Propagación in vitro de Solanum dolichosepalum (Solanaceae)

In vitro Propagation of Solanum dolichosepalum (Solanaceae)

Camilo Andrés Cárdenas-Burgos^a*
José C. Pacheco-Maldonado^b
André L. L. Vanzela^c

^a Biol. Estudiante Maestría en Ciencias Biológicas-UPTC. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales BIOPLASMA-UPTC. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Sede Central, Tunja-Colombia.
^* Autor de correspondencia: camilo.cardenas@uptc.edu.co
^b PhD. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales BIOPLASMA-UPTC. Escuela de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Sede Central, Tunja-Colombia.
^c Prof. Dr. Laboratorio de Citogenética y Diversidad Vegetal. Departamento de Biología General, Centro de Ciencias Biológicas. Universidad Estadual de Londrina. Londrina 86057-970, Paraná, Brasil.

Recepción: 19-ene-2016 Aceptación: 28-abr-2016

Resumen

Se estableció un protocolo para micropropagación de Solanum dolichosepalum a partir de semillas desinfectadas con NaOCl y germinadas en MS/4. La multiplicación de microtallos se realizó por segmentos nodales, evaluando el efecto de la posición del segmento nodal, concentración de AIB y BA, concentración de sales MS en presencia de AIB, concentración de sales MS y sacarosa en presencia de carbón activado, diferentes medios de cultivo y concentración de carbón activado sobre la longitud total de microtallos, promedio de yemas neoformadas, porcentaje de microtallos con callo basal y porcentaje de microtallos enraizados. Después de 20 días de cultivo en MS/4 el 100% de las semillas cultivadas desarrollaron plántulas de apariencia normal. La multiplicación de microtallos fue exitosa en medio H con 2% de sacarosa suplementado con 0,02 mg L⁻¹ de ANA y de BA; después de 30 días de subcultivo los microtallos desarrollados alcanzaron 4 cm de longitud, formaron 4 yemas axilares, el 3% formó callo basal y el 100% presentó enraizamiento. La aclimatización de plántulas se realizó exitosamente en una mezcla de tierra, capote y arena (3:2:1). Este protocolo forma parte de un programa de producción de material injertado de lulo de castilla para establecimiento de huertos comerciales.

Palabras clave: Callo basal, Enraizamiento, Lulo, Micropropagación, Solanáceas silvestres.

Abstract

A protocol for micropropagation of Solanum dolichosepalum was established from seeds disinfected with NaOCl and germinated in MS/4. Multiplication of microshoots was performed by nodal segments evaluating the effect of the nodal segment position, BA and IBA concentrations, MS salts concentration in presence of AIB, MS salts and sucrose concentration in the presence of activated charcoal, different culture media, and activated charcoal concentration on the total length of microshoots, average of newly formed buds, percentage of microshoots with basal callus and percentage of rooted microshoots. After 20 days of culture in MS/4 100% of cultured seeds developed plantlets with normal appearance. Microshoots multiplication was successful in medium H with 2 % sucrose supplemented with 0,02 mg L⁻¹ NAA and BA; after 30 days of subculture, the developed microshoots reached 4 cm in length, formed four axillary buds, 3% formed basal callus and 100% developed roots. Plantlets acclimatization was successfully performed on a mixture of soil, mulch and sand (3:2:1). This protocol is part of a program to produce grafted material of "Lulo de Castilla" for establishment of commercial orchards.

Key words: Basal callus, Rooting, Lulo, Micropropagation, Wild solanaceae.

1. Introducción

El uso de especies silvestres con el fin de mejorar la producción de cultivos de interés comercial, como el de lulo, es de gran interés para los fruticultores y se refleja en el aumento progresivo de la demanda de nuevos materiales vegetativos y cultivos alternativos para suplir la demanda de frutas en los mercados nacionales y para exportación [1-3]. De acuerdo con Lane [4] y Barrios-Paternina y Mercado-Gómez [5], los parientes silvestres de especies cultivadas comercialmente son fuente de genes de resistencia contra enfermedades, plagas y factores de estrés, como la sequía y las temperaturas extremas; una de tales especies es Solanum dolichosepalum (frutillo), arbusto nativo, escaso y propio de sitios abiertos, con adecuado desarrollo en suelos altamente erosionados secos y con deficiencias nutricionales [6].

