Introducción

La papa, Solanum tuberosumL. (Solanaceae), es originaria de los Andes y ha sido cultivada desde hace más de 7.000 años (^{Román et al., 2015}). Es uno de los cultivos alimenticios más importantes en el mundo después del arroz, el maíz y el trigo (^{Zhang et al., 2017}). China es el mayor productor mundial de papa, seguido de Rusia, India, Ucrania y Estados Unidos (^{Food and Agriculture Organization [FAO], 2018}). En Ecuador, la producción de papa en el 2019 fue de 275.346 toneladas, cultivadas en 19.675 hectáreas, con un rendimiento promedio de 13,99 t/ha (^{Instituto Nacional de Estadística y Censos [INEC], 2019}).

El cultivo de papa puede ser afectado por factores bióticos y abióticos que reducen la producción y afectan la calidad del producto (^{Dahal et al., 2019}; ^{Mohanta et al., 2017}). Una de las principales enfermedades que afecta la papa en el mundo es el tizón tardío, provocado por el oomicete Phytophthora infestans, que puede destruir los cultivos en pocos días si no se toman acciones (^{Fry et al., 2015}; ^{Lenman et al., 2016}), y que provoca grandes pérdidas económicas que llegan a 3,5 billones de dólares anuales en países en vías de desarrollo y más de 5 billones en todo el mundo (^{Plich et al., 2016}).

Phytophthora infestans(Mont.) de Bary pertenece al filo Oomycota, orden Peronosporales, familia Peronosporaceae (^{Subhani, 2016}). Las paredes celulares contienen celulosa y β-glucanos, y no pueden sintetizar esteroles. Los oomicetes evolucionaron dentro del reino eucariota de Stramenopila, que incluye algas marinas, como diatomeas, y algas pardas (^{Jiang & Tyler, 2012}). Los primeros reportes de patogenicidad en solanáceas fueron a mediados del siglo XX y su descubrimiento en el siglo XIX (^{Michalska et al., 2016}). Existen más de 150 especies conocidas de Phytophthora a nivel mundial y todas son patogénicas, colonizan diferentes estructuras de las plantas hospederas como raíces, tubérculos, follaje, frutos y tallos herbáceos y leñosos (^{Chepsergon et al., 2020}; ^{Yang et al., 2017}).

Durante el ciclo de infección, el patógeno produce esporangios multinucleados y las zoosporas uninucleadas móviles. P. infestansmuta permanentemente, apareciendo nuevas y agresivas variantes denominadas razas(^{Whisson et al., 2016}). Estas mutaciones del patógeno se deben a la presión de selección, en parte por el uso indiscriminado de fungicidas sistémicos y a la dispersión de los materiales comerciales de solanáceas a diferentes latitudes del mundo (^{Hwang et al., 2014}). Phytophthora infestanses heterotálico debido a que tiene dos tipos de apareamiento (A1 y A2) (^{Chowdappa et al., 2015}). En Ecuador, se ha identificado solo el apareamiento A1 (^{Delgado et al., 2013}; ^{Forbes et al., 1997}). La diferencia no se basa en un dimorfismo sexual, sino en la autoincompatibilidad y la necesidad de la presencia del tipo de apareamiento opuesto para generar una respuesta hormonal y formar las estructuras de reproducción sexual, las oosporas (^{Alor, 2015}). Por otra parte, las estructuras de reproducción asexual, los esporangios, germinan en agua libre y a bajas temperaturas (13-21 °C), liberando zoosporas uninucleadas y biflageladas (^{Yitagesu, 2019}).

En humedad relativa (90%), las zoosporas desarrollan un tubo germinativo y penetran la hoja por las estomas o los apresorios; una vez en el interior del tejido de la planta, el micelio forma haustorios en el interior de las células (^{Pérez & Forbes, 2008}; ^{Yitagesu, 2019}). Los esporangios se dispersan fácilmente a través del viento y la lluvia, y pueden sobrevivir en residuos vegetales (^{García et al., 2016}; ^{Hwang et al., 2014}). En promedio, el ciclo asexual de los esporangios es de cinco días (^{Fry, 2008}). En el campo, el patógeno se multiplica varias veces durante el ciclo del cultivo, produciendo millones de esporas y un incremento permanente de la enfermedad, pudiendo eliminar al cultivo en diez días en condiciones favorables para el patógeno (^{Sun et al., 2016}).

