1 Introducción

En las últimas décadas, se ha encontrado en América Latina que la situación alimentaria y nutricional de las poblaciones ha presentado un mejoramiento, acompañado de una reducción progresiva de la mortalidad, sin embargo, otras carencias específicas como la anemia por deficiencia de hierro, el bocio endémico y la hipovitaminosis A, continúan altamente prevalentes ^{1 - 2}. También están adquiriendo importancia otras formas de malnutrición por exceso de consumo de un determinado tipo de alimento y por el consumo de dietas inadecuadas, las cuales constituyen factores de riesgo en el aumento de enfermedades relacionadas con la nutrición, tales como la obesidad, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer, que originan serios problemas de salud ^{3 , 4}. Para el análisis del estado óptimo de nutrición de una persona, se establecen técnicas analíticas como la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), que también permiten plantear recomendaciones en cuanto al tipo de alimentación, según los niveles en sangre de sustancias nutritivas como aminoácidos, lípidos, proteínas y glucosa ^{( 5}.

Desde que se introdujo la técnica de cromatografía de columna para análisis de aminoácidos ^{6 - 7} ha habido un dramático aumento en el desarrollo de estrategias y métodos para mejorar los resultados obtenidos en la detección de los diferentes aminoácidos. Este aumento se ha obtenido gracias al desarrollo rápido de la separación por HPLC y, que, desde hace algunos años, el procedimiento de análisis de aminoácidos basado en la derivatización pre-columna con fenilisotiocianato (PITC) ha ido ganando popularidad. Una revisión de la literatura muestra que antes de junio de 1981 se habían publicado un poco más de 100 artículos que utilizaban esta técnica. A pesar de no ser tan sensitivos como algunos de los reactivos fluorescentes, los derivados feniltiocarbamil (PTC) altamente absorbentes en la región UV ⁸, pueden ser detectados a niveles de 1 pmol ⁹, que representa un nivel práctico de sensibilidad para muestras reales con problemas de contaminación ¹⁰, de ahí la importancia de la preparación de la muestra, especialmente la hidrólisis de muestras como péptidos y proteínas en el análisis de aminoácidos y de implementar mejoras para el estudio.

Hariharan y colaboradores desarrollaron análisis de aminoácidos plasmáticos por HPLC con detector de UV y derivatización pre-columna utilizando fenilisotiocianato (PITC) ¹¹. En este estudio ellos lograron la determinación de 25 aminoácidos y un porcentaje de recuperación de 99,9 %. El análisis fue lineal superior a 2 mmol, con un límite de detección de 1 pmol y un tiempo de análisis de 35 minutos. Por otro lado, Sánchez y Hubbard estudiaron la concentración de aminoácidos plasmáticos y la relación insulina/glucagón como una explicación para observar el efecto de proteína dietética en la arterosclerosis, encontrando que la composición aminoacídica de la dieta, tiene una influencia en los niveles postprandiales de los aminoácidos plasmáticos, lo mismo que a las hormonas insulina y glucagón, en humanos alimentados con un solo tipo de proteína idéntica en composición, excepto por su naturaleza (vegetal o animal) ^{( 12}.

Tenemos que el método estándar para la estimación de la calidad de una proteína en humanos, involucra indicadores bioquímicos que permiten la evaluación de la calidad nutricional proteínica de una determinada dieta. Este método consiste en la determinación de los niveles de aminoácidos en plasma o suero, teniendo en cuenta que en varias dietas los factores fisiológicos y patológicos afectan los niveles de aminoácidos en plasma ^{( 13}. En un intento por evaluar el valor nutricional de proteínas, se han usado cambios postprandiales (curvas de respuesta) en niveles plasmáticos de aminoácidos para calcular índices que permitan predecir los aminoácidos limitantes de varias proteínas ingeridas. Son muchos y variados los métodos de evaluación de la calidad proteica que han sido reportados y entre los más representativos, están los índices químicos ¹⁴, el índice de Oser ¹⁵, el índice de Mitchell ¹⁶, y el índice de aminoácidos o Score de aminoácidos ^{( 17}, los cuales se basan en el hecho de fundamentar el valor nutritivo o la calidad de las proteínas alimentarias, en la identidad y cantidad de aminoácidos resultantes en su proceso hidrolítico enzimático.

