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Introducción
Actualmente la acuicultura es una de las principales fuentes de proteína para la seguridad alimentaria a nivel mundial. Adicionalmente constituye una actividad generadora de empleo en la mayoría de países en desarrollo (FAO, 2018). Según FAO (2016) es el sistema de producción animal que ha presentado mayor crecimiento en los últimos años.
Para que dicho crecimiento sea posible, ha sido necesario implementar sistemas de producción cada vez más intensivos, en los que los organismos cultivados pueden ser expuestos a factores estresantes propios de dichos sistemas, como por ejemplo problemas de calidad de agua, alta densidad de siembra, captura y traslado, entre otros, los cuales pueden ocasionar bajas de oxígeno y en ocasiones enfermedades o hasta la muerte de los ejemplares (Urbinati y Carneiro, 2005). Por tal razón, es necesario generar alternativas que permitan disminuir el impacto de los agentes estresantes, inevitables dentro del proceso productivo, que garanticen el bienestar de los animales durante su ciclo de producción.
Diferentes estudios demuestran que el ácido ascórbico (vitamina C) tiene funciones importantes en los procesos fisiológicos de varias especies de peces (Chagas y Val, 2003). Es un nutriente correlacionado con el funcionamiento del sistema inmune, constituye un cofactor implicado en reacciones fisiológicas como la hidroxilación de los aminoácidos prolina y lisina, responsables de la síntesis de colágeno (Falcon et al., 2007; Drouin et al., 2011), en la síntesis de neurotransmisores como la serotonina y en la transformación de la dopamina en noradrenalina (Miyasaki et al., 1995; Chagas y Val, 2003; Urbinati y Carneiro, 2005), adicionalmente, juega un papel importante en el metabolismo del hierro (Ortuño et al., 2001). Sin embargo, en condiciones naturales los peces teleósteos, en especial los de agua dulce, no son capaces de sintetizar tal vitamina, teniendo que satisfacer su demanda obteniéndola del alimento consumido (Drouin et al., 2011) motivo por el cual, en cautiverio es imprescindible suministrarla en la dieta.
Peces alimentados con dietas deficientes en ácido ascórbico (A.A) presentan deformidades en las estructuras de soporte de las branquias y los ojos y en las aletas y la columna (Darias et al., 2011), así como una disminución en los valores de hematocrito (Miyasaki et al., 1995; Verlhac et al.; 1998; Chagas y Val, 2003) y de hemoglobina, pues la deficiencia ocasiona una reducción en la capacidad de absorber y redistribuir el hierro, con la consecuente disminución en la capacidad de sintetizarla (Verlhac et al., 1998; Abreu y Urbinati, 2006).
En situaciones de estrés, los peces presentan como respuesta primaria mayor actividad de las hormonas equivalentes a las de la corteza adrenal de otros vertebrados (Valenzuela et al., 2002) y posteriormente, como respuesta secundaria, presentan alteraciones en parámetros como el conteo de células sanguíneas, haciendo que este parámetro sea útil en la determinación de la respuesta de los peces ante situaciones adversas (Wendelaar-Bonga, 1997; Sloman et al., 2001). Finalmente, como respuesta terciaria, los animales disminuyen su tasa de crecimiento y su desempeño productivo, al tiempo que se hacen más susceptibles a adquirir enfermedades (Barton e Iwama, 1991; Wendelaar-Bonga, 1997; Barnett y Pankhurst, 1998).
Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la suplementación en la dieta con ácido ascórbico, sobre algunos parámetros productivos y hematológicos de juveniles de cachama blanca, Piaractus brachypomus sometidos a estrés por hipoxia aguda.
Materiales y métodos
Localización
El trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Ictiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, ubicado en la ciudad de Bogota, a 2.600 msnm, bajo condiciones controladas de laboratorio (24°C). Los análisis de laboratorio fueron realizados en los laboratorios Clínico y de Nutrición Animal de la misma facultad.
Animales experimentales
Fueron utilizados 72 juveniles de cachama blanca con peso promedio de 30 ± 4,76 g, los cuales fueron mantenidos en 24 acuarios de 80 litros a una carga inicial de 1,2 g/L y alimentados ad libitum (consumo aproximado: 3,86% de la biomasa/día) durante 30 días con una dieta extruida de 32% de proteína, cuya composición proximal se presenta en la Tabla 1. La Composición de la dieta experimental formulada con 32% de proteína se muestra en la Tabla 2.
