Área de estudio

El trabajo se realizó en un vivero forestal ubicado en las instalaciones del Colegio de Postgraduados, campus Campeche (ColPos-Campeche), en el municipio de Champotón del estado de Campeche, México y donde las semillas de B. alicastrum fueron recolectadas de la localidad de Hopelchén, al norte del estado (figura 1). Esta región se caracteriza por una cobertura de selva media subperenifolia y selva alta perenifolia, con suelos arcillosos, precipitaciones promedio anuales de 600 a 4000 mm, con épocas de estiaje de tres a siete meses, una temperatura media anual de 18 ºC a 27 ºC y una altitud de 20 a 1000 m s.n.m. (^{Instituto Nacional de Estadística y Geografía, 2018}).

Fuente: Elaboración propia con datos obtenidos del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (²⁰¹⁸)

Figura 1. Ubicación espacial de la localidad donde se recolectaron las semillas de B. alicastrum y el vivero donde se realizó el experimento para evaluar el efecto de las micorrizas y la fertilización en la calidad de las plántulas 

Pruebas de viabilidad de las semillas de B. alicastrum

En junio del 2021 se recolectaron semillas de Ramón en la localidad de Hopelchén. Para la recolecta de las semillas se siguió la metodología descrita por Vallejos et al. (²⁰¹⁰), se seleccionaron los árboles con las mejores características fenotípicas (dasométricas) y con una distancia mínima de 100 m entre árboles seleccionados. El germoplasma se recolectó en bolsas esterilizadas de plástico que fueron trasladadas a las instalaciones del Colegio de Postgraduados, campus Campeche, y para determinar la viabilidad de germinación de las semillas, se seleccionaron al azar cuatro réplicas de seis semillas por réplica, las cuales fueron sometidas a una prueba de viabilidad con cloruro de tetrazolio al 0,5%, conforme a la metodología descrita por Orantes-García et al. (²⁰¹³). Una vez determinado el potencial de germinación, se colocaron 400 semillas en charolas germinadoras de 200 cavidades por charola, con una capacidad por cavidad de 23 ml, el sustrato empleado fue arena previamente esterilizada con vapor a presión en autoclave a 15 lb h^-1 durante tres días consecutivos. Así, se germinaron las semillas para garantizar las suficientes plántulas para un diseño experimental balanceado.

Diseño experimental

El experimento se estableció en julio del 2021, con un diseño de bloques al azar con arreglo factorial incompleto, con cinco niveles de origen de las micorrizas (comercial, Hopelchén, Conkal, Ramón y sin micorriza), dos tipos de fertilizante (Osmocote® y Bio2®) y un tratamiento control (sin micorrizas y sin fertilizante). La combinación de los niveles de los factores evaluados más el testigo por control dio como resultado 11 tratamientos, los cuales fueron distribuidos completamente al azar en tres bloques con diez repeticiones por tratamiento por bloque, con un total de 330 plántulas evaluadas.

Para su evaluación en vivero, las plántulas germinadas mediante semilla en arena fueron extraídas a los 30 días de sembradas, cuando alcanzaron su segunda hoja verdadera. Se removió la arena de tal manera que no se dañara la raíz. Todas las unidades experimentales se trasplantaron en tubetes de 310 ml con un sustrato compuesto por 60% de peat moss, 20% de vermiculita y 20% de perlita, la cual se caracteriza por un pH neutro con alta porosidad y capacidad de retención de humedad (^{Santillán Fernández et al., 2021}). Estas unidades experimentales fueron aleatorizadas en condiciones homogéneas en un vivero, mediante un diseño experimental, y se les aplicó un riego manual cada tres días conforme a la retención de humedad del sustrato utilizado (^{Masaguer & López-Cuadrado, 2006}).

Identificación de micorrizas, inoculación y aplicación

Para la identificación taxonómica de los hongos formadores de micorrizas de los consorcios Hopelchén, Conkal y Ramón, se siguió la metodología descrita por Zulueta Rodríguez et al. (²⁰¹⁰) y se purificaron en un laboratorio mediante co-cultivos hasta que generaron colonias puras. En el caso del consorcio Tecmyc®, los datos fueron obtenidos de su etiqueta. En la tabla 1 se describen las propiedades fisicoquímicas de las micorrizas y los fertilizantes utilizados. Es de aclarar que este estudio no midió el nivel de infección de las micorrizas en la raíz de las plántulas, debido a que el objetivo era determinar la promoción de crecimiento, además de que se emplearon consorcios donde la mezcla de varias micorrizas dificulta la cuantificación de la colonización (^{Martínez et al., 2007}).

