ORIGINAL

Efecto de gonadotropinas sobre la maduración y desarrollo embrionario de oocitos bovinos cultivados in vitro

Effect of gonadotropins on the maturation and embryo development of bovine oocytes cultured in vitro

Roger Salgado O,¹* M.Sc, Oscar Vergara G,¹ Ph.D, Leonardo Ramirez P,² MVZ

¹Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia.
²Ejercicio particular.

*Correspondencia: rdsalgado@sinu.unicordoba.edu.co

Recibido: Enero 20 de 2009; Aceptado: Agosto 20 de 2009.

RESUMEN

Objetivo. Evaluar el efecto de las hormonas FSH y LH sobre las tasas de maduración, fertilización y desarrollo embrionario in vitro. Materiales y métodos. Se utilizaron 1309 oocitos de ovarios de matadero, donde el medio base fue TCM-199 suplementado (FSH y LH) y se conformaron cuatro tratamientos al azar: T1: sin hormonas, T2: 50 µg/ml FSH + 150 µg/ml LH; T3: 100 µg/ml FSH + 100 µg/ml LH y T4: 150 µg/ml FSH + 50 µg/ml LH. Resultados. No se presentó efecto (p>0.05) de los tratamientos suplementados con FSH y LH sobre la tasa de maduración; por el contrario, T1 fue diferente (p<0.05) a los demás tratamientos. Se presentó efecto (p<0.05) entre los tratamientos suplementados con FSH y LH sobre las tasas de fertilización. La tasa de divisiones tempranas, no presentaron efecto (p>0.05) cuando el medio de maduración fue suplementado con FSH y LH. Conclusiones. La adición de LH en mayor proporción con respecto a la FSH en el medio de maduración induce una mayor tasa de maduración, fecundación y desarrollo embrionario in vitro a partir de oocitos bovinos recuperados postmortem.

Palabras clave: Oocito, FSH, LH, maduración in vitro.

ABSTRACT

Objective. To evaluate the effect of FSH and LH on the maturation rates, fertilization and embryo development in vitro. Materials and methods. 1309 oocytes were used slaughterhouse ovaries, where the basal medium was TCM-199 plus (FSH and LH) and four treatments were randomized: T1: no hormones, T2: 50 g / ml FSH + 150 g / ml LH; T3: 100 ng / ml FSH + 100 ng / ml LH and T4: 150 g / ml FSH + 50 g / ml LH. Results. No effect was found (p>0.05) from treatments supplemented with FSH and LH on the rate of maturation, by contrast, T1 was different (p<0.05) than the other treatments. Effect was presented (p<0.05) among treatments supplemented with FSH and LH on the rates of fertilization. The rate of early divisions, had no effect (p> 0.05) when maturation medium was supplemented with FSH and LH. Conclusions. The addition of LH to a greater extent with respect to FSH in maturation medium induces a higher rate of maturation, fertilization and embryo development in vitro from bovine oocytes recovered postmortem.

Key words: Oocyte, FSH, LH, in vitro maturation.

INTRODUCCIÓN

La producción de embriones bovinos in vitro trae consigo ventajas como el aprovechamiento de las hembras de alto valor genético para la obtención de gran cantidad de descendientes, disminución del intervalo generacional y por ende aceleración del mejoramiento y homogeneidad del componente genético de los hatos ganaderos. Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones debido a la baja habilidad de desarrollo al estadio de blastocitos de los oocitos mamíferos madurados in vitro (1, 2) ya que muchos de los factores que afectan el proceso de maduración in vivo aun son desconocidos (3).

Los componentes y las condiciones de los medios de cultivo pueden afectar la regulación meiotica de los oocitos mamíferos cultivados in vitro (4, 5). Las gonadotropinas hipofisiarias juegan un rol muy importante en la regulación de la maduración de los oocitos (6-8). La hormona folículo estimulante (FSH) actúa en la maduración in vitro a través de las células del cumulus, estimulando la producción de ácido hialurónico y la expansión de estas células, el cual facilita la capacitación espermática, mejorándose así la fertilización y el desarrollo embrionario (9). La hormona luteinizante (LH) estimula la progresión de la meiosis en el oocito del estado de profase a metafase II, en preparación para la fertilización, mediante un decremento del cAMP en el oocito, lo cual es necesario para la transición de profase a metafase (10-13).

Las hormonas LH y FSH, son comúnmente utilizadas en la suplementación de los medios de maduración ya sean independientes o en combinación y en diferentes concentraciones, lo que conlleva a variabilidad entre los resultados de diferentes investigaciones. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de las hormonas FSH y LH en diferentes combinaciones y concentraciones en la capacidad de desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de estudio. El estudio se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción animal "LABRA" de la Universidad de Córdoba, ubicado en el corregimiento de Berástegui, municipio de Ciénaga de Oro, Córdoba, Colombia. La zona se encuentra en un bosque húmedo tropical, altura de 10 msnm, temperatura promedio de 32°C, humedad relativa de 84% y precipitación anual de 1100 mm (14).

