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1 Introducción
El cuerpo humano tiene la capacidad de generar sustancias antioxidantes que se encargan de contrarrestar el estado de estrés oxidativo [1], sin embargo, el consumo de alimentos ha sido recomendado debido al aporte nutricional y de biomoléculas que cuentan con capacidad antioxidante como los compuestos fenólicos y flavonoides [2], los antioxidantes en su gran mayoría los encontramos presentes en plantas, microorganismos, hongos y en algunos tejidos de animales, se ha comprobado que los antioxidantes presentes en las frutas y las verduras ayudan a la salud de las personas reduciendo el riesgo de contraer enfermedades tales como trastornos cardiovasculares, diabetes mellitus, obesidad, hiperlipidemia, cáncer, entre otras [3, 4], ya que son fuente de una gran variedad de antioxidantes naturales [5, 6, 7], que pueden ser utilizados para disminuir la oxidación de productos cárnicos [5, 8].
Los productos cítricos son fuentes importantes de aceite esenciales, carotenoides y compuestos fenólicos, que los convierte en recursos atractivos en la valoración agroindustrial como fuente importante de aditivos en la industria alimentaria [9, 10],sin embargo los compuestos fenólicos tienden a formar radicales libres, pero gracias a su capacidad antioxidante estos compuestos, inhiben la producción de radicales libres [11, 12], que a su vez proporcionan efectos beneficiosos en la salud humana, ya que estos pueden ayudar en el daño hepático y gástrico sufrido por la ingesta excesiva de alcohol y a la protección del intestino [13], es así como el presente estudio pretende evaluar la capacidad de inhibición de los compuestos fenólicos presentes en Citrus sinensis mediante la de degradación de un sustrato como el beta caroteno para ser aplicado en un producto cárnico embutido y así mismo conocer la posible aceptación sensorial.
Es así como el presente estudio pretende evaluar la capacidad de inhibición de los compuestos fenólicos presentes en Citrus sinensis mediante la de degradación de un sustrato como el beta caroteno para ser aplicado en un producto cárnico embutido y así mismo conocer la posible aceptación sensorial.
2 Materiales y métodos
El desarrollo de la investigación se dio en cinco etapas importantes, la primera etapa comprendió la adquisición y preparación del material, como segunda etapa, se llevó el secado del material vegetal, en una tercera fase se realizaron las pruebas de extracción mediante los métodos ultrasonido y el método de Soxhlet, como cuarta fase se realizó la determinación de los compuestos fenólicos por análisis por cromatografía, por último se realizó el análisis de la actividad antioxidante mediante la utilización de la solución β -caroteno, con la aplicación en un embutido cárnico y posterior análisis sensorial para la aceptación del producto.
La muestra tomada fue de 5,7 kg de naranja valencia de la cual se obtuvo 1500 g de material vegetal fresco (cascara de Citrus sinensis) a la cual se le realizó una adecuación para su procesamiento.
2.1 Obtención de harina de la cáscara de C. Sinensis
Se lavaron las cascaras con agua, adecuándose en pedazos de 0.5 cm por 0.5 cm hasta lograr un peso equivalente [14]. Posteriormente se pesaron, y se secaron a temperatura ambiente para su molienda, siendo esta de tipo artesanal [15], utilizando para ello un molino de granos tradicional corona, con el cual se obtuvo la harina. de la cual se generaron partículas con tamaños entre 250 y 850 uní.
2.2 Extracción de compuestos fenólicos utilizando dos métodos
Se realizaron las pruebas de extracción evaluando los métodos ultrasonido y el método de Soxhlet, con la finalidad de buscar el mejor rendimiento para la obtención del aceite. Para la extracción con ultrasonido se colocaron; 50 g de cáscara y 250 mL de etanol al 96% en un Beaker el cual se introdujo en un sonicador Branson 1800 serie CPXH en una relación 1:5 a temperatura de 25 °C. En cuanto a la extracción por Soxhlet, se colocaron 10 g de harina de cáscara de naranja en los cartuchos del equipo, para lo cual se midieron 200 mL de etanol al 96% en una relación 1:20, (10 g de harina y 200 mL de etanol), el cual se colocó en un balón a una temperatura de 250 80 °C, con un volumen inicial total de etanol de 400 mL realizándose dos repeticiones, posteriormente los extractos alcohólicos obtenidos se pasaron por evaporador rotatorio para concentrar las muestras obtenidas.
