Amelogénesis y biomineralización del esmalte

El esmalte es una biocerámica nanocompuesta,¹¹ con un 95% de material inorgánico, 4% de agua y 1% de materia orgánica.^12,13 Para la formación del esmalte son necesarios cuatro elementos: células, iones, proteínas y un compartimento en el que se lleva a cabo la reacción de mineralización (matriz extracelular).¹² El proceso de formación del esmalte se denomina en conjunto amelogénesis, mientras que el proceso de mineralización como tal, que se da entre iones y proteínas secretadas por las células, se denomina biomineralización. Las células formadoras de esmalte se denominan ameloblastos, y durante el proceso atraviesan una serie de cambios resumidos en las siguientes etapas: diferenciación, secreción, maduración y transición.¹⁴ En la etapa de secreción de los ameloblastos, estos transportan iones desde el plasma hacia el interior de la célula: el tipo de ion que ingrese dependerá, entre otros factores, de su disponibilidad en ese momento en el plasma.¹⁵ Es por este motivo que el mineral del esmalte (que es semejante al mineral puro hidroxiapatita) contiene usualmente una variedad de iones en su.estructura, como HPO₄2-, CO₃2-, Na+ y F-16

Además de transportar y secretar iones, los ameloblastos sintetizan y secretan una gran cantidad de proteínas, que son el componente mayoritario del esmalte en formación (> 90%).(17) Dentro de las proteínas secretadas están, en primer lugar, las de la matriz extracelular (amelogenina, ameloblastina y enamelina) y en segundo lugar las proteasas: metaloproteinasa de matriz 20 (MMP-20) y calicreína 4 (KLK-4). La enamelina y la ameloblastina funcionan como nucleadores, atrayendo iones a su estructura proteica para favorecer el depósito organizado de las sales de fosfato de calcio en forma de cristales.¹⁸

Por otro lado, la amelogenina asume una organización supramolecular superior (nanoesferas de 20 nm) y funciona como un “andamio” que direcciona el crecimiento de los cristales para la formación de prismas.¹⁹ El papel de la ameloblastina es menos claro, pero se ha encontrado que tiene funciones en la adhesión y el control de la diferenciación de los ameloblastos.²⁰ La MMP-20 degrada paulatinamente y de forma selectiva el soporte proteico durante las etapas de secreción y maduración, para permitir el ensanchamiento de los cristales de esmalte que previamente crecieron en longitud.²¹ En el inicio de la etapa de maduración, las células dejan de producir MMP-20 y comienzan a producir KLK-4, la proteasa que finaliza el proceso de degradación del material proteico del esmalte.²² La KLK-4 corta los restos de las proteínas estructurales en péptidos pequeños que pueden procesarse en la célula.²³ Al final de este proceso ordenado de la etapa de maduración, el componente proteico será menor al 1%11 y el esmalte resultante tendrá una porosidad mínima y una apariencia clínica traslúcida, brillante y lisa al tacto.

De la mano de la evidencia sobre los mecanismos normales de formación del esmalte (resumida anteriormente), se han desarrollado estudios de inducción de fluorosis para comprender qué etapas del proceso se ven afectadas por el fluoruro, como se describirá a continuación.

¿Qué concentraciones de fluoruro se utilizan en experimentos in vivo e in vitro para la inducción de fluorosis dental?

A pesar de la existencia de modelos estandarizados (descritos más adelante), no existe consenso en cuanto a la concentración de F- biológicamente relevante para la inducción de fluorosis dental tanto en estudios in vivo como in vitro. Por un lado, una línea de evidencia utiliza en sus estudios concentraciones de F- del orden micromolar (µM) y considera biológicamente relevantes las concentraciones de 2-12 µmol/L.^24,25,26,27 Otra línea de evidencia argumenta que, en condiciones normales, existen niveles basales de F- en el fluido del esmalte que se elevan proporcionalmente al aumento de la concentración de F- en plasma y exponen a los ameloblastos a concentraciones milimolares (mM) de F-.²⁸ Las dificultades en el consenso y la relación directamente proporcional entre la dosis de F- y las respuestas celulares hacen necesario que los efectos reportados para el F- se examinen siempre acompañados de la concentración utilizada en los experimentos.

Modelos in vivo e in vitro estandarizados para el estudio de la fluorosis dental

Se han establecido dos modelos in vitro: el primero consiste en una línea de células inmortalizadas, similares a ameloblastos, derivadas del órgano del esmalte del primer molar de ratones Swiss-Webster recién nacidos. Esta línea se obtuvo con la transfección de células del epitelio del órgano del esmalte con el oncogen del virus SV40 y se denomina LS8.²⁹ El segundo modelo consiste en cultivos primarios estandarizados de células del epitelio del órgano del esmalte de fetos humanos de 21 semanas.³⁰ Este último representa el modelo in vitro ideal para el estudio de fluorosis, por provenir de células humanas y expresar mayor número de marcadores que la línea de ratón; sin embargo, la obtención de las muestras tiene implicaciones éticas y dificultades técnicas que hacen que el modelo de células LS8 sea el más conveniente y de mayor uso.

