Aislamiento e identificación de la flora bacteriana uterina en vacas donantes de embriones

Isolating and identifying uterine bacterial flora in embryo-donor cows

Isolamento e identificação da flora bacteriana uterina em vacas doadoras de embriões

Diana C. Méndez-Leal¹
Agustín Góngora-Orjuela²
Luz A. Gómez-Leal³

1 Microbióloga Agrícola y Veterinaria. Ejercicio particular. Email: agongora@unillanos.edu.co.
2 MV, MSc, Dr Sci. Grupo de investigación en Reproducción y Genética Animal (GIRGA) Escuela de MVZ Universidad de los Llanos.
3 Bacterióloga. Escuela de MVZ Universidad de los Llanos.

Recibido: Julio 19 de 2013. Aceptado: Marzo 27 de 2014

Resumen

Se aisló e identificó la flora bacteriana en 21 vacas donantes de embriones a partir del lavado uterino al momento de recolección de los embriones al día 7 posinseminación. La identificación bacteriana se realizó por métodos convencionales basados en las características fenotípicas, morfología, desarrollo, pruebas bioquímicas y metabólicas. Las bacterias identificadas fueron Proteus mirabilis 4.8%, Archanobacterium pyogenes 4.8%, Klebsiella ozaenae 9.5%, E. coli 14.2% Shiguella sonnei 23.8%, Bacilus spp 33.3%, Pseudomona aeruginosa 52.3% y Sthaphylococcus spp. 47.6%. En 28.6% de las vacas se identificó solo una bacteria, 52.4% dos bacterias y 19% tres o más bacterias. La alta diversidad bacteriana sugiere diversos orígenes y nuevos estudios sobre su papel individual o sinergismo en el desarrollo de la enfermedad uterina y posibles efectos sobre la respuesta superovulatoria.

Palabras clave: infección uterina, bacterias, transferencia de embriones (DeCs).

Abstract

Bacterial flora were isolated and identified in 21 embryo-donor cows from uterine washing when collecting embryos on day 7 post-insemination. Bacteria were identified by conventional methods based on phonotypical and morphological characteristics, development and biochemical and metabolic tests. The bacteria identified were Proteus mirabilis (4.8%), Archanobacterium pyogenes (4.8%), Klebsiella ozaenae (9.5%), E. coli (14.2%), Shiguella sonnei (23.8%), Bacilus spp. (33.3%), Pseudomona aeruginosa (52.3%) and Sthaphylococcus spp. (47.6%). A single bacterium was identified in 28.6% of the cows, two bacteria in 52.4% of the cows and three or more bacteria in 19% of them. The high bacterial diversity suggested various origins; new studies into their individual role and/or synergism regarding the development of uterine disease and possible effects on superovulatory response are needed.

Key words: Uterine infection, bacteria, embryo transfer (DeCs).

Resumo

Foi isolada e identificada a flora bacteriana em 21 vacas doadoras de embriões, a través de lavagem uterina, no dia 7 após a inseminação ao momento da colheita dos embriões. Identificação bacteriana foi realizada por métodos convencionais baseados em características fenotípicas, morfologia, desenvolvimento, testes bioquímicos e metabólicos. As bactérias identificadas foram Proteus mirabilis 4.8%, Archanobacterium pyogenes 4.8%, Klebsiella ozaenae 9.5%, E. coli 14.2% Shiguella sonnei 23.8%, Bacilus spp 33.3%, Pseudomona aeruginosa 52.3% e Sthaphylococcus spp. 47.6%. Em 28,6% das vacas foi identificada apenas uma bactéria, duas bactérias em 52,4% e 19%, três ou mais bactérias. Diversidade bacteriana alta sugere diferentes origens e mais estudos sobre seu papel individual ou sinérgica no desenvolvimento de doenças uterinas e os possíveis efeitos sobre a resposta superovulatória.

Palavras chave: Infecao Uterina, Bacterias, Transferencia De Embriones (Decs).

Introducción

Desde la aplicación con fines comerciales en la década de los años 70 del siglo pasado, la transferencia de embriones (TE) ha tenido un amplio uso. De acuerdo con las estadísticas de la Sociedad Internacional de Transferencia de embriones (IETS) en el año 2007 se transfirieron 1.198.078 embriones (Thibier, 2008), a la fecha aunque no se tienen cifras actualizadas, se cree que este número ha aumentado significativamente, especialmente por la mayor demanda en los países de Suramérica.

