Material genético

Se colectaron 10 hojas jóvenes de cada uno de 43 árboles de aguacate en los municipios de Tepic (21°55'60''N, 104°94'70''O), Xalisco (21°42'55''N, 104°89'18''O), San Blas (21°33'56''N,105°10'59''O), Tecuala (22°39'92''N, 105°44'85''O) y Compostela (21°25'09''N,21°25'09''N), con una altitud de 950, 1.324, 53, 19 y 190 m s.n.m., respectivamente, de huertos familiares, de traspatio y de árboles silvestres; además, se utilizó como testigo un aguacate variedad Hass (tabla 1).

Tabla 1 Identidad y procedencia de colecta de genotipos criollos de aguacate en el estado de Nayarit 

Fuente: Elaboración propia

Caracterización molecular

La extracción de ADN se llevó a cabo con 400 mg de hojas liofilizadas de cada árbol, de acuerdo con el método descrito por ^{Clarke et al. (1989)}. La integridad del ADN extraído se evaluó por electroforesis en geles de agarosa al 1 % y se observó en un transiluminador ultravioleta (UVP Benchtop). La cuantificación del ADN se realizó en un nanodrop (Jenway, UK). Las muestras de ADN se diluyeron a 10 ng/µL y se almacenaron a -20 °C para su posterior uso. Para la amplificación del ADN se realizaron pruebas con ocho iniciadores de ISSR reportados por ^{Cuiris-Pérez et al. (2009)}, usados en el presente estudio (tabla 2). La reacción de amplificación consistió en 4,0 µL de ADN genómico (40 ng), 1,5 µL mezcla de dNTP, 2,0 µL de iniciadores ISSR (1,0 µM), 2,2 µL 1X taq buffer, 0,2 µL ADN taq polimerasa (1 U/mL), 0,8 µL MgCl₂ (2,0 mM) y 9,3 µL de ddH₂O. La PCR se llevó a cabo en un termociclador SelecCycler.

Tabla 2 Lista de iniciadores utilizados en el análisis molecular y sus respectivas secuencias 

Fuente: Adaptado de ^{Cuiris-Pérez et al. (2009)}

Análisis de datos

Con los datos generados por ISSR se generó una matriz binaria de unos y ceros, para la presencia (1) y ausencia (0) de cada una de las bandas en cada genotipo. La relación de similitud genética entre las poblaciones estudiadas fue estimada por el método de pares no ponderados con media aritmética (UPGMA) usando el método de Dice. Los datos de la matriz binaria fueron analizados por software Sistema de Análisis Multivariado y Taxonómico Numérico (NTSYS).

Los datos de la matriz para diversidad genética de poblaciones fueron analizados usando el programa TPFGA (^{Miller, 1997}), utilizando las distancias genéticas de ^{Nei y Li (1979)}. La diversidad genética de las poblaciones se cuantificó de acuerdo con el número de alelos por locus (A), el porcentaje de loci polimórfico (% P), heterocigosis observada (Ho), heterocigosis esperada (He), el Índice de Diversidad (ID) y AMOVA, se realizó un análisis con el programa TPFGA y GenAlEx (Genetic Analysis in Excel) v. 6.4.

Se realizó una prueba de estructura genética mediante un análisis bayesiano de asignación de individuos, en el que de una a cinco poblaciones podían estar agrupadas. El programa fue ejecutado usando 100.000 iteraciones de MCMC (cadenas de Markov Monte Carlo), 10.000 réplicas y 10 repeticiones para cada K, empleando el programa de STRUCTURE 2.3.4. (^{Evanno et al., 2005}).