Tabla 1 Composición proximal de la dieta experimental (expresada como alimento)
*Materia seca; ** Extracto etéreo; *** Extracto no nitrogenado.
La mezcla formulada y realizada en el laboratorio, sin adición de A.A, fue dividida en seis porciones, a cada una de las cuales se le adicionó un nivel diferente de A.A bajo la forma de L-ascorbil-2-monofosfato (Rovimix Stay-C35®), constituyendo los siguientes tratamientos: T1: 0 mg/kg; T2: 100 mg/kg; T3: 200 mg/kg; T4: 400 mg/kg; T5: 800 mg/kg; T6: 1600 mg/kg.
Las materias primas seleccionadas y las dietas extruidas fueron sometidas a análisis proximal, en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, de acuerdo con los métodos oficiales de Análisis de la Asociación de Química Analítica (AOAC, 2012).
Obtención y manejo de material biológico
Finalizada la fase de alimentación (30 días), los animales fueron sometidos a hipoxia aguda, consistente en una exposición aérea durante 60 segundos e inmediata devolución al agua. Previa anestesia con metasulfonato de tricaina (75 ppm), se realizaron colectas de sangre mediante punción en la vena caudal de 3 individuos por tratamiento a los 5, 30, 60 y 360 minutos después de haber sido devueltos al agua. Los peces fueron seleccionados aleatoriamente de los diferentes acuarios de cada tratamiento para cada tiempo de muestreo y sacrificados mediante sobredosis de anestesia. Previo al experimento se obtuvo el aval del comité de bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia.
Todos los individuos fueron pesados para calcular ganancia de peso (GP), tasa de crecimiento específico (TCE) y crecimiento relativo (CR), mediante ecuaciones descritas por Ricker (1975):
Ganancia de peso g (GP): Peso final-Peso inicial
Tasa de crecimiento específico %/día (TCE): [(Ln peso final-Ln peso inicial) /Tiempo]*100
Crecimiento relativo (CR): Ganancia de peso/Peso inicial*100
Con las muestras de sangre obtenidas se tomó una primera porción en capilares de 50 µL, los cuales fueron centrifugados durante 5 minutos a 5000 rpm para la determinación del hematocrito. Una segunda porción se utilizó para la determinación de hemoglobina, la cual se realizó utilizando el kit comercial Drabkin Spinreact®, mediante el uso de espectrofotómetro Stat Fax® 3300.
Para conteo óptico de glóbulos rojos y blancos mediante cámara de Neubauer se llevó a cabo previamente una dilución de 1:100, con reactivo de Natt Herricks, también se realizó un extendido en portaobjeto de vidrio para recuento diferencial de células blancas mediante tinción de Wright. Con estos parámetros se calcularon: volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), mediante la metodología descrita por Conroy (1998):
VCM = % Hematocrito*10/N°eritrocitos
HCM = Hemoglobina*10/N°eritrocitos
CHCM = Hemoglobina*100/ % hematocrito
La sobrevivencia fue calculada mediante la siguiente ecuación:
% Sobrevivencia: S = (N°final de individuos/ N°inicial de individuos) *100
Análisis estadístico
El experimento tuvo un diseño experimental completamente al azar con arreglo de parcelas divididas en el tiempo. Se comprobó el cumplimiento de los supuestos estadísticos de normalidad de los datos e independencia del error. Para verificar la existencia de diferencias significativas (p<0,05) entre los tratamientos se realizó un análisis de varianza (ANAVA) y en los casos que se encontraron, las medias fueron comparadas mediante la prueba de Tukey (5%). Los análisis se realizaron mediante la utilización del software SAS System V9.0®.
Resultados
Los valores de GP, TCE y CR se presentan en la Tabla 3, mostrando que hubo diferencias significativas para las tres variables. Los ejemplares del tratamiento con 100 mg/kg (T2) presentaron valores significativamente mayores cuando se compararon con los demás tratamientos; los ejemplares suplementados con 1600 mg/kg (T6) presentaron el menor desempeño productivo respecto a los demás tratamientos. La supervivencia fue del 100% en todos los tratamientos.
Tabla 3 Valores medios ± D. S. de ganancia de peso (GP), crecimiento relativo (CR) y tasa de crecimiento específico (TCE) de cachama blanca alimentada con diferentes niveles de inclusión de ácido ascorbico dietario
Letras diferentes dentro de las columnas indican diferencias significativas (p<0,05). T1:0 mg/kg; T2:100 mg/kg; T3:200mg/kg; T4:400 mg/kg; T5:800 mg/kg; T6:1600 mg/kg.