Los inóculos de las micorrizas en estado líquido fueron aplicados en proporciones de 10 ml por plántula y en el caso de los inóculos en estado sólido se pesaron 5 gr por plántula en una balanza analítica. Las micorrizas de Ramón se obtuvieron después de moler en un mortero raíces frescas con parte del suelo de donde fueron extraídas, para después diluirlas en agua durante 24 horas, donde la solución resultante fue aplicada en proporciones de 10 ml por plántula. La aplicación se dio al momento de trasplantar las plántulas a los tubetes, donde se añadieron los inóculos micorrícicos de acuerdo con el correspondiente tratamiento y poniéndolos en contacto directo con la raíz de la plántula; en el caso de los inóculos líquidos se utilizó una jeringa graduada y para los inóculos en estado sólido se aplicó con una cuchara. El fertilizante mineral Osmocote® se aplicó en una proporción de 5 gr por plántula y para el caso del fertilizante orgánico Bio2® se diluyeron 10 gr en 250 ml por plántula. El fertilizante Osmocote® se aplicó mezclado con el sustrato y el Bio2® se aplicó en el primer riego.

Tabla 1. Características de las micorrizas y los fertilizantes empleados para evaluar su efecto en la calidad de plántulas en vivero de B. alicastrum Sw. 

Fuente: Elaboración propia con datos del laboratorio

A los 120 días de establecido el experimento, se seleccionaron al azar 20 plántulas por tratamiento y se les midió específicamente en la parte aérea: altura (abreviada como h, medida en cm), diámetro basal (d, mm), número de hojas (ho), biomasa en verde o fresca (pvb, hojas y tallo, gr) y biomasa en seco (psb, gr). Para el caso de la raíz se evaluó: longitud (lr, cm), diámetro del cuello de la raíz (dr, mm), peso en verde o fresco (pvr, gr) y peso en seco (psr, gr). La biomasa seca de la plántula y la raíz se obtuvo en una balanza analítica después de extraer el material vegetativo de una estufa con circulación de aire forzado a 70°C durante 24 horas.

Análisis estadístico

El diseño experimental propuesto se evaluó durante 4 meses, de julio a octubre del 2021. Los datos obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y por la separación de medias con prueba de Tukey (α = 0,05). Mediante la correlación de Pearson (α = 0,05) se estableció la asociación que guardan entre sí las variables de la parte aérea de la plántula con las variables de la raíz.

Además, con la finalidad de agrupar aquellos tratamientos que tuvieron efectos similares en la calidad de las plántulas en vivero de B. alicastrum Sw., se desarrolló un análisis de conglomerados (dendrograma: las diferencias entre los tratamientos fueron calculadas mediante el método de distancia euclidiana y el agrupamiento por el método de Ward) y un análisis de componentes principales (acp, por el método basado en correlaciones).

Para los grupos formados por el dendrograma y el acp se calcularon sus diferencias estadísticas por la prueba de medias de Tukey (α = 0,05) y se representaron mediante diagramas de caja, tanto para las variables de la parte aérea de las plántulas como para las de la raíz. Los análisis estadísticos fueron desarrollados en el software estadístico R de libre acceso (^{The R Project for Statistical Computing, 2021}).

Índice de calidad de plántulas

Para determinar la calidad de plántulas de B. alicastrum producida mediante semilla en vivero, se construyeron seis indicadores morfológicos y un indicador fisiológico (tabla 2), con la finalidad de evitar la selección de plántulas desproporcionadas y descartar ejemplares de menor altura, pero con mayor vigor. Los indicadores y los umbrales para diferenciar entre calidad de plántula alta, media y baja fueron construidos de acuerdo con lo propuesto para especies forestales tropicales por Rueda-Sánchez et al. (²⁰¹²), Rueda-Sánchez et al. (²⁰¹⁴), Sáenz-Reyes et al. (²⁰¹⁴) y Santillán Fernández et al. (²⁰²¹).