2.3 Determinación de los compuestos fenólicos
La determinación de compuestos fenólicos se realizó por cromatografía de alta eficiencia, en un cromató-grafo liquido (LC) Agilent Technologies 1200 Series (Palo Alto, California, EE.UU.), con un detector UV-Vis de arreglo de diodos (HPLC/DAD), a λ = 245 nm, La columna empleada en el análisis fue KINE-TEX (C18) (Phenomenex), 100 mm x 4.6 mm (d.i.) x 2.6 μm (tamaño de partícula), La inyección se realizó en modo automático (Viny = 10 μL), con gradiente de elución como se muestra en la Tabla 1. Para este análisis se tomó como referencia xantinas cafeína (Part N° C8960-250G, Sigma-Aldrich), teobromina (Part N° T4500-25G, Sigma-Aldrich) y teofilina (Part N° T1633-25G, Sigma-Aldrich); las catequinas (±)- catequina (C) (Part N° C1788-500MG, Sigma-Aldrich), (-)-epigalocatequina galato (EGCG) (Part N° E4143-50MG, Sigma-Aldrich), (-)-epicatequina (EC) (Part N° E1753-1G, Sigma-Aldrich), (-)-epicatequina galato (ECG) (Part N° E3893-10MG, Sigma-Aldrich), (-)- epigalocatequina (EGC) (Part N° E3768-5MG, Sigma-Aldrich); los flavonoides ácido caféico (Part N° C0625, Sigma-Aldrich), acido p-cumárico (Part N° C9008, Sigma-Aldrich), ácido rosmarínico (Part N° 536954-5G, Sigma-Aldrich), quercetina (Part N° Q4951-10G, Sigma-Aldrich), naringenina (Part N° N5893-1G, Sigma-Aldrich), luteolina (Part N° L9283-10MG, Sigma-Aldrich), kaempferol (Part N° K0133-50MG, Sigma-Aldrich), ácido ursólico (Part N° U6753-100MG, Sigma-Aldrich), pinocembrina (Part N° P5239, Sigma-Aldrich), ácido carnósico (Part N° C0609-10MG, Sigma-Aldrich) y apigenina (Part N° A3145-25MG, Sigma-Aldrich) a un flujo de 1 mL/min y temperatura de 35 °C.
2.4 Determinación de la actividad antioxidante
Un indicador importante para conocer las bondades antioxidantes de frutas y vegetales es el secuestro de radicales libres por polifenoles [16, 17], en este caso la actividad antioxidante se trabajó de acuerdo a la metodología de propuesta por [18], para lo cual se tomó 1 mL de solución de /3 -caroteno (0.4 mg/mL en cloroformo) evaporando hasta sequedad posteriormente se agregaron 0.02 mL de ácido linoleico, 0.2 mL de Tween 20 y 0.2 mL de los extractos crudos, agregándose 20 mL de agua oxigenada al 5%, se determinó su absorbancia a 470 nm, posterior a ello, las muestras se sometieron autooxidación térmica en baño a 50 °C, leyendo su absorbancia cada 10 minutos durante 120 minutos, preparando un estándar con ácido ascórbico y un control con metanol al 80%, además de un blanco con agua destilada. Para la evaluación de la actividad antioxidante en los extractos de la cáscara de naranja valencia se utilizó el método de decoloración del β -caroteno, en el cual, el valor de la actividad antioxidante se calculó teniendo en cuenta la ecuación propuesta por [19], como un porcentaje de inhibición relativa para el control, la actividad antioxidante (AA).
Tomando a R como la velocidad de degradación de la muestra control, A0 como la absorbancia de la muestra control en el tiempo cero y At como absorbancia de la muestra control en el tiempo t.
3 Resultados Y Discusiones
Del proceso de molienda seca realizada, se obtuvo la harina con partículas con tamaños entre 250 y 850 uní, lo que permite facilitar la extracción de constituyentes como aceites [20].
3.1 Extracción por ultrasonido
Para ello se realizaron tres extracciones, utilizando la relación 1:5 (50 g de cascara y 250 mL de etanol), con un volumen total inicial de 750 mL en etanol empleado, después de la sonicación y filtrado, para lo cual se obtuvo un volumen total de 610 mL, con un porcentaje de rendimiento del 81.3% m/v, este método se caracteriza por la agitación por ondas sonoras a través de un disolvente aumentando la presión que provoca una mejor penetración del disolvente al interior del sólido [21].
3.2 Extracción por Soxhlet
Al realizar la evaluación de los métodos se observó que el método de extracción Soxhlet obtuvo rendimiento de 89,5%, m/v en comparación con el ultrasonido el cual obtuvo un 81,3% m/v en rendimiento, que en relación a su absorbancia, la utilización de mayor cantidad de harina en ultrasonido permitió mayor absorción de etanol, con lo que se estableció una diferencia del 8.2% menos en relación a la extracción por Soxhlet lo que permitió mayor favorabilidad con este último.
3.3 Determinación cualitativa de compuestos fenólicos o antioxidantes
Para la determinación cualitativa de los compuestos fenólicos en las muestras se realizó la comparación de los tiempos de retención, t R los cuales se encuentran en la Tabla 2 y los espectros UV-Vis, utilizando una solución patrón de los ácidos fenólicos, xantinas, catequinas y flavonoides en una concentración conocida.
Las muestras de extracto C. sinensis obtenida por ultrasonido y Soxhlet, fueron analizadas por duplicado, las figuras 1 y 2 se observa el análisis obtenido por cromatografía de los extractos de cascara de naranja.