Estos índices tienen como ventajas su sencillez y el hecho de identificar el aminoácido limitante en la proteína a investigar, pero entre sus desventajas está la de no considerar la digestibilidad de la proteína y la de los aminoácidos; también tenemos que la predicción de la calidad proteica es bastante buena para proteínas de muy alta o de muy baja calidad, pero se observa una baja exactitud en la predicción de proteínas de calidad intermedia ¹⁸.

En cuanto a la biodisponibilidad de las proteínas alimentarias, se sabe que es la mejor medida de calidad, debido a que tiene en cuenta la ingestión, digestión y utilización metabólica de los productos resultantes y entre los métodos de determinación más antiguos, encontramos el índice de eficiencia proteica o PER, desarrollado por Osborne ¹⁹, a partir del cual se han propuesto variaciones ^{20 - 21}. A pesar de ser continuamente cuestionado, en 1975 fue adoptado por la AOAC y se fundamenta en ensayos experimentales con ratas macho recién destetadas a las cuales se les determinó el factor de ganancia de peso / gramo de proteína ingerida, utilizando un solo nivel de proteína. Algunos autores como Bressani ²² han demostrado una estrecha relación entre los análisis para determinar calidad proteica en humanos y animales, siendo ambas técnicas largas y costosas. Teniendo en cuenta esto y que la medida más exacta de la calidad de las proteínas es la que se realiza en el organismo vivo e inalterado, lo más conveniente es considerar el cuerpo humano como el mejor organismo test ^{( 23}.

El presente estudio exploratorio tuvo como objetivo validar un método de determinación de aminoácidos plasmáticos por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para evaluar las respuestas basales y postprandiales de aminoácidos en seres humanos con diversas dietas. Adicionalmente, se compararon las respuestas pre y post de glucosa, triglicéridos, colesterol, colesterol-HDL, proteína total y albúmina, en 9 adultos jóvenes sanos que ingirieron cantidades iso-proteicas de tres dietas típicas de Colombia: huevo cocido (HC), tortilla (arepa en Colombia) de maíz común simple (TMN) y tortillas (arepas) con queso mozzarella (TMQ). A partir de las comparaciones pre y post, se observaron respuestas diferenciales, estadísticamente significativas entre las diferentes dietas, lo que permitió demostrar que la biodisponibilidad de las proteínas y por ende de los aminoácidos debería ser el factor más importante para establecer recomendaciones nutricionales.

2 Materiales y métodos

3 Análisis y Resultados

Para la identificación de cada aminoácido después de la cromatografía se tuvo en cuenta el siguiente cromatograma típico de una muestra de estándar (Figura 1):

Figura 1 Cromatograma típico de un estándar de aminoácidos libres. 

Teniendo en cuenta el tiempo de retención para cada aminoácido, se hizo la identificación de éstos en las muestras de plasma. Los estándares de concentración 2,5 μmol/mL, que contienen los 18 aminoácidos presentan una buena separación como se observa en la Figura 1.

Con el propósito de estimar la linealidad del método, se tomaron por separado 1,0 μL, 2,0 μL, 3,0 μL, 4,0 μL y 5,0 μL, de la solución estándar de los aminoácidos de concentración 2,5 μmol/mL y se diluyeron a 600 μL con la solución diluente PicoTag obteniendo concentraciones de 4,2 μmol/L, 8,3 μmol/L, 12,5 μmol/L, 16,7 μmol/L y 20,8 μmol/L respectivamente, para todos los aminoácidos, excepto para la cisteína que se encontraba en una concentración de 1,25 μmol/mL.

En las Figuras 2 y 3aparecen las curvas de calibración para dos de los aminoácidos más representativos: lisina y metionina.

Figura 2 Curva de calibración para lisina (Lys). 

Figura 3 Curva de calibración para metionina (Met) 

En la Tabla 2 podemos apreciar los tiempos de retención promedio de los 18 aminoácidos estándar, así como también los respectivos coeficientes de correlación para la curva estándar a 5 concentraciones diferentes. Se observa cómo los coeficientes de correlación presentan valores que van desde 0.9983 para prolina y triptófano hasta 0.9996 para arginina, treonina y metionina. Teniendo en cuenta que para la cisteína el coeficiente de correlación fue de 0.9917, el más bajo de todos tal vez por la baja concentración en la que se encuentra en los estándares. Es destacable aquí la excelente respuesta en cuanto se refiere a la linealidad como sistema analítico para caracterizar el método de HPLC empleado.

