Introducción
En Colombia se ha generado un creciente interés por cultivar e investigar especies de peces del orden Siluriformes con potencial para la acuicultura. Sin embargo, la limitada e inestable producción de alevinos debido a la marcada estacionalidad reproductiva de las especies y por las altas tasas de canibalismo durante las primeras etapas de vida ha dificultado su producción a escala comercial. Al respecto, varios estudios han sido desarrollados principalmente en Pseudoplatystoma orinocoense, Leiarius marmoratus y Pseudoplatystoma metaense. L marmoratus (Gill, 1870) es una especie de gran importancia comercial para las cuencas de los ríos Orinoco y Amazonas. En condiciones de cautiverio, reporta buen crecimiento en los primeros estadios de vida (Cruz-Casallas et al., 2008), un significativo desempeño productivo de su cultivo en estanques en tierra (Cruz-Casallas et al., 2010), así como un filete de excelente calidad nutricional (Cruz-Casallas et al., 2014), lo anterior atribuido a el hábito alimenticio omnívoro (Santos et al., 2006), que diferencia esta especie de la mayoría de bagres. Leiarius marmoratus es una alternativa para fortalecer la acuicultura nacional, no obstante, similar a otros silúridos presenta disfunciones reproductivas cuando es mantenido en cautiverio (Zohar y Mylonas, 2001).
En general, en la mayoría de especies de peces los machos se adaptan mejor que las hembras a las condiciones de cultivo a las que son sometidos, y son capaces de producir gametos viables (Araujo et al., 2014), no obstante, es necesario administrar hormonas exógenas para inducir la espermiación final y aumento del volumen seminal. Los silúridos, en su mayoría responden positivamente a protocolos de inducción hormonal. Sin embargo, un escaso números de bagres como los Clarias gariepinus (Viveiros et al., 2002), Ictalurus furcatus (Gima et al., 2013), Pimelodus britskii (Damasceno et al., 2015), Leiarius marmoratus (Araújo et al., 2014) y Sorubim y lima (Shibatta et al., 2011) liberan mínimo volumen seminal mediante estrujamiento manual, comparado con el volumen obtenido directamente de los testículos. Varios factores han sido atribuidos como causa de este fenómeno. Según Damasceno et al., (2015), la morfología y ubicación anatómica de los testículos así como el protocolo de inducción hormonal y la fase de la estación reproductiva son determinantes en Pimelodus britskii. Desde otra perspectiva, Araújo et al., (2014), relaciona esta deficiencia en L. marmoratus con la falta de domesticación de los reproductores. Por consiguiente, es necesario realizar estudios específicos para cada especie.
Sustancias inductoras como Extracto de Hipófisis de Carpa (EHC) y análogos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH, LHRH, Ovaprim®) han dado resultados positivos en la inducción a la maduración final y ovulación de las especies nativas (Atencio, 2001). Sin embargo, el EHC presenta algunas desventajas, como su variabilidad en la cantidad y calidad de hormonas presentes y su alto costo en el comercio. En contraste la hormona liberadora de gonadotropina de salmón con un bloqueador de los receptores de D2 de dopamina, Ovaprim® presenta ventajas, como la no generación de respuesta inmunológica, induce la liberación de GtH endógeno desencadenando desde un nivel superior los procesos de maduración, ovulación, desove y espermiación.
En consecuencia, este trabajo se realizó con el fin de evaluar los efectos de cinco protocolos de inducción hormonal basados en Extracto de Hipófisis de Carpa (EHC), sGnRHa + domperidona (OVAPRIM®) y Gonadotropina Coriónica Humana (GCH), sobre la respuesta a la espermiación y la calidad seminal en yaque.
Materiales y métodos
Área de estudio
El estudio se llevó a cabo en el Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos, localizado a 4 km de la ciudad de Villavicencio, Colombia. La estación piscícola se encuentra a una altitud 418 m.s.n.m, presenta una pluviosidad de 4050 mm anuales, temperatura ambiental media de 25°C, temperatura promedio del agua de 27°C y humedad relativa del 75%.