La virulencia de una raza de P. infestanses la habilidad genética para vencer la resistencia del hospedante (genes R), mientras que la agresividad es el daño que causa el patógeno al hospedero en un determinado tiempo. La resistencia del hongo a fungicidas sintéticos se determina por la disminución de la sensibilidad como resultado de mutaciones (^{Pérez & Forbes, 2008}). Los síntomas del tizón tardío en las hojas presentan manchas irregulares necróticas marrones, con apariencia húmeda, no limitadas por nervaduras. Las manchas al inicio aparecen en el borde y ápice del foliolo, mientras que en el envés está el micelio, que contiene los esporangióforos, y estos a los esporangios, produciendo la muerte del tejido debido a la expansión y necrosis (^{Pérez & Forbes, 2008}). Cuando afecta a los tubérculos, estos se decoloran en la superficie, presentando depresiones necróticas irregulares que ocasionan la pudrición seca en el interior y que dan lugar al ingreso de patógenos secundarios como bacterias y hongos (^{Alor, 2015}).

El control del tizón tardío se recomienda a través del manejo integrado, considerando la resistencia genética, prácticas culturales y el control químico (^{Moncayo et al., 2019}). Dentro de la resistencia genética está la reacción de hipersensibilidad, que es un tipo de defensa activa de las plantas, ya que reacciona tan pronto como el patógeno intenta invadirlo (^{Niks et al., 2019}). El mejoramiento genético permite desarrollar variedades resistentes, mediante el uso de fuentes de resistencia de las variedades cultivadas, nativas, materiales introducidos, en especies emparentadas y silvestres (^{Gabriel et al., 2016}). La resistencia puede ser dada a través de genes mayores (R), que se incorporan a las variedades; sin embargo, esta resistencia puede ser de corta duración, debido a la especificidad y mutación del patógeno (^{Rubio et al., 2016}). Esto permitió a los fitomejoradores desarrollar materiales con resistencia parcial (genes menores). No obstante, es difícil reconocer plantas con un nivel sustancial de resistencia, debido a la herencia poligénica (^{Niks et al., 2019}).

Estudios genéticos han revelado que los genes menores y mayores pueden encontrarse en locisimilares dentro del cromosoma e, incluso, ser alelos del mismo gen (^{Abou-Taleb et al., 2010}). Para diferenciar ambos tipos de resistencia, se pueden usar marcadores moleculares asociados a QTL para los genes R. De acuerdo con ^{Lebecka y Sobkowiak (2013)}, ^{Michalska et al. (2016)}, ^{Njoroge et al. (2019}) y ^{Vleeshouwers et al. (1999)}, otra forma de evaluar la resistencia es mediante los componentes de la resistencia misma, que considera el área de la lesión (AL), la tasa de crecimiento de la lesión (TCL), el periodo de latencia (PL), la intensidad de esporulación (IE) y el periodo de incubación (PI). Estas evaluaciones pueden realizarse en campo y en condiciones controladas (^{Rubio et al., 2016}).

Esta investigación tiene como objetivo evaluar la resistencia genética de P. infestansmediante los componentes AL, TCL, PL, IE y PI, en clones bajo condiciones de laboratorio e identificar la relación entre los componentes para su uso en programas de mejoramiento para resistencia.

Materiales y métodos

El presente trabajo se desarrolló en los invernaderos y laboratorios de la Estación Experimental Santa Catalina, del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en la provincia de Pichincha, Ecuador, a una altura de 3.065 m s.n.m., ubicados en las coordenadas 78°33′6,19″O, 00°22′02,91″S. En el estudio se evaluaron cinco variedades mejoradas comerciales y veintitrés clones del Programa de Mejoramiento de Papa del INIAP (tabla 1). La siembra se realizó en invernadero (temperaturas máxima y mínima en promedio de 28 °C y 7 °C, respectivamente; HR: 70%), en macetas con sustrato desinfectado al vapor, con un tubérculo por maceta. El manejo agronómico de enfermedades y nutrición de las plantas de papa se realizó con base en el protocolo del Programa de Papa del INIAP (^{Cuesta et al., 2020}), excepto para P. infestans.

Para las inoculaciones, se utilizó un aislado de una raza compleja con once factores de virulencia de P. infestans(1, 2, 3… 11), obtenida en campos de producción de papa de la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP. Para ello, se recolectaron muestras de las hojas infectadas (con una sola lesión). Las hojas se colocaron en cajas Petri de plástico con tapa, a temperatura ambiente (14 °C-16 °C) y a 90% de HR, para favorecer la esporulación. Cuando el micelio fue visible, se aisló el patógeno y se sembró en cajas Petri con medio de cultivo agar- centeno combinado con una solución de bactericidas (vancomycin, plymixin B, ampicillin, rifampicin) y fungicidas (pentaclorinitrobenceno y benlate).