El hematocrito y la hemoglobina no presentaron diferencias significativas (p>0,05), ni entre tratamientos ni entre tiempos (Tabla 4). Lo mismo fue encontrado para conteo de células rojas, VCM, HCM y CHCM. En el recuento diferencial no hubo diferencias significativas en el porcentaje de linfocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos, ni entre tratamientos ni entre tiempos de muestreo. Solamente en el caso de los monocitos se presentaron diferencias significativas en el primer tiempo de muestreo, observándose un porcentaje mayor de estas células en los ejemplares del T1, con respecto a los tratamientos T4, T5 y T6 (Tabla 5). En el caso de los glóbulos blancos se observó que los ejemplares suplementados con 800 mg/kg presentaron un mayor número de células que los demás tratamientos en todos los tiempos de muestreo (Figura 1).
Tabla 4 Valores de hematocrito y hemoglobina (Media ± D. S.) de cachama blanca alimentada con seis niveles de inclusión de ácido ascorbico dietario y cuatro tiempos de muestreo pos hipoxia aguda
Tabla 5 Recuento diferencial de células blancas (Media ± D. S.) de cachama blanca alimentada con seis niveles de inclusión de ácido ascorbico dietario y cuatro tiempos de muestreo pos hipoxia aguda
Medias seguidas de letras distintas para el tiempo 5 min, entre tratamientos, presentaron diferencias significativas (p<0,05)
Figura 1 Cantidad de glóbulos blancos (Cel/μL) de cachama blanca alimentada con seis niveles de inclusión de ácido ascorbico dietario y cuatro tiempos de muestreo pos hipoxia aguda. Letras mayúsculas diferentes indican diferencia significativa (p<0,05) entre niveles; letras minúsculas diferentes indican diferencia significativa (p<0,05) entre tiempos.
Discusión
La mayor ganancia de peso encontrada al al suplementar los animales con 100 mg/kg de A.A en la dieta con respecto al control indica que la inclusión dietaria sería recomendable para atender los requerimientos para crecimiento de los juveniles de la especie. Estos resultados coinciden con lo reportado por Ai et al., (2004) en Lateolabrax japonicus, Ming et al., (2012) en Megalobrama amblycephala, Zhou et al., (2012) en Rachycentron canadum, quienes demostraron que al suplementar la dieta con vitamina C, los individuos presentaban mejor ganancia de peso y tasa de crecimiento específico; lo anterior también coincide con los resultados reportados por Martins (1998) en Piaractus mesopotamicus y Chagas y Val (2003) en Colossoma macropomum, quienes observaron que la suplementación en la dieta con ácido ascórbico mejoraba el desempeño zootécnico de los peces. No obstante, algunos autores afirman que no existen diferencias significativas en el desempeño productivo de los peces al ser suplementados con vitamina C (Navarro et al., 2010; Reis et al., 2011; Notash, 2012, Zaminham et al., 2012; Gao et al., 2014).
De hecho, aun existe controversia respecto al uso o al nivel de inclusión de la vitamina C en la dieta. En el presente trabajo el mejor nivel fue 100 mg/kg, resultado que sería consistente con lo reportado por Chen et al., (2015) en Micropterus salmoides, Liang et al., (2017) en Pelteobagrus fulvidraco y Arab e Islami (2015) en Salmo trutta, quienes afirman que niveles de entre 109 y 177 mg/kg de ácido ascórbico en la dieta serían suficientes para mejorar el desempeño productivo de los animales y que niveles mayores de suplementación no serían necesarios para tal propósito. No obstante, Ibrahem et al., (2010) observaron que Oreochromis niloticus suplementadas con 500 mg/kg de vitamina C, presentaron mejor ganancia de peso, tasa de crecimiento específico y sobrevivencia que peces no suplementados. Igualmente, Gusmão et al., (2007) pudieron comprobar que la suplementación con 800 mg/kg de vitamina C en la dieta de Brycon amazonicus favoreció la ganancia de peso de los animales. Sin embargo, en el presente estudio, niveles mayores a 100 mg/kg de A.A no presentaron efecto positivo sobre dicho parámetro. Por el contrario, a medida que se aumentó el nivel de suplementación, los valores obtenidos disminuyeron, inclusive con diferencias significativas (p<0,05) entre el T6 (1600 mg/kg) y los demás tratamientos. Este resultado coincide con lo reportado por Ramesha et al., (2000), quienes afirman que la suplementación no debe ser excesiva y que niveles de 50 y 100 mg/kg de ácido ascórbico en la dieta son suficientes para garantizar óptimo crecimiento de juveniles de Cyprinus carpio.