Durante los últimos 40 años ha sido inmenso el progreso de la TE, debido en parte al diseño de mejores protocolos de superovulación, recolección de los embriones y crioconservación, aunque el número promedio de embriones obtenidos no ha cambiado (Hasler, 2014).

En el éxito de un programa de TE, mediante estimulación ovárica in vivo intervienen diversos factores, encontrando notables diferencias en las tasas de preñez, ya sea si los embriones son producido "in vivo" o "in vitro" (Wu y Zan, 2012). Dentro de los factores mencionados, el estado fisiológico y sanitario de la donante cobra importancia, por lo que desde el inicio de la aplicación de la técnica surgieron interrogantes sobre la posible trasmisión de agentes patógenos a la receptora, estudios que concluyeron finalmente que el riesgo es mínimo si se siguen las recomendaciones de la IETS (Stringfellow, 1998; Stringfellow et al., 2004; Mapletoft y Hasler, 2005), este riesgo es menor aun si se compara con el semen o la movilización de animales vivos entre países (Wrathall, 1995; Givens y Marley, 2005).

De otro lado, se conoce que las infecciones uterinas en las vacas ocasionan daño en el endometrio y alteran la funcionalidad del ovario. Sheldon et al (2002) reportan que la contaminación bacteriana posparto tiene efectos sobre el crecimiento y el desarrollo folicular pero no sobre la emergencia folicular. Además, en las vacas que sufren infecciones uterinas, se produce un cambio en la producción de prostaglandina E₂ en vez de prostaglandina F₂, lo que ocasiona fases luteales prolongadas (Williams et al. 2008b; Herath et al.2009a), todo lo anterior podría afectar la respuesta superovulatoria.

Las infecciones uterinas pueden afectar la respuesta superovulatoria en función del tiempo que lleven de transcurrido el posparto. Después del parto, el útero sufre una recuperación espontanea en su estado inmunológico que le permite la eliminación progresiva de bacterias durante las primeras 5 semanas posparto, sin embargo la eliminación de estas bacterias no es total y entre el 10-17% de los animales persisten infecciones bacterianas subclínicas (Borsberry y Dobson, 1989; LeBlanc et al., 2002).

Las bacterias más comúnmente aisladas del útero dentro de los primeros 10 días posparto fueron Streptococcus spp., Staphylococcus spp. y Bacillus spp. (Williams et al., 2005), mientras que Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum), Prevotella melaninogenicus (P. melaninogenicus) y Escherichia coli (E. coli) fueron aisladas de vacas con metritis (Bonnett et al., 1991; Bondurant 1999; Huszenicza et al., 1999; Gilbert et al., 2007).

Las bacterias aeróbicas y anaeróbicas del útero y su potencial patógeno se han clasificado en tres tipos i) bacterias patógenas A. pyogenes, E. coli, P. melaninogenicus y F. necrophorum, ii) bacterias potencialmente patógenas: Enterococcus faecalis, Bacillus licheniformis, M. haemolytica, Pasteurella multocida, Peptostreptococcus species, Staphylococcus aureus, Non-haemolytic Streptococci y iii) bacterias no patógenas: Clostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus species, Providencia stuartii, Proteus species, Staphylococcus species, coagulase negative, Non-haemolytic Streptococci, Streptococcus acidominimus, Aspergillus species (Williams et al., 2005).

El objetivo de este estudio, fue aislar e identificar la microflora uterina de vacas donantes de embriones como un paso previo para posteriores estudios que permitan entender su ecología, la relación con los trastornos reproductivos y la orientación de los tratamientos terapéuticos, todo esto en la búsqueda de una mayor eficiencia de la técnica de TE.

Materiales y métodos

Animales experimentales

Se utilizaron 21 vacas donantes de embriones entre 2-6 partos de las razas Sanmartinero, Jersey, Gyr y Brahman ubicadas en 6 fincas que desarrollaban programas de TE de los municipios de Villavicencio, Cumaral y Paratebueno.