El frutillo es importante en la cultura popular, sus hojas y frutos son utilizados como cicatrizante, para eliminar piojos y en el tratamiento de enfermedades renales [7]. Se ha comprobado que los extractos etanólicos de esta especie tienen efectos antibacterianos y antimicóticos contra Candida albicans [8], hongo productor de infecciones vaginales, intestinales y dermatológicas [9]. Además, sus extractos hidroalcohólicos poseen efectos inmunoestimulantes en ratas [10] y sus extractos acuosos muestran actividad antifúngica contra Trichophyton rubrum [11]. Por estas características y algunos ensayos realizados en nuestro Laboratorio (resultados no mostrados) se considera la posibilidad de que S. dolichosepalum presente algún grado de tolerancia a Fusarium oxysporum, hongo del suelo que produce marchitez vascular en plantas de lulo [12].

El injerto, además de ser una de las técnicas utilizadas para perpetuar clones de difícil multiplicación, acelerar la madurez de las plantas obtenidas por hibridación y para obtener formas especiales de crecimiento vegetativo, es de interés para el aprovechamiento de portainjertos resistentes tanto a patógenos como a diferentes condiciones de estrés [13]. En varias especies frutícolas se ha utilizado exitosamente el injerto para mejorar la producción; por ejemplo, portainjertos de S. torvum aumentan la producción de lulo a 5 t ha⁻¹ [14], mientras que portainjertos de S. hirtum y S. arborium mejoran su diámetro, peso y acidez [15]. Además, la eficacia del uso de portainjertos resistentes a ciertos patógenos ha sido demostrada en varias especies como Lycopersicon hirsutum [16] y S. hirtum [17], especies silvestres que resultaron resistentes a F. oxysporum. Las ventajas que ofrece el uso de la técnica del injerto pueden ser complementadas con procesos de micropropagación que permitan la multiplicación clonal masiva de portainjertos cuidadosamente seleccionados, tanto por su compatibilidad (púa-portainjerto) como por su tolerancia a diferentes tipos de estrés [18, 19]. Por tanto, este trabajo se enfoca al establecimiento de un protocolo de micropropagación para S. dolichosepalum que permita obtener masivamente portainjertos clonales de alta calidad utilizables para multiplicar, a gran escala, materiales vegetativos de lulo de castilla.

2. Metodología

Esta investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales BIOPLASMAUPTC de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Tunja.

2.1. Material vegetal

Los arbustos silvestres de S. dolichosepalum utilizados están localizados en el municipio de Tinjacá-Boyacá (05^°34'51"N 073^°38'46'O', 2175 m de altura y 17 ^°C); de éstos se colectaron frutos maduros, las semillas se extrajeron manualmente y posteriormente se sumergieron en una solución de Vitavax®, 1,0 g L⁻¹ durante 120 minutos, y se almacenaron en frascos de vidrio a temperatura ambiente hasta su uso.

2.2. Establecimiento de cultivos in vitro

La asepsia superficial de las semillas se realizó siguiendo las recomendaciones de Bolívar y Tovar [20] para semillas de lulo. En cámara de flujo laminar, las semillas se enjuagaron con agua destilada estéril más Tween 20 (0,1%, v/v) durante 5 minutos y consecutivamente se sumergieron en etanol (70%) durante 30 segundos y en NaOCl (5,25%, p/v) al 10% (v/v) durante 15 minutos con agitación continua. Finalmente, se enjuagaron cinco veces (1 minuto cada una) con agua destilada estéril.