Nivel de polimorfismo

Los ocho iniciadores del tipo ISSR utilizados en 43 genotipos de aguacate criollo, pertenecientes a cinco municipios, amplificaron un total de 82 loci. El número de bandas detectadas fue desde 12 hasta 17. Otros investigadores reportan que los iniciadores utilizados para aguacate amplificaron entre 15 y 17 bandas y alta heterocigocidad, como sucedió en este estudio (^{Galindo et al., 2011}). En relación con la información del contenido de información de polimorfismo (PIC) detectado para cada una de las secuencias reportadas, en esta investigación los resultados indican que el PIC fluctuó de 36 a 94 % (tabla 3). En general, el PIC promedio fue del 63,82 % detectado con este tipo de secuencias, considerado moderado. Los resultados obtenidos en este trabajo son muy similares al trabajo realizado por ^{Cuiris-Pérez et al. (2009)}, donde obtuvieron un promedio de 92,64 % con 231 genotipos y siete iniciadores. Este tipo de secuencias es considerado alto, por lo que los ISSR son adecuados para estudios de diversidad genética en aguacate.

En contraste, ^{Álvarez et al. (2018)} reportaron un PIC promedio de 31,7 % al utilizar marcadores RAPD, mientras que ^{Bharad et al. (2009)} reportaron hasta un 73 % y ^{Salazar et al. (2010)}, reportaron un 87 % utilizando isoenzimas. Por otra parte, la diversidad genética (ID) promedio en este trabajo fue del 64 %, muy similar a lo observado por ^{Ashworth y Clegg (2003)}, quienes reportaron un promedio de diversidad genética del 60,7 % cuando analizaron 35 cultivares de aguacate y dos parientes silvestres por medio de marcadores microsatélites, pero es bajo comparado con lo observado por ^{Álvarez et al. (2018)}, quienes informaron valores del 84 %.

Tabla 3 Parámetros de diversidad genética del aguacate criollo (Persea americana) en cinco localidades muestreadas en Nayarit, México 

Fuente: Elaboración propia

En relación con la heterocigosidad esperada (He) en las diferentes localidades, Tepic, Xalisco, San Blas y Tecuala presentan valores muy similares con un promedio de 0,33, mientras que Compostela tuvo un valor de 0,17 valor considerado bajo. Por otra parte, la heterocigosidad observada (Ho) en la población tres presentó un promedio de 0,34, el más alto de todas las poblaciones, mientras que el menor valor fue de 0,14, correspondiente a la población cinco (tabla 3). En un trabajo similar realizado por ^{Ponce (2013)} en los valles interandinos de Ecuador, se obtuvo una heterocigosis observada (Ho) de 0,64, mientras que la heterocigosis esperada (He) fue de 0,74, el cual arroja valores altos; si se considera que la heterocigosis es una medida de la diversidad genética, estos índices indican moderada diversidad genética en Nayarit, especialmente si se compara con trabajos similares, como el de ^{Ashworth y Clegg (2003)}, quienes obtuvieron heterocigosidad de 0,63.

Los datos obtenidos del AMOVA se resumen en la tabla 4, los cuales mostraron que la diferencia entre localidades es baja (18 %), mientras que la variación dentro de cada localidad (82 %) es amplia; ^{Cañas-Gutiérrez et al. (2019a)} obtuvieron resultados similares, y mostraron que la mayor parte de la variación genética ocurrió dentro de (94,5 %) en lugar de entre (5,44 %) municipio, donde sugiere que los aguacates de esa parte de Colombia son genéticamente distintos según el sitio muestreado. Esto concuerda con las relaciones genéticas, es decir, con la agrupación en cada uno de los nodos que está definida por su localización o condiciones climáticas. Estos resultados se deben a las diferencias genéticas que hay en la colección de trabajo de aguacate, debido a la gran variabilidad de criollos que pueden existir. Asimismo, estos resultados son similares a los obtenidos por ^{Ponce (2013)}, cuyos datos obtenidos del AMOVA mostraron una diferenciación de 17 % procedentes de las diferentes provincias, y el 83 % de la variación observada entre individuos. Esos resultados se deben a las diferencias genéticas que hay en la colección de trabajo de aguacate debido a materiales introducidos de otros países.