Con el propósito de establecer los tiempos de retención de cada aminoácido en la muestra de plasma, se trató 1,0 mL de ésta con 10,0 mg. de ácido sulfosalicílico (ASS), seguido de agitación con vórtex y posterior centrifugación a 3000 rpm durante 30 min. Se obtuvieron los aminoácidos libres en el sobrenadante, el cual se separó y filtró a través de una membrana de 0,45 μm. Las muestras así tratadas se procesaron en igual forma que los estándares tanto en el proceso de derivatización como en el análisis cromatográfico.

En el cromatograma correspondiente a los aminoácidos libres del plasma observado en la Figura 4, se puede apreciar la excelente resolución para la mayoría de los aminoácidos y la estrecha similitud en cuanto a los tiempos de retención los cuales aparecen comparados en la Tabla 3. Para la muestra de aminoácidos libres de plasma humano no hay buena resolución en los picos de arginina y treonina debido posiblemente a efectos de columna ya que esta tenía cierto tiempo de uso. Sin embargo, para propósitos de investigación podemos considerar como de excelente resolución. Estos resultados muestran una mejor resolución de picos de todos los aminoácidos en contraposición a los obtenidos por Lavi et al. ^{26 )} quienes reportaron alguna dificultad en la determinación de lisina, histidina, treonina, cisteína en fluidos biológicos por derivatización pre columna con PITC y separación de los aminoácidos derivatizados por cromatografía en fase reversa.

Figura 4 Perfil de aminoácidos plasmáticos libre. 

Por otra parte, a pesar de que algunos autores ²⁷ sostienen que el uso de metanol y ASS como agentes desproteinizantes causan considerables pérdidas y reducen el rendimiento de muchos PTC-aminoácidos, al realizar ensayos de porcentaje de recuperación en la Tabla 4 se puede observar que se obtuvieron muy buenos resultados, con porcentajes superiores al 90 % para la mayoría de los aminoácidos, excepto la glicina, demostrando de esta manera una buena exactitud del método de extracción de los aminoácidos libres del plasma humano utilizando como agente desproteinizante el ASS, esto puede deberse también al empleo del sistema de liofilización que por las condiciones de bajas temperaturas (-40 °C) y bajas presiones (5-10 mbar) evitan en gran parte la pérdida de PTC-aminoácidos por reacciones colaterales y simultáneamente mantienen la estructura molecular intacta lo cual no puede estar sucediendo cuando se utilizan los otros sistemas de secado en la pre-derivatización.

El procedimiento de hidrólisis, en particular, puede influenciar el perfil de aminoácidos. Algunos aminoácidos (Cys, Met, Trp, Thr., Ser y Tyr) se pueden destruir y otros (Val e Ileu) presentan problemas de velocidad. Los procedimientos analíticos también pueden afectar el perfil de aminoácidos. En conclusión, el método de cromatografía líquida reportado en esta primera fase del estudio puede ser usado para la determinación con una muy buena linealidad de los aminoácidos más importantes nutricionalmente especialmente los aminoácidos esenciales (Lys, Val, Phe, Leu, Met, Thr, Trp, Ile).

Respecto al triptófano, de acuerdo con cromatogramas publicados por Sherwood ²⁸ y Hariharan ¹¹ de aminoácidos plasmáticos utilizando las mismas técnicas de pre-derivatización con PITC y técnicas cromatográficas similares, se puede realizar su caracterización ubicándolo entre fenilalanina y lisina con un tiempo de retención promedio de 18.367 min. Esto es importante, debido a que el triptófano es un aminoácido esencial fácilmente degradable como se ha observado en los estudios in vitro de hidrolizados proteicos, por lo cual es necesario diseñar una técnica especial, en nuestro caso, por no haber realizado hidrólisis ácida.

Los niveles plasmáticos de triptófano pueden ser empleados como índice de su biodisponibilidad. Estudios similares en rumen animal han sido realizados por Or-Rashid et al. ^{( 29}. El método de derivatización con fenilisotiocianato y el secado de la muestra en un liofilizador reportado en esta investigación puede ser usado como un método alternativo para una evaluación rápida de calidad proteínica ya sea desde el punto de vista de disponibilidad como de biodisponibilidad, metodología que según Hernández et al. ^{23 )} es costosa.

