Amelogénesis

La morfogénesis de los órganos dentarios inicia a la sexta semana de vida intrauterina en seres humanos (aproximadamente a los cuarenta y cinco días), y en el ratón inicia en el estadio E12.5¹. El primer indicio consiste en la diferenciación de la lámina dental o listón dentario, originado del ectodermo que reviste la cavidad oral. El ectomesénquima induce a las células basales del epitelio oral a proliferar y formar dos nuevas estructuras: la lámina vestibular y la lámina dentaria. La lámina vestibular formará el surco vestibular y la lámina dentaria dará origen a los crecimientos epiteliales correspondientes a los futuros dientes; 20 deciduos y 32 gérmenes de dentición permanente. De acuerdo a su morfología, los gérmenes dentales seguirán una evolución en: estadio de brote macizo (o yema), estadio de casquete, estadio de campana y estadio de folículo dentario, terminal o maduro.

Es en el estadio de campana el órgano del esmalte presenta una nueva capa, el estrato intermedio, ubicado entre el retículo estrellado y el epitelio interno. Al finalizar esta etapa de campana, inicia la histogénesis o aposición de los tejidos duros dentarios (dentina y esmalte). Las células que conforman el epitelio interno, también llamadas preameloblastos, se diferencian en ameloblastos jóvenes y serán las encargadas de la producción del esmalte.

El esmalte, también conocido con el nombre de sustancia o tejido adamantino, está ubicado en la porción coronal cubriendo la dentina subyacente. Se origina del órgano del esmalte, y es el tejido más duro del organismo. Está constituido por los prismas de esmalte, los cuales están altamente mineralizados, ubicados desde la conexión amelodentinal (CAD) a la superficie externa o libre en contacto con la cavidad oral. La matriz inorgánica del esmalte la conforman los cristales de hidroxiapatita y representa un 95%. Estos están constituidos por fosfato de calcio y se encuentran densamente compactados. La matriz orgánica del esmalte es de naturaleza proteica; sin embargo, en su composición química no participa el colágeno. Está en menor proporción y representa el 0,36-2%.

El estadio de campana será de gran importancia para la formación de la morfología coronal por acción de señales específicas del ectomesénquima adyacente sobre este epitelio interno. Este patrón coronal se determinará previo a la aposición y mineralización de los tejidos dentales.

El ameloblasto es la célula encargada de la secreción de la matriz orgánica, y durante la formación del germen dentario atraviesa una serie de etapas o estadios, las cuales se caracterizan por presentar cambios funcionales y ultraestructurales que dependen de la actividad celular, de acuerdo a los procesos de formación o maduración del esmalte. Por tal motivo encontramos cuatro etapas importantes para el desarrollo del esmalte: la fase pre-secretora, secretora, de transición y maduración.²

El desarrollo del esmalte o amelogénesis comprende dos etapas: la primera es la formación de una matriz orgánica extracelular y la segunda es el proceso de mineralización de esta matriz, la cual comprende a su vez la formación y elongación de los cristales y la eliminación de la matriz orgánica y la maduración de los cristales.

Los ameloblastos se diferencian a partir del epitelio interno del órgano del esmalte. Antes de que se lleve a cabo este proceso, se requiere de la presencia de la dentina. A este estadio se le denomina presecretorio, donde antes de la formación mineral se requiere la deposición de predentina por los odontoblastos en la futura unión amelodentinal.

En el estadio secretorio, se caracteriza porque los preameloblastos se transforman en células secretoras, diferenciadas, muy especializada y ha perdido la capacidad de hacer mitosis. Son células cilíndricas de 60 µm de altura aproximadamente. A nivel ultraestructural presenta abundantes mitocondrias, complejo de Golgi, RER distribuido por toda la célula y más desarrollado en el polo proximal. Presenta microfilamentos de tubulina, Α-actinina, vinculina y prequeratinas. Además, presenta vesículas llamadas cuerpos ameloblásticos o cuerpos adamantinos, las cuales son formaciones de tipo granular, y son precursores de la matriz orgánica del esmalte. Su contenido no se conoce con exactitud, se cree que son de naturaleza proteica y algunos autores consideran que pueden tener sales minerales cálcicas en forma soluble.