Tabla 2. Indicadores morfológicos y fisiológicos para determinar la calidad de la plántula de B. alicastrum producida mediante semilla en vivero 

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante revisión bibliográfica

Pruebas de viabilidad de las semillas de B. alicastrum

El total de semillas (cuatro réplicas de seis semillas por réplica) sometidas a la prueba de viabilidad con cloruro de tetrazolio al 0,5% (ctt), se tiñeron de rojo por completo. De acuerdo con la metodología descrita por Orantes-García et al. (²⁰¹³), cuando las células vivas del embrión de la semilla respiran activamente (tienen mayor probabilidad de germinación), la prueba de ctt las tiñe de color rojo y, en el caso de las células muertas, estas conservan el color original del embrión, por lo que la intensidad en la tinción indica una mayor probabilidad de germinación (^{Mancipe-Murillo et al., 2018}), sin embargo, a pesar de que las semillas presentaron un 100% en el potencial de germinación, de las 400 semillas que se pusieron a germinar en arena, solo 367 germinaron (91,75%) en un periodo de 8 a 10 días, esto se explica por la propiedad recalcitrante de las semillas de B. alicastrum, que son más propensas a perder viabilidad en los primeros 20 días después de su colecta (^{Magnitskiy & Plaza, 2007}), por lo que para su manejo en vivero Mancipe-Murillo et al. (²⁰¹⁸) se recomienda almacenar las semillas en temperaturas inferiores a los 5 °C para elongar su viabilidad.

Efecto de las micorrizas y la fertilización en la calidad de plántulas

Las variables aéreas fueron influenciadas significativamente (p < 0,05) por los factores micorrizas y fertilizante, mientras que la interacción de micorrizas × fertilizante no afectó estadísticamente estas variables (p > 0,05), a excepción de la altura de la planta. Para el caso de las variables radicales, la interacción de micorrizas × fertilizante tampoco fue estadísticamente significativa (p > 0,05) y nuevamente los factores micorrizas y fertilizante fueron estadísticamente significativos (p < 0,05) (tabla 3).

Estos resultados contrastan con lo reportado por Martínez et al. (²⁰⁰⁷), quienes encontraron que la calidad de plántulas de especies forestales de climas templados fue significativamente mayor cuando se aplicó fertilizante y micorrizas en un mismo momento, que cuando se aplicaron por separado ambos factores, sin embargo, de acuerdo con Pérez-de la Cruz et al. (²⁰¹²) y Hernández-González et al. (²⁰¹⁵), la calidad de las plántulas en vivero de B. alicastrumse ha asociado más al tipo de sustrato, por encima de la fertilización y el riego.

Todas las variables del sistema aéreo lograron un mayor crecimiento con el fertilizante Osmocote® en relación con el Bio2® y al tratamiento sin fertilización (sf), con excepción del diámetro de tallo, donde ninguno de los fertilizantes mostró un buen desempeño, incluso con promedios menores al tratamiento sf. Para el caso de las variables del sistema radical, el tratamiento sf alcanzó los mayores promedios con relación a ambos fertilizantes (tabla 4), lo cual evidencia que para B. alicastrum a nivel de vivero no sería necesaria la fertilización para promover el crecimiento de su sistema radical (^{Santillán Fernández et al., 2021}).

Tabla 3. Análisis de varianza para determinar el efecto de las micorrizas y la fertilización en la calidad de las plántulas de B. alicastrum Sw. reproducidas mediante semilla en vivero 

^{Notas aclaratorias:}P-valores: * < 0,05, ** < 0,01 y ***< 0,001.

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

El efecto de las micorrizas en el crecimiento de las variables evaluadas del sistema aéreo y radical fue estadísticamente similar, a excepción de cuando se emplearon las micorrizas de Hopelchén, donde se encontraron los efectos más bajos (tabla 5), sin embargo, en los tratamientos donde se aplicaron micorrizas de Ramón o no se aplicaron micorrizas, se obtuvieron matemáticamente las mejores medias para las variables evaluadas. De acuerdo con Zulueta Rodríguez et al. (²⁰¹⁰), este hecho se puede explicar debido a que las interacciones simbióticas en B. alicastrum son muy específicas con especies nativas de micorrizas, por lo que cuando los consorcios utilizados son inespecíficos, la simbiosis es poco eficiente.

Tabla 4. Prueba de medias por Tukey (α = 0,05) para determinar el efecto del tipo de fertilizante en la calidad de plántulas de B. alicastrumSw. reproducidas mediante semilla en vivero 

^{Notas aclaratorias:}medias con la misma letra por fila no son estadísticamente diferentes (Tukey α = 0,05).

