INTRODUCCIÓN

Neospora caninum es un protozoario intracelular obligado, con características filogenéticas similares a Toxoplasma gondii, su ciclo de vida se caracteriza por la capacidad del parásito de formar quistes en el huésped y ocasionar enfermedad neuromuscular en los perros, sin embargo, los mayores efectos ocurren sobre la reproducción bovina, especialmente abortos y mortalidad neonatal, que ocasionan pérdidas económicas a la producción ganadera mundial ¹. Estudios experimentales, confirman que una vez el parásito alcanza el huésped, se mantiene en los perros domésticos y el ganado ². Los caninos, los coyotes, el oso gris pueden actuar como huéspedes definitivos del protozoario, mientras algunas aves y otros mamíferos lo hacen como huéspedes intermediarios ³.

Dentro de la epidemiología de N. caninum, los perros son huéspedes definitivos del parásito, eliminando ooquistes ⁴ que luego de esporular en el medio ambiente, se constituyen en la forma infectiva para el ganado y otros huéspedes intermediarios ⁵. El parásito puede ser trasmitido de forma horizontal o vertical, por varias generaciones, lo que hace que la enfermedad se perpetúe a través del tiempo ⁶. Otra forma de trasmisión es a través de la leche contaminada con taquizoitos ¹. Los perros afectados por N. caninum, especialmente en infecciones in útero, desarrollan desórdenes neuromusculares severos, con parálisis ascendente y sobre extensión de los miembros posteriores ⁷.

Respecto a la prevalencia general de Neospora caninum en bovinos, se reportan valores en Norte y Centro América de 24%, Suramérica 18%, Asia 15%, Europa 13%, África y Oceanía 8% ⁸, valores que son significativamente menores a los reportados en algunos lugares de Colombia (63 74%) ^9,10. A diferencia del conocimiento que se tiene sobre Neospora en bovinos en Colombia, en los caninos es escasa la información que permita reconocer la importancia del perro en la trasmisión del parásito a los bovinos, situación que se agrava por la inexistencia de vacunas comerciales efectivas para proteger a los animales susceptibles y evitar la posterior infección ¹¹.

El escaso conocimiento de estudios en caninos, pone en evidencia la necesidad de estimar la prevalencia de anticuerpos en regiones con reconocida actividad lechera, en donde los problemas reproductivos que ocasiona N. caninum podrían tener mayor impacto y por ende se desconocen, tal es el caso de Cumaral, Meta. En este municipio, se tiene cuantificada una población canina rural y urbana de 3.788 animales ¹².

El objetivo de este estudio fue estimar la seroprevalencia de N. caninum en perros de las áreas urbana y rural de Cumaral, Meta y determinar algunos factores asociados a la seropositividad. Esta información permitirá coadyuvar en el diseño de programas de control.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación y muestreo. Se hizo un estudio epidemiológico transversal en caninos del Municipio de Cumaral, situado en el Piedemonte llanero, del departamento del Meta, Colombia; Latitud 4°16'10"N y Longitud 73° 29' 11" W, altitud media de 452 msnm, precipitación de 3000 mm/año y temperatura media anual de 21°C (Figura 1). El municipio se encuentra rodeado por bosques tropicales, pasturas para el ganado, cultivos y bosques nativos ¹³.

Figura 1.Ubicación y mapa del municipio de Cumaral, Meta. Las letras en color verde corresponde a los sitios de muestreo del área urbana, y en rojo al área rural. 

El tamaño de muestra se determinó con Epidat 3.1 ¹⁴ con la siguiente fórmula:

Donde N: población estimada perros de Cumaral 3850

p: prevalencia hipotética a Neospora caninum 0.19

q: 1-p; 1-0.19= 0.81

Z: Confianza 95%: 1.96

EE: precisión: 0.05

n: 222 unidades de muestreo

Se efectuó un muestreo aleatorio estratificado por ubicación, rural y urbana, en nueve sitios del área urbana y cinco veredas del área rural.