Una vez estos cuerpos ameloblásticos son formados en el complejo de Golgi, migran al polo proximal del ameloblasto, donde se liberan contra la dentina formada. Es así que se forma la primera capa de esmalte aprismático. Los ameloblastos se alejan de la superficie de la dentina y se forman los procesos de Tomes, estructura que se encarga de la formación de los cristales. Mientras esto ocurre, el ameloblasto produce cuatro proteínas diferentes y las secreta en la matriz de esmalte. Tres de estas son proteínas estructurales y una es una proteinasa. La amelogenina (AMELX) representa un 80-90% de la matriz orgánica, y la ameloblastina (AMBN) y enamelina (ENAM) representan el 5% y 3-5% respectivamente, y la proteinasa, que es una metaloproteinasa de matriz-20 (MMP-20, enamelisina), que está en cantidades variables. Finalizando la etapa secretoria, se alcanza el espesor total de la capa de esmalte.

El inicio del estado de transición del diente en desarrollo varía según el diente, al igual que entre las especies. En esta etapa el ameloblasto reduce su tamaño, aumentan su diámetro transversal y complejo de Golgi y su RER disminuye de volumen. El proceso de Tomes desaparece y en el polo proximal aparecen microvellosidades e invaginaciones tubulares. Estas estructuras les permiten tener capacidad absortiva y eliminar agua y matriz orgánica del esmalte. Esto facilita el posterior aumento de componente orgánico y la transformación a un esmalte maduro. En este estadio los ameloblastos sintetizan ATPasa dependiente del calcio y enzimas lisosómicas y fosfatasa alcalina. En la fase de transición muere el 25% de los ameloblastos y en la etapa de maduración muere el otro 25%.

Cuando se ha conformado el esmalte maduro, el ameloblasto entra en estado de regresión, las células se fusionan con el resto de las capas del órgano del esmalte. Estos estratos conformarán una capa estratificada llamada epitelio reducido del esmalte, cuya función será la protección del esmalte maduro. Si este epitelio se degenera prematuramente, no puede haber erupción dentaria.³

Metaloproteinasa de Matriz 20 (MMP-20)/ Enamelisina

Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son una familia de proteinasas secretadas como proenzimas o zimógeno inactivo responsables de la degradación de componentes de la matriz extracelular (MEC), y su actividad está regulada por sus inhibidores endógenos o TIMPs. Las MMPs participan en procesos normales del desarrollo embrionario, en la reproducción (ciclo endometrial) y el mantenimiento (remodelado del hueso), y en procesos patológicos como la destrucción del tejido (enfermedad periodontal, caries, inflamación pulpar) y enfermedades fibróticas (esclerosis múltiple). Los miembros de esta familia se han clasificado en seis grupos diferentes, de acuerdo a su organización estructural y funcional.⁴

Al grupo de las colagenasas pertenecen la MMP-1, MMP-8, MMP-13 y MMP-18. Estas enzimas se encargan de degradar colágeno intersticial I, II, y III y otros componentes de la matriz extracelular. El siguiente grupo son las gelatinasas, la gelatinasa A (MMP-2) y gelatinasa B (MMP-9). Estas se encargan de la degradación de colágenos desnaturalizados y laminina. El tercer grupo son las estromelisinas; estromelisina 1 (MMP-3) y estromelisina 2 (MMP-10) y degradan diferentes componentes de la MEC. Entre estos encontramos fibronectina, laminina, proteoglicanos y colágenos no fibrilares IV, V, IX, y X. Las matrilisinas se caracterizan por la ausencia de un dominio de hemopexina, y pertenecen la matrilisina 1 (MMP-7) y matrilisina 2 (MMP-26). Las metaloproteinasas tipo membrana (MT-MMPs) son: MMP- 14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 y MMP-25. Por último, encontramos siete MMPs que no han sido clasificadas en ninguno de los grupos mencionados, entre estas encontramos la enamelisina (MMP-20) que se encarga de la degradación de la amelogenina.⁵

En los últimos años se demostró que el componente proteico del esmalte maduro disminuía significativamente en comparación con el esmalte inmaduro. En el proceso de amelogénesis, encontramos los siguientes componentes de la matriz orgánica del esmalte: la tuftelina, o también llamada proteína de flecos, y la sialofosfoproteina dentinaria (DSP) en la unión amelodentinaria. Posteriormente, se producen las amelogeninas, que conforman el 90% de la materia orgánica y van disminuyendo a medida que el esmalte avanza hasta su estado de maduración. La enamelina y la ameloblastina se forman en último lugar, y en este momento participan las MMPs presentes en la fase secretora de los ameloblastos y proteasas de serina, las cuales se asocian en la parte superficial de los cristales de esmalte y en la fase de maduración.