Posteriormente, las semillas se cultivaron en medio MS, Murashige y Skoog [21], con o sin reguladores de crecimiento, en MS con sales diluidas a un cuarto (MS/4) o sobre papel filtro humedecido con agua destilada estéril (cámara húmeda) y se incubaron en condiciones de luz y oscuridad (tabla 1). Se realizaron observaciones consecutivas durante 30 días y en cada tratamiento se cuantificó el porcentaje de semillas germinadas y la contaminación por hongos y bacterias.

2.3. Multiplicación de microtallos a través de segmentos nodales

Después de 30 días de cultivo, y previa eliminación de la raíz, las plántulas obtenidas en la etapa anterior se transfirieron a MS suplementado con 0,2 mg L⁻¹ de AIB [20]. Con el fin de evitar la formación de callo basal en los microtallos desarrollados, así como de estimular la formación de yemas axilares y el enraizamiento, se realizaron diferentes ensayos (tabla 2) para evaluar el efecto de la posición del segmento nodal (explante) en el microtallo y de diferentes medios de cultivo, así como la concentración de: AIB y BA (solos o combinados), sales minerales MS en presencia de AIB, carbón activado y sales minerales MS y sacarosa en presencia o ausencia de carbón activado. En cada ensayo se cuantificó la longitud total promedio de microtallos, el promedio de yemas axilares neoformadas, el porcentaje de microtallos con callo basal y enraizados.

2.4. Aclimatización

Las plántulas obtenidas en la etapa anterior en los medios H y H con 2% sacarosa se extrajeron de los recipientes de cultivo, se les eliminó el agar adherido a las raíces con agua corriente y se transfirieron a vasos plásticos de 100 mL con diferentes sustratos: tierra, tierra: capote (3:1), tierra: turba (3:1), tierra: arena (3:1) y tierra:capote (mantillo de bosque): arena (3:2:1) y se mantuvieron en condiciones de invernadero con riego por nebulización cada 2 horas 6 segundos durante una semana y, posteriormente, con riego diario por aspersión manual durante 60 días. En esta etapa se cuantificó el porcentaje de plántulas viables.

2.5. Condiciones generales de cultivo y análisis de datos

La unidad experimental en la etapa de germinación fue un frasco con 10 semillas y cinco repeticiones para un total de 50 semillas por tratamiento; para la etapa de multiplicación la unidad experimental fue un frasco con cinco explantes (explante = microtallo con uno o dos segmentos nodales) y seis repeticiones. Todos los explantes se cultivaron en recipientes de vidrio de 100 mL, con alícuotas de 20 mL de medio de cultivo con pH de 5,6 ajustado con HCl y/o NaOH 0,1 N y autoclavados a 15 psi y 121^°C durante 20 minutos. Los cultivos se incubaron a 24±1^°C con iluminación continua de 70-80 µmol m⁻²s⁻¹, suministrada por lámparas fluorescentes de 75W.

Los datos se procesaron en el programa IBM SPSS Statisctics versión 22; para hallar diferencias significativas entre los tratamientos de germinación se realizó la prueba H de Kruskal-Wallis para muestras independientes y para los datos de multiplicación la prueba HSD Tukey con un nivel de confianza del 95%; los datos de aclimatización se registraron y analizaron como porcentajes.

3. Resultados y discusión

3.1. Establecimiento de cultivos

Para la asepsia superficial de semillas de S. dolichosepalum la aplicación de NaOCl al 10% (v/v) durante 15 minutos resultó efectiva permitiendo obtener 100% de cultivos de semillas asépticas, resultados que concuerdan con los obtenidos en explantes de otras solanáceas como Solanum quitoense, Physalis ixocarpa, P. minima y P. peruviana [18, 28, 29]. Téngase en cuenta que el NaOCl aparece en la literatura como uno de los agentes desinfectantes más utilizados en cultivo de tejidos [30, 31]. Todos los tratamientos ensayados para la obtención de plántulas in vitro (figura 1) mostraron diferencias significativas en el porcentaje de germinación, cuantificándose el valor más alto (100%) en MS/4 (T5); en los demás tratamientos los valores de germinación no superaron el 32%, o no se observó germinación como en el tratamiento en MS (T3) y MS + 0,2 mg L⁻¹ de AIB (T7).