En cuanto a los modelos in vivo, se han empleado mamíferos como ratas,³¹ ratones,³² hamsters,³³ conejos³⁴ y especies mayores, como cerdos³⁵ y ovejas.³⁶ El modelo de rata ha demostrado ser el más apropiado para el estudio de la fluorosis dental,³¹ dado que los incisivos de los roedores erupcionan de forma continua, y en un solo diente se pueden apreciar las diferentes etapas del desarrollo del esmalte; además, existe evidencia de que en humanos y otros animales, los niveles de F- en plasma requeridos para la aparición de defectos fluoróticos en esmalte son muy similares.^25,31,37,38

A nivel molecular, la fluorosis dental es consecuencia del retraso en la remoción de las proteínas de la matriz extracelular, principalmente durante la fase de maduración del esmalte.

La inducción de fluorosis en modelos celulares y animales ha permitido determinar en qué medida el F- que circula en el plasma en concentraciones excesivas durante la amelogénesis tiene efectos deletéreos sobre las diferentes etapas, incluyendo la etapa de secreción.³⁹ En esta etapa se ha reportado que el fluoruro induce alteraciones en el transporte vesicular de los ameloblastos⁴⁰ y en la degradación intracelular de proteínas de la matriz por parte del sistema lisosomal.^41,42 Sin embargo, los estudios experimentales de fluorosis se han enfocado específicamente en la etapa de maduración del esmalte (cuando suceden la secuencia ordenada de crecimiento cristalino, la digestión proteolítica por enzimas diferentes y la absorción de los residuos proteicos), pues ha demostrado ser la más sensible a los efectos negativos del F-. Esto se fundamenta en estudios in vivo realizados en ratas, en la cuales se demostró que el consumo de altas cantidades de F- retrasa la eliminación de las proteínas (especialmente de amelogeninas).^24,25 La capacidad disminuida para la eliminación de amelogeninas desencadenada por el F- impide el engrosamiento de los cristales de esmalte y lleva a que la mineralización se dé de forma incompleta.⁴³

En la misma etapa de maduración, en la que los ameloblastos regulan el pH con la secreción de bicarbonato y el uso de transportadores iónicos para absorber protones de la matriz,⁴⁴ la gran cantidad de protones (H+) liberados como consecuencia de la alta tasa de precipitación de cristales de esmalte genera fluctuaciones de pH (de neutro a ácido),⁴⁵ y la presencia de altas concentraciones de F- en un ambiente ácido tiene efectos deletéreos, como presentaremos más adelante en esta revisión. Aunque el efecto del F- sobre la maduración es crítico, su efecto nocivo sobre las demás etapas tampoco es despreciable y podría ser acumulativo, si tenemos en cuenta que la severidad de la fluorosis responde a una exposición sostenida y prolongada.⁴³

Efectos del fluoruro sobre la fisiología de los ameloblastos

Se ha registrado que a una concentración de 10 µM de F- ocurre una disminución en la expresión de MMP-20,^46,47 a concentraciones de entre 10 y 20 µM F- se da un aumento de la apoptosis, y a concentraciones mayores a 1 mM se presenta una alteración de la proliferación celular.⁴⁷ Además, concentraciones de 120 µM de F- reducen la expresión de mensajeros de amelogenina, ameloblastina, enamelina y MMP-20, así como factores de vascularización como el factor de crecimiento endotelial (VEGF), las proteínas quimio-atrayentes de monocitos (MCP-1) y la proteína inducible por interferón (IP-10).⁴⁸

La regulación del pH es fundamental para el crecimiento cristalino: la precipitación de los iones durante la maduración del esmalte libera gran cantidad de protones (H+), después de lo cual sigue la reacción [10Ca2+ + 6HPO₄2+ 2H₂O Ca₁₀ (PO₄)6(OH)₂ + 8H+], y el pH de la matriz extracelular pasa de neutro a levemente ácido.⁴⁵ Estos cambios de pH se ven reflejados en la alteración de la morfología de estas células, que se observan de extremos rugosos ante un pH ácido y de extremos lisos ante un pH neutro. En el desarrollo normal del esmalte se presenta una alternancia de estas morfologías; sin embargo, en estudios in vitro se ha observado que la modulación entre la morfología lisa y rugosa se retarda, con predominio de la rugosa.⁴⁷ Por lo tanto, como consecuencia de la presencia de fluoruro, el pH de la matriz extracelular permanece ácido por un tiempo prolongado.