Una vez concluida la fase I, se procedió a aplicar los resultados obtenidos en la misma para la determinación de la biodisponibilidad de aminoácidos en las dietas bajo estudio. En la Tabla 5 se muestra el porcentaje de recambio total de aminoácidos. Los resultados que se obtuvieron indican que, para el análisis comparativo de las 3 dietas, la Ser, Ala, Pro, Tyr, Val, Ile, y Phe presentan diferencias estadísticamente significativas al 99 % de confianza (P<0.01), solo Leu presenta diferencias estadísticamente significativas al 95 % de confianza (P<0.05) y los demás aminoácidos en estudio no presentan diferencias estadísticamente significativas.

La Figura 5 se observa comparativamente el porcentaje de recambio de aminoácidos individuales para cada una de las dietas. Los aminoácidos que presentan un aporte significativo al “pool” por parte de la dieta de tortilla de maíz con queso son: Lys, Trp, Phe, Leu, Ileu, Cys, Tyr, Pro, Ala, Arg/Thr, Gly, Ser. La mencionada dieta tiene una acción positiva de enriquecimiento del “pool” mucho mejor que la dieta de tortilla de maíz normal. En cuanto al efecto del sexo, se detectó la existencia de un nivel de cambio dentro de las dietas, ya que para la dieta de tortilla de maíz con queso (TMQ) las mujeres dieron 17,4 % de recambio, los hombres 20,2 %; en el caso de la dieta de huevo cocido (HC), las mujeres dieron un 8,1 % y los hombres -17,7 %; la dieta de tortilla de maíz normal (TMN) dio, en el caso de las mujeres, -27,5 % y, para los hombres, el valor del recambio fue -10,2 %.

Figura 5 Porcentaje de recambio de aminoácido. 

Una vez realizadas las pruebas de ANOVA en donde se demostró que existían diferencias altamente significativas en porcentaje de recambio de aminoácidos entre las tres dietas, se procedió a efectuar las pruebas de comparación de medias de Duncan, dicha prueba dio como resultado que la dieta que marca la diferencia, cuando se analizan resultados en hombres, es la dieta de maíz con queso (TMQ), es decir, que no hay diferencias significativas entre las dietas de tortilla de maíz normal (TMN) y huevo cocido (HC), en tanto que, para el caso de los resultados en mujeres, la prueba de comparación de Duncan señala que la dieta que marca la diferencia es la de tortilla de maíz normal (TMN), con un aporte negativo de 27,52 % al pool, sin observarse diferencias significativas entre las otras dos dietas bajo estudio. No sucede igual comportamiento en el análisis global (promedio de hombres y mujeres), ya que la dieta que marca la diferencia es la dieta de tortilla de maíz con queso (TMQ) con un aporte positivo de 18,80 % y se observa que no hay diferencias significativas entre las dietas de tortilla de maíz normal y huevo cocido (HC).

Cuando analizamos las diferencias entre los resultados obtenidos con proteína de huevo y las proteínas de maíz, encontramos que el huevo a pesar de ser la proteína patrón de la FAO presenta una disminución notable en cuanto a la biodisponibilidad de los aminoácidos, esto puede deberse al efecto de tratamiento térmico toda vez que el calentamiento del huevo puede producir una reacción de pardeamiento de Maillard ya que la clara de huevo contiene cierta cantidad de glucosa (0,4 %) la cual al reaccionar con la proteína disminuye el valor biológico de la misma haciendo que el aporte de aminoácidos al “pool” se reduzca ostensiblemente. Esto concuerda con la característica tan peculiar de las proteínas de la clara de huevo de ser bastante sensibles a los diversos factores que promueven su desnaturalización ^{30 - 31}. En el caso de la tortilla de maíz normal, ha quedado bien establecido que la proteína del maíz normal es de poca calidad debido a que es deficiente en dos aminoácidos, lisina y triptófano ^{32 - 33} lo cual disminuye la biodisponibilidad de los demás aminoácidos y es, por esta razón, que el aporte de aminoácidos al “pool” genera valores negativos con la consecuente disminución en el valor biológico. Un comportamiento diferente se observa cuando la tortilla de maíz es “enriquecida” con queso, ya que la suplementación hace que la proteína proveniente del queso mejore de manera significativa el valor biológico puesto que el aporte de aminoácidos esenciales mejora la biodisponibilidad de la mayor parte de los aminoácidos.

El proceso de suplementar una proteína vegetal (maíz) con otra de origen animal (queso) se conoce bastante bien, solo que en nuestro caso estamos comprobando el efecto que tiene desde el punto de vista de biodisponibilidad como un aporte positivo al “pool” de aminoácidos de los voluntarios en estudio. Es importante anotar que el queso por encontrarse en medio de la tortilla de maíz no recibía un aporte importante de tratamiento térmico directo conservando de esta manera las características nutricionales casi intactas.

