, el consumo de alimentos envasados, las comidas fuera del hogar, el expendio de comida preparada y de comida rápida ^1,4,5. Se prevé que el problema de salud pública se agudizara con estas enfermedades debido a la aparición de nuevas formas de transmisión, al mayor número de grupos poblacionales vulnerables y al aumento de la resistencia a compuestos antimicrobianos por parte de los patógenos ⁶.

El presente documento tuvo como finalidad mostrar una perspectiva general de las enfermedades transmitidas por alimentos y, específicamente, en el caso de las producidas por un contaminante de origen biológico como lo es Bacillus cereus, involucrando aspectos que van desde características microbiológicas generales, métodos analíticos enfocados en el aislamiento y detección, hasta las medidas de control y prevención de la contaminación por este patógeno en la producción de alimentos y la protección de la salud pública.

2.1 Bacillus cereus y generalidades

Las bacterias del género Bacillus spp., son microorganismos que se caracterizan por generar esporas y localizarse en los suelos; algunas especies son de carácter patógeno para el ser humano como son: B. anthracis o Bacillus cereus. Sin embargo existen otras especies que presentan beneficio para el ser humano, al ser utilizadas como indicadores de desinfección y esterilización, son productoras de antibióticos, vitaminas, enzimas, intervienen en la solubilización de fosfatos y fijación biológica del nitrógeno ^12,13. Así mismo, desde hace ya algunos años se sabe que algunas especies son productoras de metabolitos secundarios anfipáticos denominados biosurfactantes (BS) los cuales han presentado propiedades fisicoquímicas y biológicas de interés y uso potencial en diversas áreas industriales como la farmacéutica, alimentos, ambiental, petróleo, entre otras ^14-18.

El género Bacillus presenta 51 especies dividido en tres grupos (1-3) los cuales están basados en la morfología de las esporas y los esporangios. El grupo 1 está subdividido en 1A y 1B en relación al tamaño de la célula y la presencia de poli-β-hidroxibutirato en el citoplasma, los microorganismos que pertenecen al Grupo 1A (o también llamado grupo B. cereus) el cual está conformado por: B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, y B. weihenstephanensis. La mayoría de los miembros de este grupo producen enterotoxina y se relacionan con la inducción de Bacillus hacia la generación de enfermedad ¹⁹.

Bacillus cereus, además, según estudios fenotípicos y genómicos (16S rRNA) presenta una analogía con otras especies como B. anthracis. Esta bacteria presenta una amplia distribución por distintos ambientes naturales como lo es el tracto intestinal de invertebrados, suelo, agua, vegetación y aire; pudiendo existir ya sea en forma de esporas o células vegetativas, siendo estas últimas capaces de colonizar el cuerpo humano ^19,20. Este microorganismo se caracteriza por presentar forma de bastón alargado de 1.0-1.2 µm en el diámetro x 3.0 a 5.0 µm de largo, Gram positivo, móvil, esporulado (cuando las condiciones de crecimiento no son favorables), anaerobio facultativo, tiene un intervalo de temperaturas de crecimiento que va de 4° C a 48° C donde sus esporas son capaces de tolerar hasta 95°C, pH de 4.3 a 9.3 y de actividad del agua de 0.912 a 0.95, así mismo, es capaz sobrevivir a condiciones salinas de hasta una concentración del 7 % ^20,22-25.

Cuando uno de los miembros del grupo 1A del género Bacillus es aislado, pero no completamente identificado, se le denomina B. cereus sensu lato (s.l.). Mientras que a los aislamientos completamente identificados obtenidos de este microorganismo se le denomina Bacillus cereus sensu estricto (s.s.) formando parte del grupo 1A. Las diferentes especies se pueden identificar a través de varios test en el laboratorio donde se evalúan características fenotípicas que involucran la capacidad para metabolizar distintos sustratos como son: azúcares, alcoholes, polisacáridos entre otras ^19,23 (Tabla 1).

Bacillus cereus es considerado un microorganismo con la capacidad de producir diferentes infecciones en el ser humano a nivel sistémico y local como la bacteriemia, meningitis y abscesos cerebrales, endoftalmitis, neumonía e infecciones cutáneas. Así mismo, genera afectaciones en el sistema gastrointestinal a través de los alimentos como son intoxicaciones y toxiinfecciones ^{20,21,23,27,28}. Entre los mecanismos que presenta B. cereus a fin de generar enfermedad en el huésped se encuentran la producción durante su crecimiento de tres fosfolipasas, una proteasa y dos tipos de enterotoxinas (emética y diarreica). Estas últimas, al ser consumidas en alimentos contaminados con un crecimiento estimado de 10⁵ a 10⁸ UFC/g pueden generar vómitos, náuseas y/o cuadros diarreicos ^20,23,25-27. Entre los alimentos frecuentemente involucrados en brotes de enfermedades se encuentran las harinas, salsas, sopas, carnes, ensaladas, verduras, pescado, leche, arroz y derivados ^21,23,27,28 .