En la Tablas 3 y 4 se observan los tiempos de retención y área de los picos principales del cromatograma, del extracto de cascara de naranja.
Los compuestos fenólicos determinados mediante la extracción por ultrasonido tratamiento T1 y extracción por Soxhlet tratamiento T2 se reportan a continuación en la Tabla 5.
La mayoría de los compuestos fenólicos presentes en la naranja incluyen ácidos hidroxicinámicos (HCA) y flavonoides, entre los cuales flavanones son los más frecuentes [22], Cabe mencionar que la combinación de la acción de diversos polifenoles, con lleva a que estos actúen como antioxidantes, protegiendo a la salud humana [23,24], sin embargo, el contenido el contenido de estos compuestos fenólicos puede variar dependiendo la variedad del fruto [25].
3.4 Actividad antioxidante
La evaluación de la actividad antioxidante (AA) reporto mayor porcentaje en el extracto de naranja valencia obtenido por Soxhlet, con respecto al extracto obtenido con ultrasonido y el estándar (ácido ascórbico), alcanzando un valor porcentual de 91, 333%, como se evidencia en la Tabla 6.
Los antioxidantes analizados se mantuvieron en rangos similares con el método de decoloración del β -caroteno como se puede observar en la figura 3, obteniéndose la mayor y menor capacidad antioxidante en los extractos de la naranja valencia, indicando que el método de extracción influye directamente en la capacidad inhibidora de oxidación, siendo el método de extracción por Soxhlet, el de mayor eficiencia oxidante.
Figura 3 Actividad antioxidante de los extractos de la naranja valencia y el ácido ascórbico por el método de decoloración del β-caroteno.
El beta caroteno decolora rápidamente sin la presencia de un antioxidante, en caso contrario este neutraliza los radicales libres formados [26], lo que demuestra que, sin duda, la cáscara de cítricos son una fuente importante de antioxidantes naturales, pues las cáscaras tienen alta actividad antioxidante, pudiendo resultar un mejor sustituto, en lugar de los antioxidantes sintéticos, ya que este permiten alargar la vida útil de los productos alimenticios [27].
En cuanto a la aplicación de los compuestos fenólicos (Acido p-hidroxibenzoico, Ácido vanilico, Ácido cafeico ,Acido p-cumarico Ácido felurico) se realizó en un producto embutido crudo y fresco, teniendo en cuenta que son las condiciones más factibles en la producción de peroxidación lipídica de las grasas, lo que puede causar la oxidación y aparición de olores y sabores [28], para ello se aplicaron en tres prototipos en un producto cárnico, variando el antioxidante, inicialmente se empleó como aditivo antioxidante, ácido ascórbico en una muestra control y dos más en muestras en las que se utilizó como antioxidantes los compuestos fenólicos extraídos de la cascara de naranja valencia, en una proporción de 0.01% en masa, posteriormente se realizó un análisis sensorial a treinta personas a que se les presentaron tres muestras enumeradas las cuales fueron clasificadas en un escala sensorial como muy rancio, rancio, neutro, fresco, muy fresco. el análisis sensorial se empleó una escala para determinar el grado de rancidez de cada muestra.
Para la evaluación estadística se utilizó el paquete SPSS y se aplicó una prueba T (análisis de factor), donde se le asignó un valor a cada termino, en el que 1 equivale a muy rancio, 2 a rancio, 3 a neutro, 4 a fresco y 5 a muy fresco, en la Tabla 7 se aprecian los resultados obtenidos.
El análisis estadístico proporciono resultados que permitieron demostrar que para las tres muestras el promedio se encontró entre el rango neutro y fresco. Al comparar las muestras de antioxidante extraído de la cascara dela naranja valencia con respecto a la muestra control en la cual se empleó como antioxidante ácido ascórbico, el producto embutido con el extracto antioxidante obtenido por ultrasonido presento una diferencia promedio de 0,0666 a favor, mientras que en la muestra con antioxidante obtenido por Soxhlet fue de 0,23334 por debajo del control, como se evidencia en la Tabla 8.
Lo que demuestra que las variables son independientes desde el punto de vista estadístico, ya que su valor está por encima del rango 0,05, lo cual indica que no existe diferencia significativa entre las tres muestras de los productos embutidos.
4 Conclusiones
El análisis por cromatografía permitió identificar la presencia de cinco compuestos fenólicos por cada método utilizado, que mediante la decoloración del β-caroteno lo cual indican que los compuestos extraídos por los métodos ultrasonido y Soxhlet de la cascara de naranja variedad valencia, tiene una alta capacidad de inhibir la oxidación de un sustrato, comprobando que el método de extracción por Soxhlet es más eficiente, pues su rendimiento fue mayor en relación al método de ultrasonido, lo cual demuestra que existe una correlación entre la cantidad de compuestos extraídos y la capacidad antioxidante, permitiendo de esta manera determinar que el material vegetal de C. sinecis posee atributos que pueden ser aprovechados para su empleo en la industria cárnica, lo cual no afectaría las propiedades organolépticas de los productos elaborados.