Los resultados hasta aquí obtenidos nos permiten plantear una concordancia respecto al concepto de que las proteínas poseen diferente calidad nutritiva o biodisponibilidad, es decir, ellas difieren en su capacidad para cubrir los requerimientos proteicos en humanos, según las necesidades del organismo. Es por tal motivo que la biodisponibilidad de las proteínas y, por ende, de los aminoácidos debería ser el factor más importante para establecer recomendaciones nutricionales. De igual manera, en cuanto al aspecto tecnológico se refiere, la biodisponibilidad nos permite clasificar las proteínas según su verdadero potencial nutritivo pudiendo detectar cambios que puedan ocurrir durante el procesado y almacenado de los alimentos. Observemos entonces, cómo la proteína del huevo a pesar de tener un alto puntaje químico, cuando se trata bajo las condiciones normales de consumo en Colombia la biodisponibilidad de los aminoácidos se reduce de manera importante.

Esto nos lleva a la conclusión final de que la presencia de un nutriente en un alimento no indica su digestibilidad. Además, la digestión adecuada del mismo no asegura su absorción y la absorción del mencionado nutriente no nos asegura que sea posible su utilización en una determinada función fisiológica. Por tanto, la biodisponibilidad es el concepto más importante que nos refleja globalmente los diferentes procesos metabólicos implicados en la utilización de un nutriente por parte del organismo puesto que considera todos los factores intrínsecos y extrínsecos que afectan a dicha utilización. Desde luego que se requiere más ajuste y control a los parámetros que intervienen en la determinación de la biodisponibilidad de los aminoácidos para entrar a aprobar totalmente el modelo aquí planteado. De todas maneras, es claro de nuestro estudio y en concordancia con los estudios clásicos de Vaughan y colaboradores ³⁴, que es posible tener una buena idea del verdadero valor nutricional de las proteínas en una determinada dieta cuando utilizamos el nivel de respuesta de aminoácidos libres en plasma humano.

La siguiente fase se llevó a cabo, con el propósito de establecer el comportamiento de los niveles séricos de la glucosa, lípidos y proteínas en los individuos bajo estudio con las dietas investigadas. Los sujetos bajo estudio se mantuvieron en el peso corporal normal y antes de la toma de muestras post ingesta, realizaron sus labores de rutina diaria. Ellos consumieron el peso de dieta equivalente a 12 % de proteína y en el caso del huevo cocido (HC) la ingesta de calorías fue de 1,680 cal/g, siendo para la ingesta de tortilla de maíz común (TMN) y tortilla de maíz con queso (TMQ) de 3,840 cal/g. Es conveniente aclarar aquí, que la ingesta de calorías es diferente para el caso de la dieta de huevo y las dietas de tortilla de maíz. El propósito del diseño era el de considerar factores extrínsecos e intrínsecos en la biodisponibilidad de los nutrientes a evaluar, de tal manera que las dietas fueran consumidas bajo las condiciones normales de ingesta. La concentración inicial obtenida en el tiempo cero horas, en ayunas, para cada una de las variables demostró que no existían diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones totales para los tres días diferentes del estudio.

Finalmente, la Tabla 6 muestra el comportamiento global de hombres y mujeres en la cual es posible destacar que de los análisis realizados los únicos que marcan la diferencia son los obtenidos con la dieta de TMQ para proteínas totales con 21,742 % ± 12,122 y albúmina con valores de 21,166 % ± 14.75.

4 Conclusiones

Con base a los anteriores resultados podemos sugerir que algunos de estos aminoácidos, especialmente el triptófano (Tyr), podrían servir como fuente de diagnóstico para establecer mejoramiento en la calidad en una dieta nutricional desde el punto de vista proteico. Por otro lado, el método reportado de derivatización con fenilisotiocianato y el secado de la muestra en un liofilizador permite obtener información de calidad acerca del valor nutritivo de ciertos alimentos y tiene una buena perspectiva para su utilización en el análisis de biodisponibilidad de proteínas y aminoácidos directamente en humanos, considerando los factores específicos en torno a los procesos metabólicos de nuestra especie. El modelo aquí propuesto, con los correctivos y mejoras que se puedan ejecutar, podrán servir de información de primera mano para un conocimiento más próximo a la realidad de las dietas de una región o de una nación.