La variación en los porcentajes de germinación registrada en los tratamientos ensayados indica que tanto la elevada concentración de sales del medio (MS), como la presencia de AIB, GA3 y AIB inhiben totalmente la germinación (T3) o la inhiben parcialmente (T4, T6, T7); además, la baja germinación en cajas de Petri pone en evidencia el efecto positivo de la presencia de bajas concentraciones de sales en el medio de cultivo. En los tratamientos T1 y T2 también se pone en evidencia el efecto promotor de la luz sobre la germinación de semillas. Así mismo, el 100% de germinación alcanzado en el medio pobre en sales (MS/4) indica que las semillas cultivadas se encontraban en un estado óptimo de madurez morfofisiológica, condición que facilitó una rápida emergencia de radícula, 7-9 días, y un desarrollo de plántulas de apariencia normal. Resultados semejantes fueron reportados en semillas de otras solanáceas silvestres [32], de las cuales semillas de S. hirtum cultivadas en medio Hendrix (H) y de S. mammosum cultivadas en MS diluido a la mitad de su concentración original alcanzaron valores de 94,4% y 90,6%, respectivamente. Además, la escasa germinación en condiciones de oscuridad podría indicar que las semillas de S. dolichosepalum se comportan como fotoblásticas positivas; este comportamiento también se ha reportado para semillas de S. sessiliflorum [33], S. nudum [34], S. quitoense y S. betaceum [35], entre otras.

3.2. Multiplicación de microtallos a través de segmentos nodales

Ensayo 1. Efecto de la posición del segmento nodal en el microtallo. De manera semejante a las observaciones realizadas por otros autores [36, 37], en este ensayo fue evidente la variación de las respuestas producidas por explantes tomados de diferentes posiciones de los tallos desarrollados in vitro. Las respuestas cuantificadas en los tratamientos en los que se cultivaron segmentos apicales, superiores, medios y basales presentaron diferencias significativas (HSD Tukey, P≤0,05) en las variables longitud total, yemas axilares neoformadas y microtallos con callo basal, mientras que los porcentajes de enraizamiento fueron elevados y menos variables, 90-100%, (tabla 3). Los microtallos con mayor longitud total (5,1 cm) se desarrollaron de segmentos nodales superiores, formaron en promedio 4,3 yemas axilares y el 100% formó raíces, sin embargo, la formación de callo alcanzó el 100%, respuesta que puede deberse, en parte, a la cercanía de dichos segmentos al meristemo apical, sitio principal de síntesis de AIA. Se ha sugerido que la eficiencia del explante utilizado en la formación de yemas y desarrollo de microtallos disminuye con el incremento en la distancia desde el ápice del tallo principal [38]. Aunque en segmentos basales, en comparación con los segmentos apicales, la longitud total de microtallos disminuyó a 3,7 cm y el número promedio de yemas axilares a 3,5, este tipo de explante fue seleccionado como el más adecuado para la realización de los ensayos siguientes debido a que la formación de callo disminuyó a 50%. Resultados semejantes a los obtenidos en este trabajo se han reportado para Annona muricata [37] y Psidium guajava [38] en las que se observó que los segmentos nodales intermedios desarrollaron mayor número de yemas axilares que los segmentos nodales superiores y basales; así mismo, en Quercus robur los explantes tomados de regiones basales y apicales produjeron la menor cantidad brotes [39]. Con relación a la formación de callo, se ha indicado que la capacidad de formación de callo en segmentos caulinares de una misma planta varía según la posición del explante a lo largo del tallo, observando que los explantes más cercanos a la inserción de los cotiledones reaccionan mejor que los situados más arriba [40]. Estos resultados contrastan con los obtenidos en S. dolichosepalum, en el que los mayores porcentajes de segmentos nodales que formaron callo fueron los más cercanos al ápice.