Toma de muestras para cultivo e identificación bacteriana

Las muestras para cultivo se obtuvieron mediante pipetas Pauster estériles directamente del filtro Millipore de 0.45μ utilizado para la recolección de los embriones el día 7 posinseminación. Para el lavado uterino se utilizó 500 ml de Ringer lactato^® que fue infundido mediante un catéter folley^® de 3 vías. Aproximadamente 5.0 ml de la muestra fueron puestos en tubos tapa rosca de 10 ml conteniendo el medio BHI y transportados en cadena de frio a 4°C hasta el Laboratorio de microbiología de la Universidad de los Llanos. Los tubos fueron llevados a incubación por 24 horas a 37°C, tiempo en el que se observó la presencia de turbidez de las muestras, la cual fue considerada como criterio de crecimiento bacteriano. De cada muestra se realizó una coloración de Gram y las muestras Gram+ se sembraron por agotamiento en agar sangre (Oxoid^®).

Las muestras Gram- se sembraron en agar McConkey y posteriormente en medios selectivos SS, XLD, Agar bismuto de acuerdo a la técnica de (Bergey, 1994). Aquellas muestras que presentaron crecimiento en los medios diferenciales y selectivos se realizaron pruebas de identificación bioquímica como TSI, Simonds citrato, SIM, urea, MRVP, gelatina, nitratos y los azucares manosa, galactosa, arabinosa, manitol, sorbitol. Los cultivos con cocos Gram+ se realizaron pruebas de oxidasa y coagulasa.

Análisis estadístico

Se creó una base de datos en Excel y analizada la información mediante estadística descriptiva.

Resultados

La microflora bacteriana encontrada en las vacas objeto de la presente investigación fueron en orden de mayor a menor Pseudomona aeruginosa 52.4% (11/21), Staphylococus spp 47.6% (9/21), Bacillus spp. 33.3% (7/21), Shigella sonnei 23.9% (5/21), E. coli 14.2% (3/21), Klebsiella ozaenae. 9.52% (2/21), Proteus mirabilis 4.8% (2/21), Archanobacteriun spp. 4.8% (1/21). En la figura 1 se observa el porcentaje de vacas en las cuales fue aislada una, dos o tres o más bacterias del útero de las vacas donantes de embriones.

Discusión

La presencia de un alto número de bacterias aisladas en los lavados uterinos de vacas donantes de embriones en este estudio, sugiere diversas lecturas, entre ellas la procedencia de las mismas. Es posible que algunas de ellas provengan de infecciones persistentes asociadas al último parto y que no fueron eliminadas dentro del proceso normal de desinfección del útero por parte del sistema inmunológico local. El endometrio se convierte en la primera barrera física contra las infecciones uterinas, además cumple un importante papel en la inmunidad innata, así en el útero los polimorfonucleares reconocen los agentes patógenos mediante los receptores Toll, adicionalmente las células endometriales responde a los lipopolisacáridos (LPS) de algunas de las bacterias vía los receptores Toll 4 (TLR4) lo que desencadena una cascada de citoquinas y quimoquinas, por tanto, cuando se afectan estos mecanismos se presenta la enfermedad uterina (Williams, 2013).

Las diferentes bacterias, igualmente podrían provenir del semen, a pesar que durante el proceso de producción se adicionan antibióticos de amplio espectro, estos no eliminan la totalidad de las bacterias, las cuales pueden aparecer en los lavados uterinos. Esta posibilidad es mayor cuando se inseminan las vacas dos veces, buscando una mayor producción de embriones, como fue el procedimiento utilizado en este estudio. Algunas de las bacterias encontrados en nuestro estudio, coinciden con las aisladas del semen del toro entre ellas P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Proteus spp., and Bacillus Spp (Strigelow y Givens, 2000).

Aunque en el proceso de obtención de los embriones se siguieron todos los protocolos de limpieza y desinfección recomendados por la IETS, es posible que otra fuente de infección bacteriana proviniera entre otros, de la contaminación ambiental durante el proceso del lavado uterino, los componentes de los medios de cultivo y de fuentes humanas, como ha sido sugerido por Stringfellow y Givens (2000).