Material biológico
Se utilizaron 18 machos adultos de 1,6 ± 0,1 kg de peso corporal y 54,4 ± 2,2 cm de longitud total. Los reproductores fueron alojados en estanques de tierra de 372 m2 a una densidad promedio de 240 g/m2, donde fueron alimentados con concentrado comercial del 25% de PB.
Los ejemplares fueron seleccionados teniendo en cuenta su desarrollo corporal y condición de madurez sexual, evidenciada por la emisión de un fluido transparente y oleoso a través de la papila urogenital ante presión cráneo-caudal del abdomen. Los reproductores seleccionados se trasladaron a piletas circulares de manejo de 7m3, donde permanecieron por lo menos 24 horas antes de iniciar el proceso de inducción y permanecieron allí hasta el final del experimento. Se registró el peso (kg), longitud total y la longitud estándar (cm) de cada individuo.
Inducción hormonal
De acuerdo a ensayos preliminares, fueron evaluados cinco tratamientos, utilizando Fertivet® - Gonadotropina Coriónica Humana (GCH), Extracto de Hipófisis de carpa (EHC) y una mezcla comercial de análogo superactivo de hormona liberadora de gonadotropina con un bloqueador de los receptores D2 de dopamina, sGnRH + domperidona (OVAPRIM®). Los tratamientos consistieron en aplicación vía intramuscular de: T1: 0,25 ml/kg de OVAPRIM® (0 h) y 1 ml/kg de OVAPRIM® (12 h); T2: 1 mg/kg de EHC (0 h) y 3 mg/kg de EHC (12 h); T3: dosis única de 200 U.I/kg de GCH; T4: 3 mg/kg de EHC (0 h) y 200 U.I/Kg de GCH (8h); T5: 1 ml/kg de OVA (0h) y 200 U.I/kg de GCH (8h); el grupo control consistió en la aplicación de suero fisiológico (NaCl 0,9%), siguiendo el mismo cronograma de los individuos tratados hormonalmente.
Obtención del semen
Transcurridas 6 horas después de aplicada la última dosis en cada uno de los cinco tratamientos se extrajo el semen. Previo a la extracción de los gametos, los animales fueron tranquilizados por inmersión en una solución de 2-fenoxietanol (300 ppm, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), durante 5 min. Inmediatamente después de la pérdida del eje de nado, los animales fueron extraídos y secados en la región abdominal, aplicando una leve presión para provocar la expulsión de orina y un masaje cráneo-caudal de la pared celómica para provocar la emisión del semen. Este último fue colectado en tubos de vidrio aforados para determinar directamente el volumen, teniendo el cuidado de evitar contaminación con bilis, orina o heces, ya que varios estudios han mostrado disminución en algunos parámetros como son: porcentaje de movilidad, velocidad espermática, frecuencia de remolino y posible activación de la célula espermática (Viveiros et al., 2010). El fluido extraído fue llevado inmediatamente al Laboratorio de Reproducción donde se mantuvo a una temperatura de 26ºC hasta terminar las evaluaciones espermáticas.
Evaluación seminal
La concentración espermática se determinó dentro de las 8 h siguientes a la colección del semen por recuento en cámara de Neubauer, previa dilución del semen 1:4000, con solución salina formolada (0,9 % de NaCl y formol al 3 %) (Ramírez-Merlano et al., 2011). La cámara se mantuvo en atmósfera húmeda durante al menos 10 min antes del conteo de las células (40X). Para evaluar la movilidad masal (MM) y el tiempo de activación espermática (TA) se realizó una dilución 1:20 (20 µL de semen + 180 µL de agua), sobre una lámina excavada (profundidad 1 - 1,2 mm, Micro-Slides Premiere, China) dispuesta en un microscopio óptico (10 X de magnificación), la cual se activó con agua (180 µL). Desde la activación espermática hasta el momento en que el 90% de los espermatozoides cesaron el movimiento, se registró el tiempo de activación con un cronometro y se expresó en segundos.