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

Tabla 5. Prueba de medias por Tukey (α = 0,05) para determinar el efecto del tipo de micorriza en la calidad de las plántulas de B. alicastrum, reproducidas mediante semilla en vivero 

^{Notas aclaratorias:}medias con la misma letra por fila no son estadísticamente diferentes (Tukey α = 0,05).

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

Al asociar mediante la correlación de Pearson las variables del sistema aéreo de las plántulas con las variables del sistema radical, se encontró una relación alta y directamente proporcional (ρ > 0,50) en ocho de las nueve variables analizadas (figura 2). Como se esperaba, la longitud de la raíz (lr) se asoció inversamente proporcional con la altura de las plántulas (h), ya que de acuerdo con Negreros-Castillo et al. (²⁰¹⁰) en la evaluación de las plántulas en vivero, la parte aérea se desarrolla más rápido que su sistema radical.

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

Figura 2. Matriz de correlación de Pearson que asocia las variables del sistema aéreo de las plántulas de B. alicastrumcon las variables de su raíz, propagadas mediante semilla en vivero, donde se evaluó el efecto de micorrizas, fertilizante y su interacción en la calidad de plántulas. 

En el acp se encontró que el primer componente (Prin1) agrupó a las variablesh (valor del eigenvector 0,382), d (0,366), ho (0,356), pvb (0,309), psb (0,354), dr (0,341), pvr (0,342) y psr (0,360), y explicó el 70,99% de la varianza total de los datos. El segundo componente (Prin2) agrupó a la variable lr (0,796) que explicó el 13,47%; entre ambos componentes explicaron el 84,46% de la varianza total de los datos. La dispersión de los eigenvalores de cada uno de los 11 tratamientos permitió agrupar y diferenciar tres grupos que fueron reafirmados mediante el dendrograma del análisis de clúster (figura 3).

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

Figura 3. Agrupación de tratamientos por técnicas multivariadas en función del efecto que tuvieron en la calidad de las plántulas de B. alicastrumpropagadas mediante semilla en vivero 

El factor que más influyó en la formación de los grupos fue el asociado a la fertilización e implícitamente al pH neutro o ligeramente alcalino de los compuestos utilizados. En la figura 3 se observa que en el grupo 1 se juntaron los tratamientos donde el fertilizante utilizado fue Osmocote®, en el grupo 2 el fertilizante Bio2® y el testigo por control; y en el grupo 3 al parecer el pH ácido de las micorrizas de Hopelchén influyó para que fueran los tratamientos con las características menos deseables para la calidad de las plántulas de B. alicastrumproducidas mediante semilla en vivero.

La prueba de medias por Tukey (α = 0,05) por grupo diferenciado para las variables de la parte aérea de las plántulas, como para las variables de la raíz, reveló que las mejores medias correspondieron al grupo 1, formado por los tratamientos que incluyeron el fertilizante Osmocote® (figura 4), sin embargo, de acuerdo con Negreros-Castillo et al. (²⁰¹⁰), en la calidad de plántulas en vivero, no solo se deben evaluar las variables por separado, sino que debe haber una correspondencia entre variables aéreas y radicales. Para ello, Sáenz-Reyes et al. (²⁰¹⁴) proponen algunos índices que asocian la parte aérea de las plántulas con su sistema radical, para determinar si las plántulas producidas en vivero tienen la calidad para sobrevivir a una plantación.

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental

Figura 4. Prueba de medias por grupo diferenciado para las variables del sistema aéreo y radical de las plántulas de B. alicastrum propagadas mediante semilla en viveroNotas aclaratorias: medias con la misma letra dentro de cada variable analizada no son estadísticamente diferentes (Tukey α = 0,05). 

Índice de calidad de plántulas

Al analizar una a una las variables morfométricas de la parte aérea de las plántulas y de su sistema radical, se encontró que las mejores características de plántula correspondieron a aquellas donde se incluyó el fertilizante mineral Osmocote®, sin embargo, mediante la construcción de indicadores de calidad de plántula se encontró que las mejores proporciones entre parte aérea y sistema radical se obtuvieron para aquellos ejemplares donde se utilizó el fertilizante orgánico Bio2®, con calidad de plántula de media a alta (tabla 6).