Las toxinas de esta bacteria patógena son responsables de los principales síntomas por enfermedad alimentaria, las cuales consisten en: 1, la enterotoxina emética o cereulida que es un polipéptido cíclico hidrofóbico termoestable sintetizado al final de la fase logarítmica de crecimiento, bajo condiciones aeróbicas o micro aeróbicas que actúa como un ionóforo de potasio afectando los gradientes de concentración de iones transmembrana necesarios para el buen funcionamiento celular y asociado comúnmente a síntomas de nausea y vómitos y 2, las enterotoxinas o toxinas ligadas a un cuadro diarreico, que incluyen moléculas de naturaleza proteica termolábiles como: la hemolisina BL codificada por los genes hblA, hblC y hblD, citotoxina K codificada por el gen CytK y que guarda similitud a la β-toxina producida por Clostridium perfringens, la enterotoxina no hemolítica (Nhe) formada de tres diferentes genes codificantes como el nhe A, nhe B y nhe C incluidos en el operón nhe, siendo la expresión de todos los genes un producto biológicamente activo y finalmente se encuentra la enterotoxina FM, la cual es de carácter citotóxica en líneas celulares Vero. Las enterotoxinas son generadas una vez que se realiza la colonización del intestino delgado por el patógeno; formándose así poros en las membranas de las células epiteliales, resultando en un desequilibrio osmótico y promoviendo el proceso diarreico ^21,23,27,29.

2.2 Enfermedades transmitidas por alimentos, control y prevención.

Bacillus cereus es uno de los diferentes agentes biológicos causales de enfermedades transmitidas por alimentos alrededor del mundo ^21,30. En países como los Estados Unidos de América, a través de un programa de vigilancia mantenido por el centro de control de enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés), se colecta información referente al número de ETA, hospitalizaciones, defunciones, agentes etiológicos, alimentos implicados, factores contribuyentes, ajustes de preparación y consumo de alimentos asociados a fin de minimizar la incidencia ³⁰. En este país se estima una incidencia de 9.4 millones de ETA al año causadas por diversos patógenos, de los cuales el 14 % son originados por microorganismos como Bacillus cereus, Staphylococcus aureus o Clostridium perfringens. Tan solo en un estudio realizado en el periodo comprendido entre los años 1998 y 2008, se registraron 13.405 brotes de enfermedades, de las cuales 1.229 fueron causadas, en un 44 %, por C. perfringens, 37 % por S. aureus y 19 % por B. cereus, teniendo importantes secuelas económico-sociales negativas ³¹.

Bacillus cereus al encontrarse ampliamente extendido en la naturaleza puede contaminar fácilmente diferentes ambientes y productos como el caso de los alimentos, pudiendo ocurrir este fenómeno en cualquier fase de la cadena alimentaria; además, la resistencia a los antimicrobianos y la capacidad de formar esporas resistentes a diferentes condiciones adversas como los tratamientos térmicos, secado, congelación, acidez, desinfectantes y radiación usados en la eliminación de microrganismos, en la producción de alimentos, hace que se considere como un patógeno de mayor importancia en la industria alimentaria y en la salud pública ^20-29,32.

Se estima que la mayoría de las enfermedades generadas por este patógeno son debidas a las malas prácticas en tratamientos térmicos y condiciones de almacenamiento a las que son sometidos los alimentos ³⁰. El control y prevención de enfermedades por B. cereus involucra la atención prioritaria de diferentes factores que pueden promover la contaminación en diferentes fases de la cadena de producción; como son temperaturas de cocción (sin garantía de inocuidad el uso de altas temperaturas por ser microorganismo generador de esporas), condiciones higiénicas de almacenamiento, transporte, equipos, lugar y personal involucrado en el procesamiento y preparación de alimentos ^{9,23,31,33-35}.