Tabla 4 Resultados de análisis molecular de varianza 

Fuente: Elaboración propia

Relaciones genéticas

De acuerdo con el análisis de agrupamiento generado por aguacates criollos podemos decir que, debido a la polinización cruzada que posee, no se conformaron grupos bien definidos, pero se observa que dentro de los grupos se unen por localidades. ^{Galindo-Tovar et al. (2011)} mencionaron que, debido a la gran variabilidad fenotípica y a los híbridos entre las diferentes variedades de aguacate, la identificación de genotipos mediante microsatélites ha resultado ambigua, por lo que ha sido difícil designar la composición racial. El dendograma generado muestra cuatro grupos principales (figura 2).

En el grupo I se integraron los genotipos de cinco localidades: Tecuala (Tec 1,2,4,5,6,8,9), San Blas (CV-3 y 4, JCC-1), Xalisco (SC, DCR-C y EP), Las Varas (JR, MJ, JF) y Tepic (AG-7 y 8, SPV, PA, MOC-1); los municipios de Tecuala y San Blas tienen la característica en común de altitud (24 a 13 m s.n.m.), clima subtropical y predominancia de suelos tipo solonchak; Tepic y Xalisco tienen una altitud entre 950 a 1.400 m s.n.m. y Compostela de 190 m s.n.m., con predominancia de suelos tipo luvisol y cambisol, y con un clima tropical. Podemos ver que los materiales dentro de este grupo se asocian debido a su localización geográfica. En ese sentido, ^{Ohsawa e Ida (2007)} indicaron que la altitud es un referente para estimar la diversidad genética, pues un alelo en particular permite mostrar diferencias entre poblaciones, como resultado de la selección natural sobre la altitud.

El grupo II se formó con tres localidades: Tepic (AG-9, PCC, MOC-3), San Blas (AN-1 y 2, PP-1, 2 y 3, CS, CV-1 y 2) y Xalisco (JGN-3, ML-1, JB y DCR-L), y el grupo III, por Tepic (SET, EM), San Blas (J-C-1) y Xalisco (LL y G2). Estos dos grupos son muy similares en agrupación de localidades, debido a que tienen una altitud y temperaturas afines y el municipio de San Blas está ubicado en la zona costera del estado a una altitud de 53 m s.n.m., lo que concuerda con lo reportado por ^{Cuiris-Pérez et al. (2009)} y ^{Rodríguez et al. (2003)} quienes trabajaron con diversidad genética dentro de una colección de germoplasma en Cuba y México. Estos autores comentan que, por las características de los ISSR, pueden identificar fragmentos más específicos, por lo que podrían compartir similitudes en el interior de su genoma, aun cuando estos pueden tener diferente origen geográfico. En el grupo IV el genotipo Hass quedó separado de la mayoría de los genotipos encontrados en los grupos antes mencionados, excepto Tec-3, lo que puede indicar que estos dos genotipos pueden ser similares. El aguacate Hass se utilizó como referencia para observar la diferencia genética que existe entre un aguacate criollo y un cultivar conocido.

Los resultados obtenidos en esta investigación coinciden con los reportados por ^{Cañas- Gutiérrez et al. (2015)} quienes, al realizar la caracterización morfológica y molecular con marcadores AFLP de 111 cultivares de criollos y comerciales de aguacate (P. americana) en Colombia, encontraron altos niveles de heterocigocidad, y la distancia genética produjo tres agrupaciones que incluyeron individuos que se encontraban con gran cercanía y similares condiciones geográficas. Asimismo, Cañas-Gutiérrez et al. (^2019a, ^b), utilizando marcadores microsatélites SSR en aguacates criollos de Colombia, sugieren que la estructura del aguacate en Antioquia se debió a diferencias en las condiciones agroecológicas de la zona estudiada. ^{Álvarez et al. (2018)}, en su evaluación molecular del aguacate criollo (P. americana) en Nuevo León, México, utilizando marcadores RAPD, encontraron dos grandes grupos que también se asociaron por su origen geográfico, agrupándose materiales de la región norte, por una parte, y de la región sur, por otra; dichas regiones presentan condiciones agroecológicas diferentes.