Análisis estadístico
Los resultados fueron expresados como media ± error estándar de la media (SEM). Para determinar los efectos de los tratamientos, los resultados fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía (ANOVA), previa validación de los supuestos de homogeneidad de varianza y normalidad de los datos, seguido de una prueba de comparación de Tukey-Kramer, con un nivel de significancia de p<0,05. Los datos fueron analizados con el software SAS versión 8.02 para Windows (1999-2001 por SAS Institute Inc, Cary, NC. USA).
Resultados
El porcentaje de respuesta a los inductores fue del 100% en todos los tratamientos, excepto en Gonadotropina Coriónica Humana (T3), donde sólo el 33% de los individuos inducidos libero semen. Las muestras seminales presentaron coloración blanquecina. Los individuos tratados con suero fisiológico (grupo control) liberaron mínimas cantidades de un líquido casi transparente sin presencia de espermatozoides, por lo que fueron excluidos de los análisis.
La tabla 1 muestra los valores medios de las características seminales obtenidas con los diferentes tratamientos, distribuyéndose aproximadamente 3 animales por tratamiento. El volumen seminal (≥4,8 ml) la movilidad masal (90%) y tiempo de activación (>50s) fue significativamente mayor en los machos tratados con Ovaprim® (T1) y Ovaprim® + Gonadotropina Coriónica Humana (T5), en tanto que los machos tratados con solo Gonadotropina Coriónica Humana (T3) presentaron menores valores de estos parámetros (0,73ml, 13,3% y 16s, respectivamente).
Por su parte, el tiempo de activación fue igual en todos los tratamientos, presentando un valor mínimo de 16 ± 28 s y máximo de 54,2 ± 7 s. Finalmente, la concentración espermática, fue mayor en los machos inducidos con Extracto de Hipófisis de Carpa (T2) (1.275.000 ± 322.000 espermatozoides/µl) y Ovaprim® + Gonadotropina Coriónica Humana (T5) (1.281.000 ± 225.000 espermatozoides/µl) mientras que el menor valor (2.716.000 ± 470.000) fue obtenido en los machos inducidos con Gonadotropina Coriónica Humana (p<0,05).
Discusión
Según la literatura algunos silúridos, como L. marmoratus, Clarias gariepinus (Viveiros et al., 2002; Bruzka, 2003), Ictalurus punctatus (Christensen y Tiersch 2005), Zungaro jahu (Viveiros et al., 2009) necesitan de tratamiento hormonal para inducir la espermiación. Destacandose en este estudio los resultados con OVAPRIM® (sGnRHa + domperidona), observándose un volumen seminal ≥4,8 ml, siendo superior al reportado por Mira-López et al., (2010) (2,84ml) y por Araújo et al., (2014) (1,45ml) para la misma especie. Lo que permitirá obtener un semen con alta viabilidad para la crioconservación.
El T1 y T5 mostraron los mayores valores de volumen (5,4 ± 1,1; 4,8 ± 1,2 ml), movilidad y tiempo de activación (90 ± 0% y 54,2 ± 7 s; 90 ± 0% y 52,9 ± 3,8 s, respectivamente) con respecto a los otros tratamientos y al grupo control. Lo que permite inferir que estos tratamientos al aumentar el volumen seminal durante el proceso de la espermiación inducida hormonalmente no interfiere en la calidad seminal. Con respecto a la concentración espermática fue mayor en T2 y T5 (1,275 ± 322 y 1,261 ± 225 x 103 sptz/µl) comparada con los otros tratamientos.
Es apropiado citar la problemática de colección de esperma por estrujamiento en estas especies de bagres que no podría ser resuelto mediante la administración de hormonas exógenas como GtH o GnRHa combinadas con antagonistas de la dopamina (Mylonas et al., 2010). No obstante, las terapias hormonales empleadas en este estudio permitieron obtener por primera vez muestras seminales de yaque (Leiarius marmoratus) con características adecuadas para realizar procedimientos de fertilización in vitro, así como someterlas a procesos de crioconservación.