Múltiples investigaciones sugieren que, en el esmalte en desarrollo, las MMPs intervienen en un cambio de los componentes de la matriz orgánica cuando los ameloblastos pasan de la fase secretora a la fase de maduración. Se ha demostrado que la MMP-20 tiene habilidad para escindir la amelogenina y enamelina y es la única MMP durante la fase secretora. También es capaz de escindir la pro-KLK4 (peptidasa relacionada con la calicreína 4) para producir la serinproteasa KLK4 activa. También se demostró que la MMP-20 degrada E-cadherina, caseína y/o gelatina, agrecano, colágeno tipo IV, V, tenascina-C, laminina-1, laminina-5.⁶

La enamelisina o MMP-20 fue inicialmente clonada del órgano del esmalte de porcino, además por técnicas de hibridación in situ se ha demostrado que tanto los ameloblastos como odontoblastos presentan transcriptos de MMP-20.⁷ Asimismo, muy pocas líneas celulares expresan MMP-20, como el diente en desarrollo y el intestino grueso, pero no se halló expresión en tejidos como el intestino delgado, riñón, hígado, páncreas, cerebro, pulmón, bazo o estómago.⁸ Esta MMP fue localizada en algunas condiciones patológicas como en quistes odontogénicos calcificantes, tumores odontogénicos, células del carcinoma de lengua humana.^9)(10)(11 Por estas razones, es considerada una MMP específica del diente.

En las últimas décadas se ha destacado la importancia de la enamelisina en el desarrollo dentario, específicamente en la formación del esmalte, y cómo alteraciones en su expresión pueden llevar a la formación de patologías como la amelogénesis imperfecta.¹²⁾⁽¹³ Por tal motivo, el objetivo de esta revisión es clasificar los diferentes estudios y técnicas de laboratorio empleadas, que demuestren la participación de enamelisina en el desarrollo dentario y su relación con patologías en la formación del esmalte.

Modelos in vitro

En el 2009, Nagano y colaboradores,¹⁴ en un modelo in vitro, demostraron, por medio de la digestión de péptidos fluorescentes, que la MMP-20 es capaz de digerir secuencias de amelogenina en sitios específicos. Por otro lado, Klk4 (calicreína relacionada con peptidasa 4) tiene afinidad por sitios diferentes de escisión. Por lo tanto, en el diente en desarrollo del cerdo, la MMP-20 es la única que presenta actividad proteolítica en el espacio extracelular durante la fase secretora. Esto es confirmado por Chun y colaboradores,¹⁵ donde concluyen que MMP-20 pero no Klk4 cataliza las proteínas de esmalte procesadas durante la fase secretora de amelogénesis. También otros autores, como Sun y colaboradores,¹⁶ estudiaron MMP-20 y Klk4. Estos diseñaron una serie de experimentos in vitro que evaluaban sistemáticamente el efecto de la HAP (hidroxiapatita) en la rP172 (amelogenina porcina recombinante) por rPMMP-20 (Metaloproteinasa 20 recombinante de cerdo) y rP148 (amelogenina porcino recombinante que carece de los aminoácidos 24 C-terminales hidrófilos) por rhKLK4 (calicreína relacionada con peptidasa 4 recombinante humana). Encontraron que la actividad de rPMMP-20 contra la amelogenina porcina recombinante, fue más sensible a la presencia de cristales de hidroxiapatita comparados con la rhKLK4 contra la rP148, o rhKLK4 contra la rP172.

Esto sugiere que hay una íntima relación entre la degradación paso a paso de la amelogenina en presencia de HAP en el estadio temprano de mineralización del esmalte. De igual forma, en el 2013, Yamakoshi y colaboradores¹⁷ concluyeron que la MMP-20 activa la proKLK4, y KLK4 inactiva la MMP-20 in vitro, y estas acciones pueden suceder durante la amelogénesis in vivo.