Considerando la gran capacidad de este patógeno y sus esporas de tolerar diferentes condiciones fisicoquímicas, con la finalidad de reducir el riesgo de ETA, alrededor del mundo se han investigado, propuesto e implementado diferentes procesos de elaboración y preservación de alimentos que involucran: I) Agentes químicos como conservadores químicos (benzoatos, acetatos, nitratos, nitritos, anhídrido sulfuroso, entre otros). II) Agentes físicos mediante la aplicación de diferentes condiciones de calor, presión, radiación ionizante, campos eléctricos, sonicación, entre otros y III) Agentes biológicos a través del uso de microorganismos como son las bacterias ácido lácticas y/o metabolitos, polímeros (quitosano u oleorresinas), compuestos fenólicos presentes en extractos y aceites esenciales de origen vegetal. Así mismo, a nivel global se han desarrollado, implementado y reconocido por diferentes organizaciones como el Codex Alimentarius, la Organización Mundial para la Salud Animal (OIE por siglas en inglés), la Organización Internacional de Normalización (ISO por siglas en inglés), la Iniciativa Global para la Seguridad Alimentaria (GFSI por siglas en inglés), entre otros, códigos, directrices, esquemas normativos y de certificación en la producción y comercialización de alimentos como el British Retail Consortium (BRC), Safety Quality Food (SFQ), Global G.A.P, ISO 22000 y más, que involucran las buenas prácticas agrícolas, ganaderas, pesqueras y acuícolas, buenas prácticas de higiene y de preparación, sistemas en el análisis de peligros y puntos críticos de control (HACCP), criterios microbiológicos de materias primas y producto final, así como métodos de detección rápidos y confiables a fin de controlar y minimizar la presencia y contaminación de patógenos para garantizar la calidad e inocuidad de los alimentos ^9,23,33-40.

Entre las normas de regulación sanitaria implementadas por diversos países en América Latina como México, para controlar y reducir los riesgos de ETA, se encuentra la norma oficial NOM-251-SSA1-2009 ⁴¹, la cual solicita y expresa las prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, siendo de carácter obligatorio para productores y procesadores de alimentos. Así mismo, esta norma establece las directrices para establecer un sistema HACCP. Por otra parte, en América del Sur, en países como el Perú, a través de la Resolución Ministerial No. 591-2008/MINSA ⁴², se establecieron limites microbiológicos para B. cereus en productos alimenticios deshidratados de 100 UFC/g de alimento. Mientras que en la Comunidad Europea, a través del reglamento (CE, 2005), no 2073/2005 de la comisión del 15 de noviembre de 2005, se estableció el criterio microbiológico de 50 UFC/g para preparados deshidratados para lactantes y alimentos dietéticos deshidratados destinados a usos médicos especiales para lactantes menores de seis meses en el proceso final de fabricación, además de la inclusión del método analítico de aislamiento y cuantificación a implementar y las acciones en caso de criterio insatisfactorio como la mejora en la higiene de la producción, prevención de la re contaminación y la selección de las materias primas ⁴³.

2.3 Análisis e identificación en los alimentos

Hoy en día los procesos de aislamiento e identificación de bacterias se realizan a través de los métodos convencionales o tradicionales, los cuales tienen fundamento en las características fenotípicas, es decir, aquellas observables como la morfología, las propiedades bioquímicas y metabólicas. Su costo de implementación es accesible, además de que el cultivo, siempre que sea viable, es considerado el método de análisis de elección, permitiendo el aislamiento e identificación del microorganismo implicado, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y los marcadores epidemiológicos ⁴⁴.

Se han reportado diferentes metodologías para el análisis de B. cereus en alimentos basadas en características fenotípicas como es el método reportado por Tallent et al., ⁴⁵ que aparece en el manual de análisis bacteriológico (BAM por sus siglas en ingles) de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos de Norteamérica (FDA por sus siglas en inglés); basado en la enumeración por el método de número más probable (NMP), empleando series de tubos con caldos selectivos (caldo soya tripticasa-polimixina) y el cual se sugiere en la vigilancia microbiológica común de alimentos en los que se estima se determinen pequeñas poblaciones de B. cereus; así como en aquellos alimentos sometidos a procesos de deshidratación o que puedan contener una elevada contaminación de otras especies microbianas competidoras (Figura 1). Así mismo, involucra el aislamiento y confirmación de cepas que se realiza mediante el uso de medios de cultivo diferenciales y selectivos como el Manitol-Yema de huevo-Polimixina (MYP) agar en el cual las colonias son de color rosa brillante con una zona de precipitación de yema de huevo y el agar cromo génico Bacara, donde el crecimiento corresponde a colonias de color rosa-naranja rodeadas de un halo opaco, realizando así, posteriormente, pruebas bioquímicas de confirmación como la hemolisis, movilidad, catalasa, tinción Gram, metabolismo de manitol, metabolismo de glucosa, entre otras (Tabla 1). Otro de los métodos comúnmente utilizados y normalizados para el análisis de alimentos, en la búsqueda y detección de B. cereus, son los propuestos por la Organización Internacional de Normalización (ISO por su siglas en inglés) ⁴⁶, para el aislamiento y recuento en placa (Figura 2) e ISO ⁴⁷, para la detección y la enumeración del presunto Bacillus cereus, viable en bajas proporciones por la técnica de número más probable (NMP); esto mediante el uso de medios de cultivos selectivos como el agar MYP y pruebas bioquímicas de hemólisis.