Muestras e información. De cada animal se obtuvieron 5 mL de sangre por punción de la vena radial con aguja de 21Gx11/2 pulgadas, empleando tubos vacutainer^® (Becton Dickinson, USA) al vacío sin anticoagulante. Las muestras fueron transportadas en cadena de frío hasta el laboratorio de Reproducción y Genética Animal de la Universidad de Los Llanos y centrifugadas a 5000 g por 10 minutos. El suero fue extraído con pipetas estériles, fraccionado en alícuotas de 1 mL y conservado a -70°C hasta su análisis. Simultáneamente a la toma de las muestras, se diligenció el consentimiento informado y una encuesta epidemiológica mediante entrevista, sobre el sexo, edad, raza, talla, alimentación, ubicación y estado reproductivo de cada animal. Los grupos etarios se determinaron así: cachorros < 12 meses de edad, jóvenes 12 -24 meses, adultos > 24 meses.

Inmunofluorescencia indirecta para anticuerpos (IFAT). Se utilizó la prueba de IFAT para la detección semicuantitativa de anticuerpos contra la inmunoglobulina G (Laboratorios Fuller, Fullerton, California, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se realizaron diluciones de los sueros en solución buffer fosfato (PBS) en dilución única 1:16, cada pozo fue marcado con el número serial de la muestra y colocados 10 μL de suero y de los controles positivo y negativo. Las láminas se llevaron a incubación por 30 minutos en cámara húmeda a 37°C, luego de lo cual, fueron lavadas 3 veces con PBS agitándolas para eliminar el exceso de muestra, sin permitir el secado de las láminas. A cada pozo se adicionó 1 gota (10-15 μL) del conjugado (anti-IgG canina en conejo) y se llevó a incubación por 30 minutos a 37°C en cámara húmeda y cuarto oscuro. Las láminas fueron lavadas nuevamente 3 veces con PBS y se les adicionó 2-3 gotas de medio de montaje (glicerol 50% pH:7.2 más timerosal 0.0005%), se realizó montaje con una laminilla cubreobjeto y se inició la lectura en cuarto oscuro bajo microscopio a 400X (Olympus IX81, USA). Las muestras con reacción positiva, en la dilución única 1:16, fueron consideradas positivas.

Análisis estadístico. Se calculó la seroprevalencia para los factores fijos sexo, estado reproductivo, grupo etario, raza y talla y otros factores como: ubicación, alimentación, permanencia y trastornos reproductivos en bovinos con perros ubicados en predios con ganadería. Los intervalos de confianza de las proporciones se establecieron por el método de Wilson ¹⁵. Se realizó análisis de frecuencias por prueba de independencia, chi-cuadrado (x²) para establecer asociación o independencia entre los factores epidemiológicos y la respuesta serológica a Neospora caninum. La edad no presentó distribución normal (Kolmogorov, p<0.01) siendo evaluada la diferencia entre grupos, con prueba de Kruskall-Wallis (KW). El software empleado fue Epidat 3.1 ¹³ e IBM SPSS-25.

Aspectos éticos. Este estudio fue aprobado por el comité de Bioética de la Universidad de los Llanos con acta No 13 del 6 de diciembre de 2017.

RESULTADOS

La seroprevalencia general de anticuerpos IgG contra N. caninum fue 36.9% (82/222) (IC 95% 30.9-43.5). Las figuras 2A y 2B presentan una prueba positiva y negativa a IFAT para la presencia de anticuerpos IgG contra Neospora caninum.

Figura 2 Prueba de IFAT, A. Prueba positiva, obsérvese presencia de taquizoitos fluorescentes de Neospora caninum. B. Control negativo. Aumento 10X. 

No se presentaron diferencias para la edad, entre perros seropositivos y seronegativos (KW χ²: 1.501; gl: 1; Significancia 0.221) siendo de 36 meses en ambos grupos. La seroprevalencia en cachorros, jóvenes y adultos fue: 32.7, 40.0 y 37.4% respectivamente sin diferencias significativas entre grupos (Tabla 1).

Tabla 1 Factores fijos asociados con la seropositividad a Neospora caninum en perros de Cumaral, Meta. 

IC: Intervalo de confianza; χ²: Chi-cuadrado; gl: grados de libertad, Sig: Significancia

Los factores fijos: sexo, grupo etario, raza, talla y estado reproductivo, no se encontraron asociados a la seropositividad a N. caninum (Tabla 1).