Estos resultados son contrarios a los hallados por Takahashi y colaboradores¹⁸ en el 2012. Estos autores realizaron un modelo in vitro con cultivos celulares de explantes de tejidos del ligamento periodontal, conteniendo células epiteliales de Malassez y fibroblastos del ligamento periodontal de terceros molares de 28 individuos entre 21-28 años de edad, con el fin de determinar la expresión de amelogenina, MMP-20, (KLK4) y sus efectos en la interacción entre las células epiteliales de Malassez y fibroblastos del ligamento periodontal. Los resultados por inmunohistoquímica revelaron una expresión débil de amelogenina, ameloblastina, MMP-20 y KLK4 en las células epiteliales de Malassez. Esto puede deberse a que las funciones de estas proteínas de esmalte y sus proteasas, en la formación de las raíces dentales, se desconoce.

Por otro lado, Bromley y colaboradores¹⁹ estudiaron el crecimiento de los cristales de calicita en presencia de amelogenina de longitud completa y su proteólisis por una metaloproteinasa de matriz recombinante (rhMMP-20). La amelogenina recombinante porcina (rP172) altera la forma de los cristales de calcita por inhibición del crecimiento de los pasos en las caras que se ocluyen dentro de los cristales. Estos autores encontraron que, en muestras con rP172-rhMMP-20, la oclusión de la amelogenina en los cristales de calcita disminuyó drásticamente. La reducción del extremo C-terminal disminuyó la afinidad de la amelogenina a los cristales y, por lo tanto, previó la oclusión, tal como fue hallado en los estudios de Uskokovic y colaboradores,²⁰ donde, en un modelo in vitro, determinaron la capacidad de la amelogenina de promover la nucleación y el crecimiento de los cristales.

Para el proceso de mineralización y formación del esmalte maduro, Khan y colaboradores²¹ estudiaron la proteólisis de la cinética de enzimas de MMP-20 de longitud completa amelogenina recombinante humana bajo diferentes composiciones minerales. Hallaron que la MMP-20 fue más eficiente en altas concentraciones de calcio, mientras que fue más bajo en altas concentraciones de fosfato y altas concentraciones de calcio y fosfato. Estos estudios in vitro demuestran que la química de las soluciones proteínicas pueden alterar significativamente el tratamiento de amelogenina por MMP-20, que puede tener efectos significativos en el ensamblaje de la matriz in vivo y, posteriormente, en la mineralización de fosfato de calcio.

Cultivos celulares

En el 2010, Lee y colaboradores²² estudiaron los mecanismos moleculares responsables de la regulación de la MMP-20, encontrando que la fase secretora de la amelogénesis ODAM (proteína asociada a ameloblastos odontogénicos) se localizó en el núcleo y citoplasma de los ameloblastos, y la etapa de maduración se observó en el citoplasma y en la interfaz entre los ameloblastos y la capa de esmalte, pero no en el núcleo. Se sugiere que Runx2 regula la expresión de ODAM nuclear que tiene una función reguladora importante en la mineralización del esmalte a través de la regulación de la MMP-20. Estos resultados son confirmados nuevamente en el 2012 por Lee y colaboradores.²³ Estos autores investigaron la expresión de ODAM en ameloblastos, odontoblastos y varios tipos de células cancerígenas, y encontraron que ODAM se localizó en estas células tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el patrón de expresión y la localización subcelular de ODAM es altamente variable y dependiente de los tipos celulares, sus estados de diferenciación y las correlaciones funcionales existentes entre ODAM y MMP-20.

Por otro lado, Gao y colaboradores²⁴ exploraron el rol del factor-2C potenciador de miocito (MEF2C) y el factor de crecimiento transformante beta (TGFΒ1) en la expresión genética de MMP-20. Estos autores concluyeron que el TGFΒ1 induce la expresión de MMP-20 en ALCs (Línea celular de ameloblastos).

Estudios en animales

Con relación a los estudios realizados en modelos murinos, Yamakoshi y colaboradores²⁵ caracterizaron ratones knockout para MMP-20 y KLK4, y doble nulo de MMP- 20/KLKL-4. Estudiaron las fases secretoras y de maduración por medio de histología, zimografía y Western blot. Solo se encontraron amelogeninas y ameloblastinas intactas en la fase secretoria en el ratón knockout para MMP-20, mientras que en la matriz perteneciente a la fase secretoria para el ratón nulo de KLK-4 fue idéntico a lo encontrado en el ratón silvestre.