Respecto a los parámetros hematológicos como probables indicadores de estrés, se debe anotar que algunos autores reportan un aumento en los valores de hemoglobina y hematocrito como consecuencia de exposición a estrés de varias especies de peces (Chagas y Val, 2003; Zhou et al., 2012). En Colossoma macropomum, Chagas y Val (2003) afirman que la suplementación con ácido ascórbico en la dieta tiene efecto importante sobre algunos de los parámetros hematológicos de la especie, como el hematocrito, el cual es directamente proporcional a los niveles de ácido ascórbico contenido en la dieta, observándose valores reducidos en los ejemplares alimentados con dietas libres de ácido ascórbico. Resultados similares fueron obtenidos en otras especies (Fracalossi et al., 1998; Li y Robinson, 1999; Adham et al., 2000) que verificaron disminución del hematocrito en los ejemplares que no recibieron suplementación con vitamina C. Los resultados de este trabajo difieren de lo descrito anteriormente, ya que no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos, ni en los tiempos de hipoxia. En cuanto a la hemoglobina los resultados obtenidos por Adham et al., (2000), difieren con los encontrados por Soliman et al., (1994) y Chagas y Val (2003), quienes reportaron reducción significativa de los niveles de hemoglobina en ejemplares alimentados sin vitamina C. Dicha reducción probablemente se deba a la disminución en la capacidad de absorber y redistribuir el hierro, con la consecuente baja en la capacidad de sintetizar hemoglobina. La disminución de ambos parámetros, podrían indicar estados de anemia de los animales (Adham et al., 2000), los cuales no fueron observados en el presente estudio.
En cuanto al conteo de células sanguíneas Zhou et al., (2012) observaron que el contaje de celulas rojas fue mayor en juveniles de Rachycentron canadum suplementados con diferentes niveles de vitamina C cuando se comparó con el conteo obtenido en ejemplares alimentados con dieta libre de la vitamina. Asimismo, Gusmão et al., (2007) encontraron que en juveniles de Brycon amazonicus, el número de leucocitos fue significativamente mayor en ejemplares suplementados con vitamina C con respecto a los no suplementados, presentando los mayores valores en los tratamientos con 600 y 800 mg/kg. Similares resultados se obtuvieron en el presente estudio, en el cual los ejemplares suplementados con 800 mg/kg de ácido ascórbico presentaron mayor número de leucocitos debido probablemente a la acción inmunoestimulante que se le ha atribuido a la vitamina C (Narra et al., 2015), según la cual podría mejorar la producción de células blancas en la sangre del organismo haciéndolo más resistente a situaciones adversas. Barros et al., (2014) afirman que en condiciones de estrés, se presenta linfopenia en Tilapia nilotica y que tal situación podría mejorarse al suplementar la dieta con ácido ascórbico (600 mg/kg), lo cual corrobororía tal hallazgo.
Por otro lado, en el presente estudio no se observó relación entre el número de linfocitos circulantes y los niveles de ácido ascórbico suplementado, así como tampoco sobre la producción de neutrófilos. En cuanto a los monocitos, principales células de la respuesta inmune de los peces, se esperaría un aumento ante condiciones de estrés. Sin embargo, en el presente estudio todos los grupos tratados mostraron un evidente un descenso en el primer tiempo de colecta (5 minutos) post estrés con diferencias significativas (p<0,05), al ser comparados con el grupo de no suplementados. Probablemente, tal descenso se deba a una respuesta de atenuación del estrés, la cual por supuesto debe ser verificada con otros parámetros no evaluados en el presente trabajo.
En conclusión, se puede afirmar que la suplementación con niveles de 100 mg/kg de ácido ascórbico en la dieta de juveniles de Piaractus brachypomus contribuye a mejorar los parámetros productivos (GP, CR y TCE), pero que la utilización de niveles crecientes de vitamina C no afectan la mayoría de parámetros hematológicos de la especie, con excepción del número total de leucocitos, el cual aumenta y el porcentaje de monocitos, cuyo aumento se ve atenuado por el uso de la vitamina.