Respecto a las bacterias encontradas, en 3 vacas se aisló E. coli, mientras en solo una A. pyogenes, esto merece un análisis especial, puesto que se ha visto que E. coli puede aumentar la susceptibilidad del endometrio para una posterior infección por A. pyogenes (Gilbert et al. 2007; Williams et al., 2007), a la vez A. pyogenes (recientemente reclasificado como (Trueperella pyogenes) (Yassin et al., 2011), puede actuar sinérgicamente con F. necrophorum y P. melaninogenecus aumentando la severidad de la enfermedad uterina (Ruder et al., 1981; Bonnett et al. 1991). La especie de E. coli que ocasiona enfermedad uterina es diferente de la E. coli patogénica extra intestinal, por lo que se le dio el nombre de E. coli patogénica endometrial (EnPEC), esta se adhiere más fácilmente a las células endometriales y estimula una mayor producción de Prostaglandina E₂ y Interleukina 8 que es el factor quimotáctico para los neutrófilos (Sheldon et al., 2010).

Respecto a T. pyogenes, ésta produce la citotoxina pyolisina que es dependiente de colesterol (Miller et al., 2007) y un factor de crecimiento para F. necrophorum (Sheldon y Dobson 2004), aumentando así los efectos patógenos.

Adicionalmente se conoce que ciertos productos bacteriales o sustancias derivadas del proceso inflamatorio del útero pueden afectar el crecimiento folicular y finalmente suprimir la ovulación (Peter y Bosu, 1988; Peter et al., 1989).

Recientemente se comparó el proteoma uterino de vacas infectadas con T. pyogenes y el de vacas sanas, encontrando un aumento en la expresión de ciertas proteínas indicadoras que esta bacteria puede afectar la habilidad de las vacas para concebir (Legard et al., 2013).

En vacas de leche con trastornos reproductivos la flora bacterial normal fue Lactobacillus sp (16.6%), Klebsiella sp (16.6%) y bacterias patógenas como Streptococcus sp. β hemolítico (33.3%), Streptococcus sp α hemolítico (50%) Streptococcus sp. y hemolítico (50%) y A. pyogenes (16.6%) (Sánchez et al., 2011).

En otro estudio en vacas Holstein mediante la detección de polimorfismos de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP), la composición bacteriana uterina presentó diferencias de acuerdo con los días posteriores al parto y diferencias entre los hatos (Elkjær et al., 2013).

Un hallazgo importante de las infecciones bacterianas es su relación con el estado endocrino del animal, así bajo el predominio de la progesterona se suprime los mecanismos de defensa uterina, por lo tanto la formación del primer cuerpo lúteo después del parto y la secreción de progesterona anteceden la presencia de enfermedad uterina (Lewis 1997; 2004). Es necesario aclarar que en el presente estudio, se evidenció la presencia de infección uterina, más no la presencia de enfermedad uterina la cual no estaba dentro de los propósitos del mismo.

Dado que la composición de la microbiota uterina y sus efectos sobre los desórdenes reproductivos ha sido poco estudiada y entendida (Santos y Bilcalho, 2012) un primer paso es la identificación bacteriana, lo cual coincide con los propósitos de este estudio. Además permitiría avanzar en el conocimiento de los complicados mecanismos que afectan la fisiología reproductiva y el sinergismo patológico entre la gran diversidad bacteriana encontrada.

De otro lado, se considera que la presencia de bacterias en útero no tendría mayor riesgo de trasmisión a las receptoras si se siguen los procedimientos recomendados por la IETS entre ellos el uso de antibióticos en los medios y el lavado de los embriones por lo menos 10 veces, lo que eliminaría la mayoría de bacterias que se pudieran adherir a la zona pelúcida (Stringfellow y Seidel, 1998).

Finalmente, en este estudio, se identificó una alta diversidad de bacterias en los lavados uterinos de vacas donantes de embriones, aunque solo dos de ellas E. coli y T. pyogenes han sido reportadas como patógenas, sin embargo el riesgo de trasmisión a las receptoras puede ser menor si se siguen las recomendaciones de la IETS. Un buen monitoreo del estado de salud general y uterina de las donantes podrían ofrecer mejores resultados de la TE, evitando de esta forma que las infecciones uterinas puedan afectar los mecanismos endocrinos y de paso la respuesta superovulatoria.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

Se expresan agradecimiento a los Doctores, Carlos J. Gómez y Miguel A. Peña por al apoyo en la obtención de las muestras.

Referencias

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