Las proporciones de seropositivos en la zona urbana 38.4% y la zona rural 35.4%, no presentaron diferencias significativas entre si, igual resultado se observó para el tipo de alimentación y la permanencia de los animales en la calle o en la casa (Tabla 2).

Tabla 2 Otros factores asociados a la seropositividad a Neospora caninum en perros de Cumaral, Meta y factores asociados. 

IC: Intervalo de confianza; χ²: Chi-cuadrado; gl: grados de libertad, Sig: Significancia

El contacto de los perros con predios pecuarios, con bovinos como especie doméstica dominante, fue independiente del estatus serológico a N. caninum. La disposición correcta o inadecuada de placentas bovinas fue independiente del estatus serológico a N. caninum de los perros, no se presentó asociación de aborto bovino con perros seropositivos a N. caninum (Tabla 3).

Tabla 3 Factores relacionados con contacto con bovinos, asociados a la seropositividad a Neospora caninum en perros de Cumaral. 

IC: Intervalo de confianza; χ²: Chi-cuadrado; gl: grados de libertad, Sig: Significancia

DISCUSIÓN

El presente estudio demuestra, la presencia de anticuerpos contra el N. caninum en caninos de las áreas urbana y rural del municipio de Cumaral, Meta, lo que sugiere que las poblaciones han estado en contacto con el parásito y pueden representar un riesgo de trasmisión horizontal al ganado, ya que los caninos se consideran los huéspedes definitivos del parásito. Aunque no se observaron diferencias entre las dos poblaciones, diversos estudios señalan una mayor seroprevalencia en caninos de áreas rurales. En perros de Teherán (Irán) la prevalencia fue menor para ambas poblaciones que las encontradas en este estudio ¹⁶.

En el Noroeste de Italia mediante IFAT los valores de prevalencia fueron Perros Rurales (PR): (36.4%), (19.5%) y (9.9%) y Perros urbanos (PU): (20.2%), (10.6%) y (4.8%) para las diluciones 1:40, 1:80 y 1:160 respectivamente, resultados de difícil comparación con el presente trabajo que utilizó una única dilución 1:16. ¹⁷. Contrariamente en caninos que provenían de fincas del centro de Italia, la prevalencia fue mayor al 46% ¹⁸. En Brasil los perros del área rural tuvieron más riesgo de infección que aquellos de las áreas urbanas ¹⁹.

En Argentina, Basso et al ²⁰ reportaron una mayor prevalencia en perros de fincas lecheras (48%) y de ganado de carne (54.2%) que en perros de áreas urbanas (22.2%). En Japón, Sawada et al ²¹, evaluando perros de fincas lecheras reportaron una prevalencia de 31% vs 7% en perros del área urbana. En Holanda, Wouda et al ²² reportaron 23.6% en perros de fincas versus 5.5% en perros de áreas urbanas.

En otros estudios la prevalencia ha sido menor a la del presente reporte en ambas poblaciones de caninos, como lo observado en la provincia Henan, área central de China PR: (18%) y PU: (11.0%) ²³, en Chile en la IX región del país PR: (26%), PU: (12.5%) (p<0.05) ²⁴ y en el Estado de Yaracuy (Venezuela) PR: (20.6%) y PU: (5.1%) p<0.05) ²⁵. Independiente del origen de las muestras las prevalencias varían ampliamente entre regiones y países, así en Polonia y Alemania mediante ELISA se reportaron valores de un 21.7% y 7.3% de seropositividad a N. caninum, respectivamente ^26,27 y en Victoria (Australia) en perros domésticos mediante IFAT fué (32.9%) ²⁸.

En Colombia, un estudio realizado en el Rosal, Cundinamarca, se examinaron por PCR excretas de 60 perros, residentes en 30 fincas del sistema de lechería especializada, encontrando 21.6% perros y 33.3 % de los predios con DNA de Neospora caninum²⁹.

