Introducción

Los compuestos alelopáticos en plantas constituyen una alternativa de manejo de plagas en agricultura sostenible (^{Cabeza-Cepeda et al., 2021}), por ello se implementan los extractos vegetales para contrarrestar el uso indiscriminado de plaguicidas obtenidos por síntesis química (^{Alonso et al., 2020}). Entre las especies más empleadas con este fin se encuentra el nim (Azadirachta indica A. Juss. Meliaceae) (^{Bandeira et al., 2015}; ^{Souza et al., 2016}), sin embargo, con frecuencia se subestiman los efectos negativos o positivos sobre la germinación y el crecimiento de las plantas cultivadas donde se aplican.

El nim es capaz de producir varios compuestos bioactivos, entre los que se destaca la azadiractina, agente activo principal, la cual actúa como regulador del crecimiento y antiapetitivo sobre insectos (Estrada et al., 2007) con cualidades como insecticida, acaricida, fungicida y nematicida (^{Estrada & Puig, 2013}). Además del efecto insecticida, esta produce compuestos herbicidas que disminuyen considerablemente la germinación de Sorghum bicolor (L.) Moench (Poaceae), Lactuca sativa L. (Asteraceae) y Bidens pilosa L. (Asteraceae) (^{Cabral et al., 2008}; ^{Canabarro et al., 2014}).

En Cuba, los extractos acuosos de nim son empleados para el manejo de plagas en escenarios de la agricultura urbana y suburbana, sobre todo para regular insectos y nematodos en cultivos de hortalizas (^{Navarrete et al., 2017}; ^{Santana et al., 2017}; ^{Morán, 2018}). Se aplican en forma de aspersiones foliares y como enmiendas, pero es poco abordada su interacción con el crecimiento de las plantas (^{Santana-Baños et al., 2021}).

Este estudio pretende evaluar el efecto alelopático de los extractos acuosos de hojas y semillas de A. indica sobre la germinación de Solanum lycopersicum L. (Solanaceae), especie sensible para este tipo de ensayos y cultivo de gran importancia agrícola en el que se aplican los preparados de nim para el manejo de plagas (^{Rodríguez et al., 2012}; ^{Santana et al., 2016}).

Materiales y métodos

La investigación se desarrolló en el laboratorio de microbiología de la Universidad de Pinar del Río “Hermanos Saíz Montes de Oca”, Cuba; ubicado a los 22° 24′ 48″ N y 83° 41′ 16″ O. Los valores promedios de temperatura y humedad relativa durante el ensayo fueron 27,8 °C y 62,4%. Los extractos acuosos se obtuvieron de hojas verdes y semillas obtenidas de frutos maduros, recolectados en el tercio medio de árboles de nim con edad igual o superior a ocho años, ubicados a 22° 25′ 11″ N y 83° 41′ 17″ O en organopónicos del municipio Pinar del Río. Las hojas y las semillas se sometieron a un proceso de secado en condiciones de ambiente natural (sombra, temperatura promedio de 25-27 °C y humedad relativa del 68%), hasta perder entre 90-95 % de humedad, según las indicaciones descritas por Estrada y Puig (²⁰¹³). Luego, se trituraron por separado, en fracciones inferiores a 1,0 cm que fueron colocadas en un beaker con agua destilada estéril a razón de 50 g/l (5% m/v) de cada material durante ocho horas. Después de una mezcla homogénea, se agitó durante 15 min a intervalos de 30 min en las primeras 2 h.

Posteriormente, se filtró en papel de filtro estándar y se conservaron los extractos entre 5 °C y 7 °C hasta su utilización.

A partir del extracto obtenido al 5% m/v de cada material empleado (hojas y semillas), se realizaron las diluciones necesarias con agua destilada estéril para elaborar las concentraciones empleadas en el ensayo: 0,0% (control), 0,5%, 1,0%, 1,5% y 2,0% v/v, en las cuales se determinaron los valores promedios de pH y la conductividad eléctrica (tabla 1). Las concentraciones se establecieron a partir de los criterios de varios autores que realizaron ensayos similares (^{Laynez & Méndez, 2013}) y en función de la dosis recomendada para aplicaciones foliares (^{Estrada & Puig, 2013}).