A su vez, en un estudio de ^{Reyes et al. (2013)} de distinción de especies el género Persea utilizó ISSR, se agruparon algunos individuos con características en común como individuos de la raza Mexicana, individuos de la raza Guatemalteca, y a P. lingue. P. indica del subgénero Eriodaphne, lo que indica la marcada falta de afinidad entre las especies e híbridos tanto del subgénero Persea (con excepción de las razas de P. americana) como de Eriodaphne. ^{Talavera et al. (2019)} realizaron un estudio en España donde utilizaron 71 accesiones de las tres razas: Mexicana, Guatemalteca y Antillana, utilizando marcadores SNP; en dicho estudio se obtuvo un valor de Ho bajo (0,16) respecto al marcador molecular SSR. Estos marcadores utilizados separaron ampliamente las accesiones estudiadas según su raza botánica.

De acuerdo con ^{Ashworth y Clegg (2003)}, las condiciones de agrupamiento de las localidades muestreadas se explican por la complejidad del estado híbrido de los aguacates, debido a la antigua hibridación de la especie o a una diferenciación racial más reciente de lo que se ha supuesto. Esto, aunado a la antigua relación del aguacate con el hombre y a las diferentes condiciones de domesticación (^{Galindo-Tovar et al., 2008}), ha resultado en una gran diversidad de genotipos de afinidades genéticas difíciles de separar, mostrada por los individuos colectados en esta investigación. Hay cierta agrupación en este estudio, por lo que ^{Galindo-Tovar et al. (2011)} comentan que la integración de un grupo de aguacates refleja la interacción geográfica de cuatro localidades ubicadas en un área geográfica definida por características similares, de suelo, tipo de vegetación y clima, aunque con variantes de precipitación pluvial y temperatura.

Lo anterior es de particular interés para el aguacate criollo en Nayarit, cuyo problema para su comercialización es la corta vida de anaquel del fruto, por lo que al encontrar variación genética se incrementa la posibilidad de generar nuevos materiales; asimismo, se podrían aprovechar la característica de los aguacates nativos recolectados para generar variedades con alto contenido de aceite, por arriba de lo registrado en variedades comerciales como el Hass, lo que coincide con investigaciones realizadas en variedades criollas recolectadas en Colombia (^{Álvarez et al., 2018}).

Los resultados de Structure muestran 4 grupos (k = 4). En la figura 2, cada individuo está representado por una barra, que contiene de 1 a 4 colores. Cada color representa un grupo y el mayor porcentaje de asignación de color que contiene la barra es lo que indica a que grupo pertenece cada individuo (figura 2b). Se calcularon la Fst 1 de 0,4250, Fst 2 de 0,6948, Fst 3 de 0,4069 y Fst 4 de 0,5547, para los cuatro grupos. Los valores indican que los individuos de los grupos 1 y 3 están menos relacionados entre sí respecto a los grupos 2 y 4. Estos resultados son un apoyo al árbol UPGMA, demostrando que en el aguacate criollo existen diferencias genéticas entre ellos. ^{Galindo-Tovar et al. (2011)} realizaron un estudio de estructura poblacional con 60 accesiones de 7 municipios de Veracruz, analizados con marcadores microsatélites SSR; además, identificaron dos grupos con un Fst promedio de 0,2782 y concluyeron que en los dos grupos hay poca diferenciación genética entre sus individuos por los valores de Fst.

^{Chen et al. (2009)}, quienes estudiaron la estructura poblacional del centro de México con aguacate silvestre, encontraron dos grupos que se distinguieron por la elevación y latitud de origen. Es difícil conocer con exactitud a qué raza pertenece cada genotipo por falta de control de razas puras y, posiblemente, los genotipos estudiados sean mezclas de razas. Los autores mencionan que los cultivares modernos son mezclas complejas e inexactas de las tres razas, debido al largo periodo de polinización abierta e hibridación interracial.

Fuente: Elaboración propia

Figura 2 (a) Dendograma formado a partir de distancia de Dice de los 43 genotipos de aguacate (Persea americana) criollo obtenido mediante ocho primers (ISSR) y (b) representación gráfica de la estructura genética de las seis poblaciones donde los grupos genéticos (K) están indicados por los colores sobre el eje X