De la exposición de células LS8 a concentraciones de 250-2000 µM de F- se han desprendido observaciones interesantes: el aumento en la concentración de protones (H+), en presencia de una alta concentración de iones F-, conduce a la formación del ácido fluorhídrico (HF), que es absorbido por las células y causa cambios severos en el metabolismo celular.⁴⁹ Estos hallazgos sugieren una hipótesis interesante: el exceso de F- citoplasmático en el ameloblasto induce estrés en el retículo endoplásmico y la activación de un mecanismo de defensa llamado “respuesta a proteínas mal plegadas” (UPR, unfolded protein response), que tiene como consecuencia la disminución de la síntesis y secreción de KLK-4, indispensable para la eliminación de la matriz proteica de amelogenina y la maduración final de los prismas del esmalte.^50,51,52

Cuando el F- atraviesa la membrana citoplasmática hacia el frente de mineralización, se registra otra cadena de efectos, demostrada por estudios in vitro recientes, que describen que la llegada masiva de F- al frente de mineralización genera una capa hipermineralizada de esmalte que se podría comportar como una barrera física que impediría la difusión de iones y proteínas a la subsuperficie del frente de mineralización.⁵³ Este evento molecular podría dificultar el ingreso de la “materia prima” necesaria para la mineralización completa de los cristales y, de esta manera, contribuir a la hipomineralización del esmalte fluorótico.

Efectos del fluoruro sobre la actividad de las proteasas de la matriz extracelular

Se conoce que el F- es un inhibidor de la actividad de las proteasas de la matriz extracelular del esmalte. Aunque el número de estudios es limitado, los resultados no han podido demostrar una inhibición directa de la actividad enzimática,^54,55,56 por lo que hasta ahora se descarta al F- como inhibidor de proteasas dentro de la patogénesis de la fluorosis.

Efectos del fluoruro sobre la cinética de la biomineralización

La incorporación de F- a los cristales de esmalte durante su formación aumenta la fuerza de unión de la amelogenina al cristal ⁵⁷ y disminuye su tasa de hidrólisis.⁵⁸ Esta evidencia se ha recogido en ensayos con amelogenina recombinante unida a hidroxiapatita sintética con concentraciones de F- similares a las encontradas en dientes humanos con fluorosis. Es posible que la unión de las proteínas a cristales con alto contenido de F- desencadene cambios en su conformación, “ocultando” algunos sitios de corte y disminuyendo el acceso de las proteasas,⁵⁷ disminuyendo la velocidad de remoción de las proteínas de la matriz e impidiendo el engrosamiento y la maduración del cristal. Estos estudios proporcionan evidencia suficiente para sugerir que la fluorosis dental es consecuencia del retraso en la remoción de proteínas durante la etapa de maduración del esmalte. Además, sería posible que las proteínas se retengan en el esmalte erupcionado.

Siguiendo la lógica anterior, se han realizado estudios sobre la retención de amelogenina en el esmalte erupcionado con fluorosis.^58,59 El bajo contenido proteico del esmalte erupcionado (<1% en el esmalte sano), y las dificultades para la extracción de proteínas atrapadas en la matriz mineral, han limitado los estudios orientados a extraer, identificar y cuantificar el material proteico del esmalte.

Con el fin de ampliar el estudio de la fluorosis dental en Colombia, en la Unidad de Investigación en Caries (UNICA) estandarizamos un método para la extracción e identificación de proteínas del esmalte a través de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, el cual se aplicó a una muestra de dientes de pacientes colombianos.⁶⁰ Usando este método, comparamos las proteínas identificadas en el esmalte erupcionado de dientes sanos y con fluorosis. Con nuestro análisis encontramos amelogenina, ameloblastina y enamelina; esta última con mayor frecuencia en el esmalte fluorótico, lo cual sugiere un posible papel de esta proteína en los eventos que desencadenan la fluorosis. Además, mediante la cuantificación relativa de los péptidos identificados de amelogenina, no encontramos diferencias en el contenido proteico entre el esmalte sano y con fluorosis.¹¹ Los reportes existentes sobre este tema son contradictorios,^58,59,61 y a la fecha no podemos hablar de una retención de proteínas en el esmalte fluorótico, sino de una alteración en la velocidad de remoción de las mismas, que retrasa el proceso de maduración del cristal de esmalte.⁴³

En la figura 1 se resume la evidencia disponible sobre los mecanismos bioquímicos y celulares reportados a la fecha, posiblemente relacionados con la patogénesis de la fluorosis dental.

Figura 1 Posibles mecanismos bioquímicos y celulares involucrados en la patogénesis de la fluorosis dental, tanto a nivel intracelular como de la matriz extracelular