Tabla 1. Valores de pH y conductividad eléctrica (media ± error estándar) en los extractos de Azadirachta indica 

Fuente: Elaboración propia.

En el ensayo se emplearon semillas certificadas de S. lycopersicum cv. Pingüino, desinfectadas con ácido clorhídrico al 1,0% durante 3,0 min. Previo a la siembra, se colocaron por un minuto en 2,0 ml de las concentraciones de los extractos evaluados. La siembra se realizó sobre papel de filtro en placas de Petri de 10 cm de diámetro, previamente esterilizadas, a razón de 50 semillas/placa. Posteriormente, se sometieron a cámara oscura durante 12 horas y un régimen de luz y oscuridad de igual periodo hasta 120 horas después de la siembra; se empleó un diseño completamente al azar con arreglo factorial y cuatro réplicas, donde los factores fueron: tipo de material vegetal (hojas y semillas) y concentración.

Se cuantificaron las semillas germinadas en intervalos de 12 horas por cinco días (120 h) y se evaluó el porcentaje de germinación final (PG), el índice de velocidad de germinación (IVG) (^{Brown & Mayer, 1988}) y el tiempo medio de germinación (TMG) (^{García et al., 1982}). Los cálculos se realizaron a partir de las fórmulas descritas a continuación:

PG (%) = A × 100/S

IVG = a₁/t₁+a₂/t₂+…a_n/t_n

TMG (horas) = [(a₁t₁) + (a₂t₂) +…(a_nt_n)]/A_n

* (A) número de semillas germinadas, (S) total de semillas, (a₁, a₂…. a_n) número de semillas germinadas en el conteo correspondiente a t₁, t₂…t_n, (t) tiempo (horas) transcurrido desde la siembra hasta el conteo, (An) total de semillas germinadas en el último conteo.

A las 120 horas de iniciada la germinación, se seleccionaron al azar 10 plántulas por placa de Petri en cada concentración de los extractos evaluados y se midió la longitud y el diámetro del hipocótilo (mm), así como la longitud de la radícula (mm), con pie de rey digital de precisión de 0,01 mm. Además, se registró la masa fresca de las plántulas (g) en una balanza analítica Sartorius BS124S de precisión de 0,10 mg.

Luego, se realizaron un análisis de varianza simple y una prueba de Duncan para la comparación de medias, con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05). También se aplicó un análisis de regresión lineal y para ello se empleó el programa estadístico Minitab® 17.1.0 para Windows (^{Minitab, 2015}).

Resultados y discusión

La germinación de S. lycopersicum cv. Pingüino se inició a partir de las 36 horas, excepto en las semillas tratadas con extracto de hoja de nim al 2,0% que fue a las 48 horas. Se destaca que el extracto acuoso de semilla al 0,5% estimuló la dinámica de germinación, la misma que se vio afectada con el extracto acuoso de hoja al 2,0% (figura 1).

Los porcentajes de inhibición de la Los porcentajes de inhibición de la germinación fueron directamente proporcionales al incremento de la concentración y en el extracto acuoso de hojas de nim se redujo el valor de semillas germinadas entre 29,2 % y 79,8 % respecto al control, a las 48 h de imbibición; sin embargo, a las 120 h la reducción significativa (> 18 %) se alcanzó con el extracto al 2,0 %.

El extracto de semillas solo provocó una inhibición superior al 30% en las concentraciones de 1,5% y 2,0% a las 48 h, con un incremento de 17,8% y 21,8 % de germinación a las 48 h y 120 h, respectivamente, cuando se empleó al 0,5%. Las demás concentraciones tampoco afectaron negativamente la germinación, por lo que el efecto inhibidor del extracto acuoso de semillas podría encontrarse a concentraciones superiores al 2,0%, aspecto en el que debe profundizarse en próximos ensayos, ya que algunos autores plantean reducción de la germinación en L. sativa con extractos de nim a concentraciones entre 5% y 20% m/v (^{Canabarro et al.; 2014}; ^{Souza et al., 2016}).