Ensayo 2. Efecto del AIB y BA. Los datos registrados para las variables evaluadas presentaron diferencias significativas entre los tratamientos (HSD Tukey P≤0,05) (tabla 4). Con respecto a la longitud total de microtallos los valores más elevados, 4,8 y 6,3 cm, se cuantificaron en presencia de AIB (T3 y T1), mientras que en los medios con BA, (T7 y T8) la longitud fue de 2,6 y 3,8 cm y, en presencia de auxina más citoquinina, alcanzó valores intermedios a los anteriores, 3,6-4,1 cm. Resultados similares fueron reportados por Rache y Pacheco [29] en la propagación in vitro de Physalis peruviana, e indicaron que en presencia de AIB (0,1 mg/L) se obtuvo la mayor longitud de microtallos (8,6 cm) y que en presencia de BA la elongación fue deficiente (máximo 2,7 cm); así mismo, en S. glaucescens Medina [41] obtuvo la mayor longitud, 11,10 cm, de brotes en presencia de 1,0 mg/L de AIB. En relación con la presencia de auxinas en los medios utilizados, los datos obtenidos ponen en evidencia el efecto estimulante de las auxinas sobre la elongación de los microtallos de S. dolichosepalum, el cual contrasta con el reportado para otras solanáceas cultivadas in vitro (Capsicum annuum [42] y Physalis ixocarpa [28]), las cuales elongan adecuadamente en medios suplementados con citoquininas.

Con relación a formación de yemas axilares por microtallo, se observó que los promedios fueron afectados de forma variable principalmente por las concentraciones de AIB y BA utilizadas en los diferentes tratamientos (tabla 4). Aunque no es posible determinar cuantitativamente una relación especifica entre la concentración de citoquinas en el medio y el número de yemas axilares formadas, se observó que en el tratamiento en presencia solo de BA (T7) y este acompañado con una concentración mayor de AIB (T4), la formación de yemas fue mayor; mientras en presencia de concentraciones bajas de BA y AIB (solas o combinadas) los microtallos formaron 3 a 4 yemas axilares (T3, T5, T8, T9 y T10); resultados similares, 4,3 yemas por explante, se obtuvieron en uchuva con 0,1 mg L⁻¹ de AIB [29].

El desarrollo de callo se presentó en altos porcentajes de microtallos (66,6-100%) en todos los tratamientos realizados incluyendo el control, cuantificándose el más bajo (53,3%) en presencia de 0,05 mg/L de AIB. El callo formado presentó consistencia friable y su crecimiento inició en la base (figura 2a), avanzó en dirección ascendente (figura 2b) hasta invadir totalmente al microtallo y presentar apariencia necrótica (figura 2c). En contraste con las observaciones anteriores, en numerosas solanáceas las auxinas y citoquininas (solas o combinadas) en los medios de cultivo promueven procesos de división celular y activación enzimática [43] facilitando, no solo la formación de callo sino el desarrollo de procesos organogénicos [40, 44, 45].

Los porcentajes de enraizamiento de microtallos también resultaron estadísticamente diferentes; el AIB, solo, en el medio de cultivo indujo enraizamiento en 40-80% de los microtallos (T1, T2 y T3), mientras que el BA, solo, inhibió en gran medida el enraizamiento, cuantificándose valores de 20% (T7 y T8). Por otro lado, se observó que la adición al medio de cultivo de auxina+citoquinina estimuló el enraizamiento en más del 80% de los microtallos (T4 y T5); respuesta que puede ser explicada por el efecto sinérgico de estas dos hormonas, el cual favorece el desarrollo de raíces cuando existe un balance a favor de las auxinas (T4). Al respecto, Rache y Pacheco [29] reportaron la misma concentración utilizada en este estudio en T2 (0,1 mg L⁻¹ de AIB) en la cual el 100% de los microtallos de P. peruviana desarrollaron raíces.