Si bien los anteriores estudios señalan una mayor prevalencia en los perros de fincas o de áreas rurales, que reflejan condiciones epidemiológicas distintas de las áreas urbanas, es posible que en este estudio, el no observar diferencias entre las dos poblaciones estudiadas se explique por diversas condiciones, entre ellas: la alta movilidad de los animales del área rural a la urbana y viceversa, favorecida por una estrecha contiguidad entre las dos zonas; el municipio de Cumaral, se encuentra rodeado de fincas, especialmente productoras de leche, donde los caninos eventualmente pueden deambular libremente, realizando la excreción de materia fecal y pudiendo consumir restos de placentas y fetos abortados. Otra explicación podría estar relacionada con la alimentación de los caninos en la zona urbana, en donde los habitantes tienen un alto consumo de carne y los sobrantes de dicha carne se utilizan para la alimentación de los caninos. Es conocido que la carne cruda o mal cocida puede contener los quistes del parásito y ser una fuente de infección ³⁰.

Otra hipótesis, podría estar relacionada con la trasmisión vertical del parásito, aunque en el estudio no se observaron animales con signos clínicos compatibles con neosporosis. En 50 caninos de consulta externa Veterinaria en la clínica Dover de Bogotá, y que presentaron al menos un signo neurológico, 12% animales fueron seropositivos a Neospora caninum por IFAT y ninguno presentó ooquistes en materia fecal ³¹. De igual forma en Inglaterra en un estudio en 373 hembras caninas el 13% presentaron títulos mayores de 1:50 por IFAT, el 50% de las crías nacieron seropositivas y posteriormente 25% de ellas desarrollaron enfermedad clínica compatible con neosporosis; tres perras produjeron en posteriores preñeces cachorros infectados ³².

Aunque no fueron estudiadas las crías de los animales seropositivos, la ausencia de formas clínicas de la neosporosis en los perros seropositivos puede estar relacionada con cepas de baja patogenicidad circulantes en el municipio de Cumaral, no obstante, son escasos los estudios a este respecto ⁶. De otro lado, existen pocos modelos animales disponibles para probar la variación en la patogenicidad, en un estudio bajo el modelo ratón algunas cepas de Neospora caninum fueron más patógenas ³³.

De igual forma, deben considerarse otras posibles fuentes de infección principalmente a través del contacto con especies silvestres, dado que el municipio y la región poseen una alta biodiversidad ³⁴. Previamente, se ha descrito la presencia de seropositividad a Neospora en carnivoros silvestres y otras especies silvestres incluyendo el dingo, coyotes, zorros colorados y aves ³⁵.

Respecto a la prueba de IFAT utilizada en el estudio, es considerada de elección para el diagnóstico de Neospora caninum³⁶. Campero et al ³⁷, analizando diversas pruebas serológicas encontraron una alta sensibilidad y especificidad (> 95%) y concordancia entre IFAT, Inmunobloting y ELISA-p38. En otra investigación la prevalencia de anticuerpos medidos por ELISA competitiva e IFAT no varió significativamente entre pruebas 32.9% y 29.8%, respectivamente ²⁶. Si bien es posible la presencia de reacciones cruzadas entre Neospora caninum con otros parásitos protozoarios como Toxoplasma gondii, en el caso de IFAT se consideran mínimas ³⁸.

Con respecto a la seropositividad de acuerdo con la edad, la mayor positividad fue observada en los animales jóvenes (40%) que coincide con los datos reportados, en perros de Victoria, Australia, sin embargo en el grupo de adultos se encontró la mayor prevalencia ²⁸. La raza, sexo y edad, no fueron factores asociados a la seroprevalencia, como se observó en caninos del área central de China ²³. Por el contrario en Polonia, la prevalencia fue mayor en las hembras que los machos (28.0% y 17.3% respectivamente p<0.05). Resultados similares al presente estudio, para las variables edad, sexo, raza y hábitos alimenticios ¹⁸.

Los resultados de este estudio, tienen un importante significado epidemiológico, puesto que cualquiera de los dos grupos de caninos representan un riesgo para el ganado bovino. Wouda et al ²², han observado en las fincas en donde los perros conviven con el ganado, un aumento en el riesgo de infección con Neospora, lo cual sugiere una vigilancia permanente frente a la infección y la enfermedad, y la necesidad de una educación continua a los profesionales, mayordomos, propietarios de ganado y de las mascotas.

Se concluye que la seroprevalencia es alta sin diferencias entre los perros del área urbana y rural que sugiere que han estado en contacto con el parásito, posiblemente por diferentes fuentes de infección que requieren ser estudiadas como las posibles implicaciones de trasmisión horizontal para el ganado.