Se destaca que el incremento de la concentración en los extractos de hojas de nim determinó, en más del 90%, la reducción del índice de velocidad de germinación (figura 2A), mientras que en los extractos de semilla (R² = 32,3%) al 0,5% superó significativamente el control. Este índice se afectó negativamente en las concentraciones de 1,5% (1,38) y 2,0% (0,91) del extracto de hojas, sin embargo, la reducción proporcional con la concentración en los extractos de hojas sugiere incluir concentraciones superiores en próximos ensayos hasta lograr un punto crítico del efecto inhibidor, el mismo debe evaluarse en especies de arvenses a fin de establecer las potencialidades de los extractos como alternativa ecológica para la regulación pre-emergente de sus poblaciones en suelo o sustratos empleados en la producción hortícola.

Fuente: Elaboración propia.

Figura 1. Efecto de los extractos sobre la germinación de S. lycopersicum cv. Pingüino. Las letras distintas indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) y las barras sobre las líneas expresan error estándar de la media. R² = coeficiente de estimación para la regresión lineal. 

Fuente: Elaboración propia.

Figura 2. Efecto de los extractos sobre el índice de velocidad de germinación (A) y tiempo medio de germinación (B) de S. lycopersicum cv. Pingüino. Las letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05) y las barras sobre las líneas expresan error estándar de la media. R² = coeficiente de estimación para la regresión lineal. 

Con relación al tiempo medio de germinación (figura 2B), se obtuvo una tendencia creciente con el aumento de las concentraciones de los extractos evaluados (R² > 97%), alcanzándose medias superiores respecto al control con los extractos de hojas de nim al 1,0% (63,8 horas), 1,5% (68,9 horas) y 2,0% (78,5 horas), así como con los de semilla al 2,0% (64,5 horas).

El incremento del tiempo medio de germinación en proporción con la concentración puede estar asociado a una mayor acumulación de metabolitos en la medida en que aumenta la concentración de los extractos, lo que favorece su efecto alelopático (^{Cabral et al., 2008}; ^{Souza et al., 2016}), aspecto que debe tenerse en cuenta cuando los extractos de nim se utilizan en el manejo de plagas del suelo en S. lycopersicum, como es el caso de los nematodos fitoparásitos (Meloidogyne spp.), pues podría influir el momento y la dosis de aplicación de los mismos (^{Santana-Baños et al., 2021}), cuestión que debe ser estudiada en condiciones de campo para establecer criterios concretos al respecto.

Estudios similares plantean interferencia sobre la germinación de semillas de L. sativa con la utilización de extractos acuosos de hojas de nim, aunque se emplearon concentraciones de 2,5% a 10% m/v (^{Cabral et al., 2008}) y de 5% a 20% m/v (^{Canabarro et al., 2014}), apreciándose una mayor reducción en la medida en que la concentración de los extractos aumentaba.

Rickli et al. (²⁰¹¹) también observaron inhibición de la germinación en semillas de L. sativa con extracto acuoso de nim a partir del 2,0% (m/v), mientras que otros autores sugieren que los extractos de hojas producen una inhibición mayor que otros órganos de la planta (^{Formagio et al., 2012}; ^{Rodríguez-Gutiérrez et al., 2016}), lo que podría explicar el efecto diferenciado entre semillas y hojas en esta investigación; no obstante, se corrobora el criterio del potencial alelopático que pueden manifestar los extractos acuosos de especies vegetales en la germinación de semillas (^{Anwar et al., 2021}; ^{Scharlak et al., 2021}).

Alcanzados los cinco días posteriores al inicio de la germinación, se pudo constatar un incremento en la longitud del hipocótilo entre 3% y 20% con las concentraciones de los extractos evaluados, aunque disminuyó a partir de las concentraciones de 1,0% y 1,5% para los extractos de semilla y hojas de nim, respectivamente, lo que pudiera estar relacionado con el límite a utilizar si se pretende un efecto estimulante del crecimiento, aspecto que debe profundizarse en investigaciones futuras y fases posteriores a la germinación. El diámetro del hipocótilo también fue similar o superior al control con los extractos y osciló entre 0,67 y 0,84 mm (tabla 2).