Más residuos en la matriz se observaron en el ratón doble nulo comparado con los ratones knockout de MMP-20 o KLK-4. Esto lo corroboraron Bartlett y colaboradores²⁶ y Shin y colaboradores27 donde, con un modelo de ratón knockout para MMP-20, demostraron la importancia de MMP-20 como mediador necesario para el mantenimiento de la superficie de esmalte, una unión amelo-dentinal fuerte y para el establecimiento del patrón de varillas de esmalte. Estos resultados validan lo encontrado en modelos in vitro por Nagano y colaboradores¹⁴ y Chun y colaboradores¹⁵.

Estudios en humanos

Con relación a los estudios en humanos, estos mencionan la importancia que tiene la MMP-20 en la caries dental, el grosor del esmalte y la susceptibilidad a caries por radiación y agenesias dentales.

En primer lugar, Shimada y colaboradores²⁸ estudiaron, por inmunomarcación enzimática, la participación de MMP-2,-8,-9 y 20 en lesiones de caries dentinal en terceros molares humanos de pacientes entre 32-59 años, y hallaron que la MMP-2 estaba distribuida en la dentina normal y la dentina cariada, los niveles de MMP-8 y MMP-9 estaban significativamente disminuidos en la caries dentinal interna comparada con la dentina normal y la MMP-20 era la más alta en la dentina normal, y decreció significativamente hacia la región externa de caries.

Por otro lado, Tannure y colaboradores²⁹ evaluaron la asociación entre MMP-20 y la experiencia de caries en los niños brasileros. De 388 sujetos, 161 fueron niños libres de caries. Estos autores no encontraron diferencias entre los niveles de caries y la distribución genotípica en la cohorte total. Sin embargo, hubo diferencias en la distribución genotípica, observadas en los niños libres de caries vs. niños con caries en caucásicos (p=0,03). Estos resultados sugieren que el desarrollo de la caries es multifactorial y puede estar asociado a genotipos de MMP-20 en mayor proporción en individuos caucásicos con pobres hábitos de higiene oral.

En el 2014, McGuire y colaboradores,³⁰ por técnicas de espectrometría de masa, inmunomarcaje y zimografía en gel, estudiaron dientes de pacientes con cáncer oral tratados con radioterapia, y se compararon con dientes de individuos sanos. Concluyeron que la MMP-20 es la metaloproteinasa de matriz más abundante en extractos in vitro irradiados e incubados de las coronas dentales maduras, como con las coronas control. En los estudios in vitro encontraron que el fragmento de 23 kDa de MMP-20 es resistente a la radiación de las coronas dentales maduras, lo que indica que este componente puede degradar los componentes proteicos de la interfase esmalte-dentina y contribuir así a la delaminación patológica del esmalte observado en la radioterapia oral, lo cual también se asocia a las dosis altas de radioterapia.

En el mismo año, Horvath y colaboradores³¹ encontraron una fuerte evidencia para selección positiva en las regiones 5’ y 3’ de las regiones de MMP-20 y ENAM, a lo largo del linaje de los humanos, y en ambos el extremo 5’ y 3’ de las regiones de MMP-20 a lo largo del linaje que lidera a los chimpancés. Cambios no codificantes y su potencial para la regulación diferencial por factores de transcripción conocidos regulan el desarrollo del diente y pueden ofrecer una visión a los mecanismos que permiten cambios evolutivos rápidos en el grosor del esmalte entre especies relacionadas cercanamente.

Por otro lado, Kuchler y colaboradores ³² estudiaron la asociación de MMP-1, MMP-3 y MMP-20, y su relación con agenesias dentales en 167 familias nucleares de dos poblaciones diferentes, 116 de Brasil y 51 de Turquía. Los participantes tenían al menos un diente ausente. Estos autores encontraron asociaciones entre la agenesias dentales, MMP-1 (p= 0,007) y MMP-20 (p= 0,03) en las familias brasileras. Estos resultados son contrarios a los reportado por Antunes y colaboradores,33 en donde estudiaron la asociación de polimorfismos en genes para MMP-2, MMP-9 y MMP-13 en humanos con agenesias dentales, en 285 individuos no relacionados (202 controles sin agenesia dental y 83 casos con agenesia dental), donde no encontraron asociación significativa para el genotipo MMP-2, y encontraron una relación significativa de agenesias dentales asociadas a los genotipos de MMP-9 y MMP-13.