Ensayo 3. Efecto de la concentración de sales minerales MS en presencia de AIB. La reducción de las sales minerales del MS a ½ y ¼ de su concentración original en presencia de AIB entre 0,025 y 0,2 mg L⁻¹ (tabla 2), afectó de manera significativa los resultados obtenidos en las variables evaluadas, excepto la formación de callo basal, la cual alcanzó un valor de 100% en todos los tratamientos (tabla 5). La longitud total de microtallos en todos los tratamientos fue mayor a 3,8 cm y los promedios más altos, 6,4 y 6,2 cm, se obtuvieron en MS/4 + 0,1 mg L⁻¹ de AIB y MS/2 + 0,05 mg L⁻¹ de AIB (T2 y T7, respectivamente); sin embargo, en ambos tratamientos los microtallos solo desarrollaron en promedio tres yemas axilares, cantidad inferior a la obtenida en MS/4 + 0,05 mg L⁻¹ de AIB (T3) y MS/2 + 0,2 mg L⁻¹ de AIB (T5). El porcentaje de microtallos enraizados varió entre 13,3 y 90%; este último porcentaje se registró en T3, tratamiento en el que los microtallos alcanzaron una longitud de 5,2 cm y desarrollaron en promedio cinco yemas axilares.

Con frecuencia se ha señalado un efecto negativo de la reducción de las sales minerales del medio sobre el crecimiento in vitro de explantes, puesto que la función esencial de los micro y macronutrientes es mantener su crecimiento y desarrollo [46]; contrastando con lo anterior, en algunos de los tratamientos de este ensayo (T3 y T5) el comportamiento de las variables evaluadas muestra un efecto positivo de dicha reducción sobre la multiplicación de los microtallos de S. dolichosepalum, obteniéndose microtallos con longitudes de 5,2 y 6,0 cm, las cuales facilitaron la individualización de las yemas axilares neoformadas; conviene subrayar que los valores de longitud de microtallos resultaron semejantes al reducir las sales minerales del MS, tanto a ½ como ¼, superando la obtenida en el tratamiento control (MS). La respuesta de enraizamiento fue similar en los tratamientos agrupados por la reducción de sales minerales (¹/4 =T1-T4 y ½ =T5-T8); en cada grupo un solo tratamiento difirió estadísticamente de los demás, que es aquel en el que se obtiene el mayor porcentaje de enraizamiento, T3 y T8, con 90% y 80%, respectivamente; con respecto al enraizamiento, O'Connor-Sánchez y col. [44] reportaron que brotes regenerados de hojas de S. donianum enraizaron en mayor porcentaje en un medio con la mitad de la concentración original de sales MS y sin reguladores de crecimiento.

Ensayo 4. Efecto del carbón activado. La adición de carbón activado (CA) al medio de cultivo mostró un efecto significativo sobre la formación de callo basal y aunque no se observó una relación proporcional entre su concentración y el porcentaje de microtallos con callo, la presencia de CA en el medio de cultivo sí disminuyó dicho porcentaje (tabla 6). Teniendo como referencia los datos registrados en el tratamiento control (MS), concentraciones de 2,0; 1,5; 1,0 y 3,0 g/L de CA produjeron una disminución de 20, 30, 40 y 100%, respectivamente, de microtallos con callo. Aunque en presencia de 3,0 g L⁻¹ de CA el 100% de los microtallos no formaron callo, se observó clorosis y defoliación (figura 3a, b y c), respuestas semejantes a las obtenidas por Rosati y col. [47] en cultivos in vitro de brotes de Prunus silicina. Las variables longitud de microtallos, yemas axilares neoformadas y porcentaje de enraizamiento presentaron valores de 3 a 4,3 cm, 3 a 5 yemas axilares y 80 a 100% de enraizamiento.