Los valores de movilidad masal de semen fresco en silúridos son superiores a 80%, aunque, Brand et al., (1996) reportan valores de movilidad masal de 90,2 ± 4,7% para Pseudoplatystoma fasciatum. Igualmente, evaluaciones realizadas en otros silúridos como la barbilla (Rhamdia sebae c. f.) reportan una alta movilidad del semen fresco, 94,0 ± 0,7% (Villalobos-Sánchez y Osorio-Velandia, 2007) y 91,0± 2,3% (Velasco-Santamaría et al., 2004). Se reporta para el bagre sapo (Rhamdia quelen) una movilidad masal del semen del 80.0 ± 1,0%, mientras que Araújo et al., (2003) reportaron una movilidad masal promedio de 87,0% para Sorubim cuspicaudus, un poco más baja que la reportada anteriormente para los otros silúridos. Estudios anteriores sobre evaluación de las características seminales en yaque, realizadas por Mira et al., (2010), obtuvieron un volumen promedio de 2,7 ± 0,7 ml, menor al compararlo con el volumen promedio obtenido en este estudio (5,4 ± 1,1 ml), aunque el volumen encontrado por Brand (1996) en Pseudaplatystoma fasciatum fue significativamente alto en comparación con los reportados anteriormente (24,5 ± 21,7 ml).
Cabe señalar que la obtención del semen a partir del sacrificio de los machos, compromete los programas de selección y mejoramiento genético de estas especies, por lo tanto es importante lograr omitir la intervención de la técnica quirúrgica para conseguir programas de reproducción económicamente rentables (Viveiros et al., 2002).
Los tratamientos utilizados aumentaron significativamente (p<0,05) la movilidad espermática y no afectaron su duración. En cuanto a la movilidad y tiempo de activación, T1 (OVAPRIM®) y T5 (OVAPRIM® + GCH) presentaron los mejores resultados (90 ± 0% y 54,2 ± 7 s; 90 ± 0% y 52,9 ± 3,8 s, respectivamente). La concentración espermática fue mayor (p<0,05) en T2 (EHC) y T5 (OVAPRIM® + GCH) (1,275 ± 322; y 1,261 ± 225 sptz x 103/µL) comparadas con los otros tratamientos. Los valores hallados en los machos tratados con EHC (76,6± 15,2 %) fueron superiores a los encontrados en la misma especie con una dosificación menor de EHC (40 ± 34 %) y fueron similares a los encontrados en Pseudoplatystoma sp. con el mismo inductor en dosis única (95 %) (Rivera et al., 2009).
Han sido evaluados diferentes inductores de segunda y tercera generación para producir liberación y aumento del volumen seminal en varias especies de silúridos como Sorubim cuspicaudus (Muñoz y Martínez, 2003), Pseudoplatystoma fasciatum (Guarnizo, 2003) y Rhamdia sebae (Velasco-Santamaría et al., 2004), siendo los más utilizados extractos hipofisiarios heterologos de pez (carpa), análogos superactivos de la hormona liberadora de gonadotropinas (sGnRH-A) combinados con bloqueadores de dopamina y gonadotropina coriónica humana (GCH), todos con resultados positivos. En C. gariepinus (Viveiros et al., 2009), evaluaron diferentes protocolos con base en extracto de hipófisis de carpa y de Clarias, mGnRHa con Pimozide y OVAPRIM®, de manera individual y en varias combinaciones. En aquellos tratamientos donde lograron obtener semen por medio de estrujamiento, este fue en reducida cantidad y de inferior calidad cuando se comparó con el semen extraído directamente del testículo (Viveiros et al., 2002).
En conclusión los resultados del presente estudio permiten sugerir que la inducción hormonal con sGnRH + Domperidona (OVAPRIM®) combinada con GCH (FERTIVET®), son efectivas para la inducción hormonal de Leiarius marmoratus sin afectar su calidad seminal que permitirán obtener tasas de fertilidad satisfactorias en la reproducción de la especie bajo condiciones de cautiverio.