Estudios realizados por González et al. (²⁰¹⁵) informaron tanto reducción como incremento de la longitud del hipocótilo cuando evaluaron el efecto de diferentes extractos de Helianthus annuus sobre la germinación y el crecimiento de S. lycopersicum; sin embargo, Viné et al. (²⁰¹³) afirmaron que el efecto alelopático inhibidor sobre el crecimiento no siempre fue directamente proporcional a la concentración del extracto acuoso evaluado.

Tabla 2. Efecto de los extractos en el crecimiento de S. lycopersicum cv. Pingüino 

^*Las letras distintas para las interacciones extracto-concentración indican diferencias significativas (P ≤ 0,05). EE: error estándar y CV: coeficiente de variación.

Fuente: Elaboración propia.

La longitud de la radícula evidenció, en general, una reducción con el incremento de la concentración, alcanzándose valores promedios significativamente inferiores respecto al control en las concentraciones de los extractos evaluados, con excepción de semillas de nim al 0,5% donde no se afectó esta variable (tabla 2). Cabe destacar que la radícula se redujo en más del 20% respecto al control en concentraciones de 1,0%, 1,5% y 2,0 %, para las cuales no se encontraron diferencias entre los extractos de hojas y semillas.

Los resultados indican que el efecto inhibidor sobre el crecimiento de S. lycopersicum fue más acentuado en la variable longitud de la radícula (tabla 2). Laynez y Méndez (²⁰¹³) obtuvieron una reducción lineal en la longitud de la radícula de L. sativa con extracto de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray (Asteraceae) a iguales concentraciones que las empleadas en este estudio. Otros autores también destacan la sensibilidad de esta variable al efecto alelopático inhibitorio con diferentes extractos acuosos en S. lycopersicum, Amaranthus spp. (Amaranthaceae), Tagetes minuta (Asteraceae) y Euphorbia heterophylla L. (Euphorbiaceae) (^{González et al., 2015}; ^{Sakadzo et al., 2018}; ^{Alonso et al., 2020}).

La masa fresca total de las plántulas no arrojó diferencias significativas entre las concentraciones de los extractos evaluados y el control, aunque se alcanzaron medias superiores a este en los extractos de hojas de nim (tabla 2). Además, se destaca una diferencia significativa entre los extractos para la concentración de 2,0%, apreciándose un incremento superior a 15% y una reducción en más de 6%, respecto al control, para el extracto de hojas y semillas, respectivamente.

Ensayos realizados por Cabral et al. (²⁰⁰⁸) indicaron que los extractos acuosos de nim pueden o no afectar la biomasa en las plantas receptoras y en algunas especies puede presentarse una reducción de esta a concentraciones superiores a 2,0%, aspecto que puede estar relacionado con las diferencias en los metabolitos presentes entre los extractos (^{Laynez & Méndez, 2013}). Aplicaciones de extracto acuosos de hoja de nim al 5% en S. lycoperisicun, posterior a la germinación de las semillas, no provocaron una reducción significativa de la biomasa fresca de las plántulas respecto al control (^{Santana et al., 2017}).

Conclusiones

Los extractos acuosos de hojas y semillas de A. indica provocan una sensibilidad alelopática diferenciada en S. lycopercicum. Se evidencia que la germinación se estimula con el extracto acuoso de semillas de A. indica al 0,5% y se reduce con el extracto de hojas al 2,0%. Ambos extractos incrementan la longitud del hipocótilo respecto al control y reducen la longitud de la radícula proporcionalmente con el incremento de la concentración. Los resultados sugieren evaluar en próximos ensayos concentraciones superiores de los extractos para determinar el punto crítico de inhibición de la germinación y el crecimiento, así como su efecto herbicida en especies de arvenses.