La adición de CA al medio de cultivo es una práctica reconocida y su influencia sobre el crecimiento y desarrollo de explantes cultivados se puede atribuir a la adsorción de sustancias inhibitorias presentes en el medio de cultivo [48], la disminución de procesos de oxidación [49], la alteración del pH del medio a un nivel óptimo para la morfogénesis [50], y al mantenimiento de un ambiente oscurecido que simula las condiciones del suelo [51]; dicha influencia también se observó en este trabajo (tabla 6) y con efectos semejantes a los obtenidos por Borges y Sosa [52] en Dioscorea spp cuando adicionaron 0,5 a 2 g L⁻¹ de CA al medio MS para estimular crecimiento de nudos, hojas y tallos.

Ensayo 5. Efecto de la concentración de sales minerales y sacarosa en presencia de carbón activado. De acuerdo con los resultados de la prueba HSD Tukey (P≤0,05) la combinación de sales minerales MS reducidas o no a ½, con 20 ó 30 g L⁻¹ de sacarosaycon 3 g L⁻¹ ó sin carbón activado, mostró diferencias significativas para las variables longitud total del microtallo y número promedio de yemas axilares neoformadas, mientras que el porcentaje de microtallos con callo basal y enraizados mostró un comportamiento uniforme (tabla 7). Los microtallos con mayor longitud (5,3 cm) se desarrollaron en MS/2, con 30 g L⁻¹ de sacarosa y sin carbón activado (T7); en este tratamiento, cada microtallo formó en promedio cuatro yemas axilares y el 50% de los microtallos desarrolló callo basal y raíces. En MS, con 20 g L⁻¹ de sacarosa y sin carbón activado (T2) los microtallos alcanzaron 4,7 cm, formaron en promedio cinco yemas, tan solo el 30% mostró desarrollo de callo basal y el 90% desarrolló raíces. Estos resultados muestran un efecto proporcional de la concentración de la fuente de carbono sobre la formación de callo en la base del explante, ya que en aquellos tratamientos en los que se disminuyó la concentración de sacarosa a 20 g L⁻¹ (manteniendo la concentración original de sales minerales de MS) se obtuvo el menor porcentaje de microtallos con callo basal (T1 y T2) y, tanto la longitud total de microtallos como el número de yemas axilares neoformadas, presentaron valores de 4,1-4,7 cm y 4-4,9, respectivamente. Sin embargo, la disminución de sacarosa indujo el desarrollo de microtallos notoriamente delgados con escaso desarrollo radical, resultado que puede explicarse, en parte, por la función que cumple la sacarosa como fuente energética del metabolismo celular [53]. Téngase en cuenta que la sacarosa en concentraciones altas aumenta el crecimiento y vigor de hojas, tallos y raíces, mientras que en bajas concentraciones el desarrollo de los explantes es más lento y de menor vigor [46, 54]. Aunque la disminución de la concentración de sacarosa redujo notoriamente la formación de callo, no se consideró adecuada para la multiplicación de microtallos por su efecto negativo sobre los procesos de crecimiento y desarrollo de explantes.

Ensayo 6. Efecto de diferentes medios de cultivo. La utilización de diferentes medios de cultivo permitió observar diferencias significativas entre los datos registrados para las variables analizadas (tabla 8); en el medio H los microtallos alcanzaron la mayor longitud, 5,1 cm, formaron en promedio 4 yemas axilares, el 100% desarrollaron raíces y tan solo el 11,4% formó callo basal. En el medio B5 también se obtuvo un bajo porcentaje (20%) de explantes con callo, sin embargo, tanto la longitud total como el número de yemas axilares fueron los más bajos (2,2 cm y 1,4 yemas, respectivamente). En los medios restantes MS, Wh, WPM, A, AT, las respuestas alcanzaron valores intermedios en cada una de las variables evaluadas: la longitud total de microtallos entre 3 y 4,4 cm, el número de yemas axilares neoformadas entre 2 y 4, el enraizamiento entre 13,3 y 95% y, la formación de callo basal entre 85 y 100% de los microtallos cultivados. En el medio H con 2% de sacarosa se cuantificó el menor porcentaje de explantes con callo basal (3%) y las demás variables con valores adecuados para realizar una micropropagación exitosa. En contraste con los resultados obtenidos en el presente estudio, Lentini y col.[55] observaron que explantes de S. quitoense cultivados en medio A presentaron un desarrollo radical más temprano y abundante que el alcanzado en los medios H, AT y MS reducido a la mitad de su concentración original.