Se mantuvieron las cajas Petri en incubación a 15 °C-18 °C por cinco días hasta que el desarrollo de micelio fue suficiente para multiplicar y purificar la muestra, sembrando en nuevas cajas Petri con el mismo medio de cultivo y tomando micelio de la parte superior en los puntos de esporulación más abundantes, con apariencia blanca y homogénea, sin contaminación visible. Se realizó esta multiplicación hasta que el crecimiento del micelio del aislado dentro de los cinco días de incubación fue homogéneo y la esporulación abundante, asegurando que el aislado estuviera vivo y mantuviera su virulencia hasta ser utilizado en la evaluación.

Previo a la inoculación de los foliolos, se realizó una solución a partir del aislado almacenado con la que se inocularon las hojas sanas de la variedad Superchola (susceptible), que previamente se desinfectaron sumergiéndolas en una solución con cloro al 5% por 30 segundos; luego, se realizó un doble enjuague con agua destilada y se retiró el exceso de agua con papel filtro esterilizado. Las hojas inoculadas se colocaron en cajas plásticas a temperatura ambiente (14 °C- 16 °C) en condiciones de alta humedad relativa (80%-90%) para estimular el crecimiento del micelio y la esporulación. Se realizó un lavado de las hojas con una piseta para obtener los esporangios y se filtró la solución a través de una malla de 20 µm para eliminar impurezas. Con la cámara de Neubauer, se ajustó la concentración a 40.000 esporangios/mL en dilución con agua destilada y se almacenó en refrigeración (3 °C-5 °C) por un periodo de tres horas para obtener las zoosporas (concentración de zoosporas a 2.000 por mL con un hemocitómetro; se determinó un total de 20 zoosporas: 10 cuadrículas x 1.000 = zoosporas/mL) (^{Gamboa et al., 2019}).

Se recolectaron foliolos desarrollados del tercio superior de las plantas de ocho semanas de edad del invernadero, y se colocaron tres foliolos con el envés hacia arriba en cada caja Petri con agar- agua al 10%. Se inoculó junto a la nervadura central 35 µL de la suspensión del inóculo a cada foliolo. Las cajas Petri con los foliolos se conservaron en incubación (15 °C-8 °C), con un fotoperiodo de 12 horas.

Tabla 1 Genotipos de papa utilizados para la evaluación de los componentes de la resistencia al tizón tardío Phytophthora infestans Pichincha Ecuador 

^*Testigos INIAP. Libertad material resistente y Chiwuila roja material susceptible

. Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

Se utilizó un diseño completamente al azar con seis repeticiones. La unidad experimental estuvo representada por un foliolo de cada genotipo. Previo al análisis, se revisó la normalidad de los datos a través de Shapiro (^{Shapiro & Francia, 1972}). Para las variables que no tuvieron distribución normal, se realizó una transformación de raíz cuadrada más uno. Para las variables que presentaron diferencias estadísticas entre genotipos, se utilizó la prueba de separación de medias Tukey al 5% y para establecer la asociación entre las variables se realizó un análisis de correlación de Pearson. Para la variable IE, se reportaron los valores promedio. Para el análisis, se utilizó el programa estadístico Infostat. Las variables en estudio fueron los componentes de la resistencia con base en lo descrito por ^{Lebecka y Sobkowiak (2013)}, ^{Michalska et al. (2016)}, ^{Njoroge et al. (2019)} y ^{Vleeshouwers et al. (1999)}. El periodo de incubación (PI) se obtuvo contando el número de días transcurridos desde la inoculación hasta el aparecimiento del primer síntoma de infección en el sitio de la inoculación. El período de latencia (PL) se estableció contando el número de días transcurridos entre la inoculación y la esporulación del patógeno. Para el área de lesión (AL; mm²), se tomó una fotografía al octavo día de la inoculación a los foliolos afectados para cálculo del área (mm²) de la lesión mediante el programa Image J (^{Schneider et al., 2012}).