Tuesta-Pinedo et al. (²⁰¹⁷) encontraron que los fertilizantes minerales desarrollan más rápido la parte aérea de las plántulas producidas en vivero, mientras que el efecto de los fertilizantes orgánicos es más evidente en el sistema radical. Sáenz-Reyes et al. (²⁰¹⁴) mencionan que, por lo atractivo del sistema aéreo de las plántulas, en los viveros es más frecuente la fertilización mineral, sin embargo, la evaluación de la calidad de las plántulas mediante índices morfológicos incrementa la probabilidad de adaptación y el desarrollo en una plantación (^{Rueda-Sánchez et al., 2014}).

Analizar la calidad de plántula por el índice de robustez (ir) garantiza la elección de ejemplares resistentes a la desecación por el viento y arbolitos más robustos tienden a adaptarse mejor a sitios con limitada humedad (^{Sáenz-Reyes et al., 2014}), como es el caso del árbol Ramón, que de manera natural crece en terrenos pedregosos con sequías prolongadas (^{Vega López et al., 2003}), mientras que relaciones desproporcionadas de altura (cm): largo de raíz (mm) y peso seco de la biomasa (gr): peso seco de la raíz (gr), indican la existencia de un sistema radical insuficiente para proveer de energía a la parte aérea de la planta, la cual se agrava cuando las plantas se desarrollan en sitios con escases de agua (^{Rueda-Sánchez et al., 2014}).

En estos casos, el índice de calidad de Dickson (icd) es el más utilizado para evaluar la calidad de plántulas en vivero, ya que expresa el equilibrio de la distribución de la masa y la robustez, lo que evita seleccionar plantas desproporcionadas y descartar ejemplares de menor altura, pero con mayor vigor (^{Sáenz-Reyes et al., 2014}). Respecto al índice de lignina, destaca el hecho de que los ejemplares de todos los tratamientos tuvieron porcentajes altos de lignina, lo que sugiere que la fisiología del árbol Ramón tiende a producir altos niveles de este biopolímero, algo que ya ha sido documentado previamente por Pech-Cohuo et al. (²⁰²²).

Finalmente, la calidad de plántula deB. alicastrum, evaluada como alta, se encontró en aquellos tratamientos donde se asoció el fertilizante orgánico Bio2® con micorrizas provenientes de la misma especie (Ramón) y para el testigo por control que no utilizó ni fertilizante ni micorrizas (tabla 6). Estos resultados coinciden con lo reportado por Pérez-de la Cruz et al. (²⁰¹²) y Santillán Fernández et al. (²⁰²¹), quienes encontraron que el tipo de sustrato y de riego en el vivero condicionan el desarrollo de las plántulas de B. alicastrum, aún más que la fertilización; sin embargo, para el presente estudio se debe considerar que no se realizó una evaluación definitiva en campo para determinar la adaptación y el vigor de las plántulas; además de que los indicadores de las raíces fueron medidos en recipientes relativamente pequeños, lo que pudo limitar el total desarrollo de las raíces. También se debe considerar que, en la construcción para el índice de calidad de plántulas, todas las variables se ponderaron con el mismo peso.

Tabla 6. Indicadores de calidad de plántula de B. alicastrum producida mediante semilla en vivero, donde se evaluó el efecto de las micorrizas y la fertilización en la calidad de plántulas 

^{Notas aclaratorias:}Notas aclaratorias: *Calidad alta (A): Se refiere a plantas que presentan ausencia absoluta de características indeseables, es decir, que las variables evaluadas se calificaron como de calidad alta (A), aunque se puede aceptar hasta tres valores con calidad media (M), pero en ningún caso valores con calidad baja (B). Calidad media (M): se aceptan hasta cuatro valores de calidad media (M) y dos variables con calificación de calidad baja (B). Calidad baja (B): son aquellas plantas que presentan tres o más valores de calidad baja (B), es decir, son plantas que tendrán una baja supervivencia y un reducido desarrollo en los sitios de plantación. h = Altura, d = diámetro basal, ir = índice de robustez, r h:lr = relación altura: longitud de raíz, r psb:psr = relación peso en seco de la biomasa: peso en seco de la raíz, icd = índice de calidad de Dickson,il = índice de lignina y sm = sin micorriza.

Fuente: Elaboración propia con datos recabados mediante un diseño experimental