Por otra parte, en el trabajo realizado por Andrade y col. [31] con otras solanáceas silvestres, se determinó que para S. mammosum el medio adecuado para la multiplicación a través de segmentos nodales fue el A, mientras que, igual que para S. dolichosepalum, para S. marginatum, S. umbellatum y S. hirtum fue el medio H. La característica particular del medio H es la ausencia de mioinositol como fuente de carbono que usualmente se asocia con la estimulación del crecimiento de callos y suspensiones celulares [56], lo cual explica en parte, los bajos porcentajes de microtallos que formaron callo basal; además, la presencia de cantidades semejantes de ANA yBA (0,02 mg L⁻¹) en este medio mostraron ser concentraciones que permiten obtener valores de longitud total de microtallos, número de yemas axilares y porcentaje de enraizamiento adecuados para un proceso exitoso de micropropagación, ya que el efecto organogénico del ANA se ha observado, por ejemplo, en S. quitoense cultivado en medio MS con concentraciones por encima de 0,5 mg L⁻¹, en este medio se induce la formación de callos-masas con crecimiento continuo [57].

3.3. Aclimatización

A pesar de ser una etapa crítica de los procesos de micropropagación, en todos los sustratos utilizados en este trabajo para la aclimatización se cuantificaron altos porcentajes de plántulas viables, siendo el más adecuado la mezcla de tierra, capote y arena, 3:2:1 (figura 4). López y col. [58] y Díaz y col. [59] utilizaron esta mezcla junto con cascarilla de arroz y obtuvieron más del 90% de plántulas viables de Physalis peruviana. De acuerdo con Rache y Pacheco [29] el uso de capote (mantillo de bosque) durante la etapa de aclimatización favorece la viabilidad de plántulas con crecimiento sostenido y capaces de soportar el estrés producido por las condiciones propias del endurecimiento. Después de 60 días de aclimatización en invernadero las plántulas presentaron una apariencia vigorosa con crecimiento y desarrollo de hojas y yemas axilares, características adecuadas para ser utilizados como portainjerto de lulo de castilla.

4. Conclusiones

Se estableció un protocolo de micropropagación de S. dolichosepalum a partir de semillas cultivadas en MS/4, previamente esterilizadas con NaOCl al 10% (v/v) durante 15 minutos. La multiplicación de microtallos a través de segmentos nodales se realizó adecuadamente en medio H con 2% de sacarosa, suplementado con 0,02 mg L⁻¹ de ANA y 0,02 mg L⁻¹ de BA. Después de 30 días de cultivo los microtallos alcanzaron en promedio 4 cm de longitud con 4 yemas axilares; el enraizamiento de microtallos alcanzó 100% y fue simultáneo con la fase de multiplicación. La aclimatización en invernadero, utilizando como sustrato una mezcla de tierra, capote y arena, 3:2:1, permitió recuperar 100% de plántulas viables. Después que se ratifique el grado de tolerancia de S. dolichosepalum a Fusarium oxysporum, este protocolo, que es el primero para la especie, permitirá producir masivamente material injertado de lulo de castilla para el establecimiento de huertos comerciales.

Agradecimientos

A los integrantes del Grupo de Investigación BIOPLASMA-UPTC por la colaboración recibida durante el desarrollo de esta investigación, así como a la Dirección de Investigaciones, DIN, de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por los recursos económicos otorgados para tal fin.

Referencias

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