Figura 1 Flujograma de detección de B. cereus en alimentos por número más probable (NMP). Flowchart for detection of B. cereus in food by most probable number (MPN) ⁴⁵. 

Figura 2 Flujograma para el aislamiento e identificación de Bacillus cereus en placa presente en alimentos. Flowchart for the isolation and identification of Bacillus cereus in plaque present in foods ^46,49. * Acorde a la norma ISO ⁴⁷. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP). 

Otros métodos fenotípicos utilizados también son los ensayos inmuno enzimáticos basados en la reacción antígeno-anticuerpo para la detección de B. cereus. Éstos se realizan con base en la búsqueda de subunidades de enterotoxinas producidas, encontrándose disponibles comercialmente diferentes test que detectan subunidades de enterotoxinas HBL y NHE como es el inmunoensayo visual BDE-VIA de Tecra® y el método de la aglutinación reversa pasiva (BCET-RPLA) de Oxoid®. Sin embargo, la mayoría de estas pruebas presentan desventajas ya que, al sólo detectar una toxina específica, pueden producir falsos negativos para B. cereus que expresen más de una enterotoxina y no determinan la bioactividad de la toxina al detectar solo una subunidad de las tres presentes en cada una de las enterotoxinas HBL y NHE debido a que las tres subunidades que constituyen estas toxinas son requeridas para mostrar actividad biológica ²³.

En ocasiones la identificación de microorganismos en el laboratorio puede presentar una falta de concordancia entre las características fenotípicas del aislamiento en estudio y las cepas control o se es requerida una mayor rapidez en la obtención de resultados, generando así que los métodos fenotípicos realicen la identificación más factible pero no definitiva. Para soslayar estos inconvenientes se han desarrollado y propuesto métodos basados en características genómicas en el análisis de los genes ARNr 16S, 16S-23S ARNr, ARNr 23S, rpo B (subunidad β de la ARN polimerasa), y gyr B (subunidad ß de la ADN girasa), también se encuentran los métodos basados en la proteómica como las electroforesis y espectrometría de masas como el Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización por láser asistida por matriz) y el analizador Time of Flight (TOF) (tiempo de vuelo) (MALDI-TOF por sus siglas en inglés) los cuales pueden ser usados para la identificación microbiana en carácter complementario o alternativo ^44,50. Entre los métodos de análisis genómico de patógenos de transmisión alimentaria se encuentra la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual presenta una rapidez de obtención de resultados, buen límite de detección, especificidad y sensibilidad, fácil automatización y capacidad de procesamiento de grandes cantidades de muestras ⁶. Para el caso de B. cereus se han desarrollado métodos de detección en alimentos mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) en variantes de PCR simple, múltiple o tiempo real cuyos blancos genéticos son el gyr B, 16S rRNA y genes de toxicigenicidad que codifican para enterotoxinas y sus diferentes componentes como la enterotoxina no hemolítica NHE con genes nheA, nheB y nheC y hemolisina HBL (hblA, hblD y hblC), enterotoxina T (entFM) y citotoxina K (cytK)^27,51-54. Mientras que a través de técnicas proteómicas basadas en el estudio de perfil proteínas o huella peptídica como es la electroforesis y MALDI-TOF/MS ^55-56 ya se ha reportado la detección de B. cereus y sus enterotoxinas como la citotoxina K1 (CytK1) y enterotoxina no hemolítica (NHE) ⁵⁵. De igual forma la técnica de PCR se ha combinado para la detección y tipificación en estudios epidemiológicos siendo el método más usado y con mejores resultados el del ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (Random Amplified Polymorphic DNA-RAPD) obteniendo huellas genéticas para identificación y diferenciación entre B. cereus y otras especies en alimentos ^23,26,57,58.