Recolección de ovarios y oocitos. Los ovarios fueron obtenidos en el matadero municipal de Cereté, Córdoba y transportados al laboratorio en solución salina (NaCl 0.9%) suplementada con 100 µg/ml de estreptomicina a 35°C. Los oocitos fueron colectados por el método de aspiración directa de los folículos que tenían entre 2 y 5 mm de diámetro con jeringa de 10 ml y aguja calibre 18. Una vez aspirados, el contenido de la jeringa fue depositado en una placa de petri de 90 mm para colectar y clasificar los oocitos grado I y II.

Maduración in vitro. Los oocitos fueron lavados en medio de maduración TCM 199 suplementado con 10% de SFB, 0.3 mM de piruvato de Na, 75 µg/ml de gentamicina y cultivados en gotas de 50 ml en grupos de 10 a 20, cubiertos con aceite mineral, incubados por 24 h a 38.8°C, 5% de CO₂ y humedad atmosférica del 96%, distribuidos al azar en cuatro tratamientos:

T1 = Sin suplemento de FSH y LH
T2 = Suplementado con 50 µg/ml de FSH y 150 µg/ml de LH.
T3 = Suplementado con 100 µg/ml de FSH y 100 µg/ml de LH.
T4 = Suplementado con 150 µg/ml de FSH y 50 µg/ml de LH.

Fertilización in vitro. Después de la maduración, los oocitos fueron lavados tres veces en medio de fertilización TAL FERT (TALP Caisson) suplementado con 10 µg/ml de heparina y PHE (0.25 mM epinefrina + 1 mM hipótaurina + 3 mM penicilamida). Los espermatozoides se obtuvieron a través del método de Swim-up y se le adiciono a cada gota de fertilización aproximadamente 1.5 x 10⁶ esperm/ml. Los espermatozoides y los oocitos fueron cultivados en gotas de 50 µl por 24 h a 38.8°C, 5% de CO₂ y humedad relativa del 96%.

Cultivo in vitro de embriones. Después de la fertilización, los presuntos zigotos fueron lavados en medio de desarrollo TCM-199 suplementado con 20% de SFB, 0.3 mM de piruvato y 50µg/ml de gentamicina. Luego se cultivaron en gotas de 50 ml (10 a 20 presuntos cigotos/gota) cubiertas con aceite mineral a 38.8°C, 5% de CO₂, y humedad relativa del 96%. El cultivo se continúo hasta el día 7 post-fertilización.

Evaluación de la maduración y fertilización in vitro. Para la evaluación de la maduración y de la fertilización, a los oocitos que se encontraban en MIV por 24 h o en FIV por 18 a 24 h, se les retiraron todas las células del cumulus y se procedió a montarlos en una lámina portaobjetos. Luego fueron sumergidos en solución fijadora (una parte de ácido acético/tres partes de metanol) por 24 horas. Posteriormente fueron teñidos con orceina al 2% en 45% de ácido acético de 10 a 15 min y fueron examinados en un microscopio de contraste de fase a 100X.

EVALUACION EMBRIONARIA

Evaluación embrionaria temprana (estado 2-8 células). La evaluación de la división embrionaria temprana se realizó de manera directa el día 3 del cultivo, (el día 0 fue el día de la fecundación), mediante observación con estereoscopio, se evaluaron las tasas de división de 2 a 8 células.

Evaluación embrionaria al estado de mórula-blastocito. La evaluación de la tasa de producción de embriones al estado de mórula (Mo) y blastocitos (B) fue realizada de forma directa en un estereoscopio, observando la cantidad que se encontraban en estos estados avanzados y clasificados en Mo compactas o blastocito, para poder determinar la tasa de producción de embriones para cada tratamiento.

Análisis estadístico. Los resultados correspondientes a la tasa de maduración, fecundación y desarrollo embrionario de los oocitos cultivados in vitro, fueron analizados a través de un análisis de varianza (ANAVA), y se establecieron diferencias significativas por medio de la prueba de Duncan.

RESULTADOS

Maduración in vitro. No se presentó efecto (p>0.05) en las tasas de maduración in vitro para T2, T3 y T4 respectivamente. Por el contrario, hubo efecto (p<0.05) para T1 con respecto a los demás tratamientos (Tabla 1).

Fertilización in vitro. Se presentó efecto (p<0.05) en las tasas de fertilización para T2. No hubo efecto (p>0.05) entre T3 y T4; sin embargo, fueron diferentes a los otros tratamientos. Las tasas de fertilización presentaron (p<0.05) para T1 comparado con los tratamientos suplementados con FSH y LH (Tabla 2).

Divisiones tempranas (2-8 células). No se presentó efecto (p>0.05) en las tasas de divisiones tempranas (2-8 células) para T2, T3 y T4 respectivamente. Mientras que hubo efecto (p<0.05) para T1 comparado con los demás tratamientos (Tabla 3).

Desarrollo embrionario al estado de mórula-blastocisto. No Hubo efecto (p>0.05) entre T2 y T3 sobre las tasas de desarrollo embrionario al estado morula-blastocito. Sin embargo T2 fue diferente (p<0.05) a los demás tratamientos; mientras que T3 y T4 fueron similares (p>0.05) pero diferente a T1 (Tabla 4).