Para la tasa de crecimiento de la lesión (TCL), se obtuvo el área de la lesión mediante el programa Image J (^{Schneider et al., 2012}). Dicha área (A) se usó para calcular la media del radio de la lesión 𝑟 = √𝐴. Posteriormente, se estimó la tasa de crecimiento de la lesión mediante una regresión lineal de los cuatro días sucesivos de mediciones sobre la misma lesión (^{Visker et al., 2003}; ^{Vleeshouwers et al., 1999}). La intensidad de esporulación (IP) se evaluó al segundo día, luego de iniciada la esporulación (PL), mediante la escala utilizada por ^{Michalska et al. (2016)}: 0 = ausencia de esporulación, 1 = esporulación baja (hasta 25 ramificaciones de los esporangióforos por mm.), 2 = esporulación media o abundante (hasta 100 ramificaciones de esporangióforos por mm²), 3 = esporulación muy abundante (hasta 300 ramificaciones de esporangióforos por mm²).

Resultados y discusión

Área de la lesión

Los genotipos presentaron diferencias estadísticas para el área de la lesión a los ocho días después de la inoculación (tabla 2). Los genotipos 12-4-173, 12-2-6 y 12-4-72 presentaron un área de la lesión con valores menores a 369,00 mm², mientras que la variedad nativa Chiwuila roja presentó la mayor área de lesión con 1.111,50 mm² (tabla 3). ^{Rivadeneira et al. (2020)}, al evaluar AL de P. infestans en variedades mejoradas, encontraron valores menores a 54,46 mm². Por su parte, ^{Andrivon et al. (2003)}, al evaluar el AL en progenies de S. bertahultii, S. phureja, S. tuberosum y S. vernei, también presentaron valores entre 45 a 122 mm². Posiblemente, los altos promedios de AL en este estudio se deben a la inoculación de la raza compleja con once factores de virulencia de P. infestansy a la variabilidad en la susceptibilidad de los materiales estudiados.

Tabla 2 Análisis de varianza para los componentes de resistencia PI, AL, TCL y PL a Phytophthora infestans en genotipos de papa, Pichincha, Ecuador 

^Nota:PI = periodo de incubación; AL = área de lesión; TCL = tasa de crecimiento de la lesión; PL = periodo de latencia; **significativo al 1%; CV = coeficiente de variación; n = genotipos evaluados.

Análisis de correlación

Al realizar la correlación de Pearson, entre los componentes de resistencia a P. infestans, de los diferentes materiales de papa, se pudo determinar que estos mostraron una relación significativa al 1% en todos los casos. Sin embargo, la correlación entre PI con AL, TCL, y IE fue inversamente proporcional, ya que presentó valores negativos; es decir, a mayor PI, se espera un menor PL, AL, TCL y IE. Este mismo comportamiento se pudo observar cuando se realizó la correlación entre el PL con los componentes AL, TCL y EI (tabla 4). Por su parte, la correlación de Pearson entre PI con PL, AL con TCL e IE y LCT con IE fueron positivas y significativas al 1%, por lo que son directamente proporcionales (tabla 4). Por eso, este componente podría utilizarse como un indicador del nivel de resistencia a P. infestans.

Tabla 3 Promedio desviación estándar y prueba de Tukey 5% para los componentes de resistencia PI AL TCL PL e IE de 28 genotipos de papa Pichincha Ecuador 

^Nota:PI = Período de Incubación; AL = Área de Lesión; TCL = Tasa de Crecimiento de la Lesión; PL = Período de Latencia; IE = Intensidad de Esporulación; ¹valores promedios ± desviación estándar seguidos de la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey al 5%); 20 = ausencia de esporulación; 1= esporulación baja; 2 = esporulación media o abundante; 3 = esporulación muy abundante.

Tabla 4 Coeficientes de correlación de Pearson entre los componentes de resistencia a tizón tardío Pichincha Ecuador 

^Nota:**Significativo al 1%; PI = Periodo de Incubación; AL = Área de la Lesión; TCL = Tasa de Crecimiento de la Lesión; PL = Periodo de Latencia; IE = Intensidad de Esporulación.

Conclusiones

Existió variación de la resistencia a tizón tardío expresada en sus componentes, lo que permitió identificar genotipos de papa con características de resistencia que podrían utilizarse dentro del programa de mejoramiento genético de papa para su uso como progenitores para el desarrollo de nuevas variedades. Específicamente, la tasa de crecimiento de la lesión (TCL) fue el componente que mayor asociación mostró con los otros, por lo que este componente podría utilizarse en pruebas preliminares de selección para identificar germoplasma con características de resistencia a P. infestans.Finalmente, se identificaron al menos ocho clones que mostraron una respuesta de resistencia en la mayoría de los componentes evaluados a tizón tardío; no obstante, es necesario validar su respuesta a P. infestansbajo condiciones de campo.