DISCUSIÓN

Las tasas de maduración de los tratamientos suplementados con FSH y LH en las concentraciones y combinaciones utilizadas en el presente estudio estimularon altas tasas de maduración nuclear (87 a 92%). Ha sido demostrado que la LH o FSH sola o en combinación, induce altas tasas de maduración de oocitos bovinos in vitro. Resultados similares han sido comunicados por Ratto et al (15) quienes encontraron a concentraciones de 0.08 UI de h-FSH una tasa de maduración del 93%; Chohan y Hunter (16) 92% al utilizar 10 µg/ml de b-FSH y 10 µg/ml de b-LH; Boelhauve et al (17); 84% y 81.7% al utilizar 22 µg/ml de FSH ó 8 µg/ml de LH respectivamente.

En la ausencia de gonadotropinas (FSH y LH) solamente el 36.43 % alcanzó la maduración nuclear (Metafase II), lo cual indica la importancia de las gonadotropinas (FSH y LH) para una adecuada maduración in vitro (10, 18, 19). Este resultado podría ser explicado dado que los oocitos al ser extraídos de los folículos y cultivados en un medio adecuado, inician la maduración nuclear en ausencia de FSH y LH, debido a que son retirados los factores inhibidores de la meiosis presente en el líquido folicular (20-23). Resultados similares han sido reportados por Zuelke y Brackett (7), quienes obtuvieron 37.5% de maduración nuclear en ausencia de hormonas.

En este estudio se demostró que las mayores tasas de fertilización in vitro (81.81%) fueron alcanzadas cuando el medio de maduración contenía una mayor proporción de LH, lo que demuestra la influencia positiva de esta hormona sobre la tasa de penetración. Esto podría ser explicado por una mayor tasa de maduración nuclear que estaría favoreciendo cambios en la zona pelucida, específicamente a nivel de receptores ZP3, que son los responsables de la unión del espermatozoide al óvulo y participar en el proceso de fertilización (24-26). Resultados similares han sido comunicados por Ratto et al (15) y Chohan y Hunter (16), quienes obtuvieron una tasa de fecundación de 76.9% y 79.9% respectivamente.

Las tasas de fertilización para T3 y T4 fueron similares entre ellos, pero inferiores a T2 indicando el efecto (p<0.05) de la relación hormonal (LH y FSH), donde a medida que se disminuye la proporción de LH sobre FSH la tasa de fertilización in vitro se ve disminuida (Tabla 2). Resultado similar ha sido comunicado por Zuelke y Brackett (7) quienes obtuvieron 73.5%.

Los medios suplementados con hormonas tienen la capacidad de producir buenas tasas de maduración, fertilización y divisiones tempranas. Los resultados de las tasas de divisiones tempranas en los tratamientos suplementados con hormonas FSH y LH son similares a los comunicados por Chohan y Hunter (16) quienes obtuvieron una tasa de división de 49.4%. No obstante Ratto et al (15) y Choi et al (27) reportaron resultados superiores con tasas de 62.7% y 66.7% (en cocultivo de células oviductales y medio condicionado, respectivamente) y 84.3%; mientras que Younis et al (28) reportaron resultados inferiores 37.6% y 39.6% para el tratamiento con FSH y LH respectivamente. Por el contrario, una baja tasa de división se presentó cuando los oocitos fueron madurados en ausencia de hormonas FSH y LH lo que podría inferirse en la falta de adquirir la capacidad de desarrollo embrionario por ausencia del estímulo hormonal (FSH y LH) necesario para la adecuada reanudación de la meiosis (10, 27).

La mayor tasa de desarrollo embrionario al estado de mórula-blastocito (35.83%) fue obtenida a partir de oocitos madurados in vitro con una concentración de hormonas en el medio de maduración de 150 µg/ml de LH + 50 µg/ml FSH; siendo similar al tratamiento donde el medio de maduración se suplementó hormonalmente con 100 µg/ml de FSH y 100 µg/ml de LH, pero difiere (p<0.05) con los demás tratamientos. Sin embargo, cuando el medio de maduración fue suplementado con 50 µg/ml LH + 150 µg/ml de FSH no varió significativamente (p>0.05) del tratamiento suplementado con 100 µg/ml LH + 100 µg/ml FSH. Por el contrario, una baja tasa (10.15%) de embriones al estado de mórula/blastocisto fue observada en el medio de maduración sin la adición de hormonas FSH y LH.

La baja producción de embriones al estado de morula-blastocito (10.15%) en el tratamiento sin la adición de las hormonas FSH y LH podría ser explicado por fallas en la maduración citoplasmática, lo cual afecta la capacidad de desarrollo de los oocitos fertilizados hasta estos estadios embrionarios (20-22). Resultado similar fue hallado por Zuelke y Brackett (7), quienes obtuvieron una tasa de 7.9% en el tratamiento sin hormonas durante la maduración.

En conclusión, el presente estudio demuestra la influencia positiva que tienen las gonadotropinas hipofisiarias sobre las tasas maduración, fertilización y desarrollo embrionario in vitro, obteniéndose mejores resultados cuando la proporción de LH fue superior que la FSH en el medio de maduración.

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