Mortalidad en larvas de Culex quinquefasciatus
y Anopheles albimanus (díptera: culicidae),
causada con un producto de Bacillus sphaericus
(bacteria: bacillaceae) en presentación granulada
en condiciones experimentales

Estrella Cárdenas Castro¹ / Álvaro Rozo Bautista² / Ligia Lugo Vargas³

¹ Bióloga. MSc. Docente-Investigadora, Universidad de La Salle, Colombia. ecardenas@unisalle.edu.co

² Bióloga y química. MSc. Docente Investigador, Universidad de La Salle, Colombia. arozo@unisalle.edu.co

³ Bióloga. MSc. Docente-investigadora, Universidad Santo Tomás, Colombia. Red Nacional de Laboratorios, Instituto Nacional de Salud, Colombia. illugo@ins.gov.co

Recibido: 29 de mayo del 2011. Aceptado: 17 de febrero del 2012

El objetivo de este estudio fue ensayar una serie de concentraciones de un producto granulado preparado con Bacillus sphaericus, sobre larvas de Culex quinquefasciatus y Anopheles albimanus en condiciones de laboratorio. Se utilizaron once concentraciones (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 y 500 ppm) sobre larvas de An. albimanus, y ocho concentraciones diez veces menores (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 ppm) sobre larvas de Cx. quinquefasciatus. Se utilizaron 60 larvas y un control con 20 larvas por concentración. El tiempo de exposición fue de 48 h, a una temperatura de 28 ± 2 °C. Para estimar las concentraciones letales 50 y 95 se utilizó la prueba Probit. Se encontró una CL₉₅ de B. sphaericus entre 6,45 y 7,28 ppm para larvas de Cx. quinquefasciatus; mientras que en larvas de An. albimanus se observó una CL₉₅ entre 450,56 y 466,76 ppm.

Palabras clave: control biológico, microorganismos, mortalidad, mosquitos.

Larval Mortality in Culexquinquefasciatus and Anopheles
albimanus (diptera: culicidae), Caused with a Bacillus
sphaericus (bacteria: bacillaceae) Granulated Product in
Experimental Conditions

The purpose of this study was to assay a series of concentrations of a granulated product prepared with Bacillus sphaericus on Culexquinquefasciatus and Anopheles albimanus larvae in laboratory conditions. Eleven concentrations (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 500 ppm) were used on An. Albimanus larvae and eight concentrations ten times smaller (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ppm) were used on Cx. quinquefasciatus larvae. Sixty (60) larvae and a control with 20 larvae were used per concentration. The time of exposure was of 48 hours at a laboratory temperature of 28 ± 2 °C. LC₅₀ and LC95 were determined through the Probit tests. A LC95 of B. sphaericus was found between 6,45 and 7,28 ppm for Cx. quinquefasciatus larvae; whereas LC95 was observed between 450.56 and 466.76 ppm in An. albimanus larvae.

Keywords: Biological control, microorganisms, mortality, mosquitoes.

Mortalidade em larvas de Culex quinquefasciatus e Anopheles
albimanus (diptera:culicídeos), causada com um produto de
Bacillus sphaericus (bactéria: bacillaceae) em apresentação
granulada em condições experimentais

O objetivo deste estudo foi testar uma série de concentrações de um produto granulado preparado com Bacillus sphaericus, sobre larvas de Culex quinquefasciatus e Anopheles albimanus em condições de laboratório. Utilizaram-se onze concentrações (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 e 500 ppm) sobre larvas de An. albimanus, e oito concentrações dez vezes menores (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 ppm) sobre larvas de Cx. quinquefasciatus. Utilizaram-se 60 larvas e um controle com 20 larvas por concentração. O tempo de exposição foi de 48h, a uma temperatura de 28 ± 2 °C. Para estimar as concentrações letais 50 e 95 utilizou-se o teste Probit. Encontrou-se uma CL₉₅ de B. sphaericus entre 6,45 e 7,28 ppm para larvas de Cx. quinquefasciatus; enquanto que em larvas de An. Albimanus observou-se uma CL₉₅ entre 450,56 e 466,76 ppm.

Palavras chave: controle biológico, micro-organismos, mortalidade, mosquitos.

Se han encontrado en todo el mundo más de 480 especies del género Anopheles; no obstante, cerca de 80 especies se han reportado como vectores de malaria (1).

La especie Culex quinquefasciatus se encuentra ampliamente en zonas tropicales y subtropicales. Esta especie está implicada en la transmisión de las filarias Wuchereria bancrofti y Dirofilaria immitis (2, 3). Además, es vector de varios virus: virus del Nilo occidental y de los virus causantes de la encefalitis de San Luis y la encefalitis equina venezolana (4). En Colombia, C. quinquefasciatus está ampliamente distribuida desde las zonas costeras, llanos orientales, Amazonas, Chocó y las zonas altoandinas (5, 6). En la Sabana de Bogotá se ha constituido en un problema de salud pública puesto que su picadura causa alergias y molestias originadas en la alta densidad de sus poblaciones (6).

La especie Anopheles albimanus presenta una gran distribución geográfica en la zona tropical de las Américas y es vector efectivo de malaria (7-9). En zonas con altas densidad en las poblaciones de esta especie, las hembras adultas se alimentan con sangre humana o de animales domésticos desde las primeras horas de la noche hasta la medianoche (10, 11). En Colombia se han encontrado aproximadamente 45 especies de Anopheles, de las cuales son consideradas vectores de malaria: Anopheles albimanus, An. darlingi y An. nuneztovari; en cuanto a los departamentos en los cuales se ha encontrado mayor presencia de malaria se señalan: Antioquia, Nariño, Córdoba, Chocó, Meta, Guaviare y Putumayo (12).

La utilización de insecticidas organosintéticos para el control de insectos vectores y plagas de cultivos ha generado resistencia en las poblaciones naturales de estos insectos (13). El control biológico utiliza un agente con capacidad para reducir el tamaño de una población de insectos vectores o plagas y se ha considerado como una alternativa para minimizar poblaciones de estos insectos. El agente biológico puede ser un patógeno, un depredador, un competidor o una toxina derivada de microorganismos o de plantas (14).

Bacillus sphaericus es una bacteria que se encuentra en forma natural en todo el mundo. Esta bacteria fue registrada por la Agencia de Protección Ambiental (EPA, por su sigla en inglés) para ser usada como larvicida en diferentes especies de mosquitos. Las larvas de mosquitos ingieren esta bacteria que se libera en el intestino y la toxina se adhiere a sus células, las cuales contienen receptores específicos para la misma, y los mosquitos mueren por intoxicación. Los mamíferos no contienen receptores para esta toxina (15).

Desde que se descubrió que B. sphaericus presentaba toxicidad para larvas de mosquitos (16) se han descrito varias cepas de esta bacteria con propiedades larvicidas. La cepa B. sphaericus-2362 fue aislada de adultos de Simulium damnosum en Nigeria y mostró alta toxicidad en larvas (17), desde entonces ha sido la más ensayada y utilizada como alternativa para el control de mosquitos. Varios autores han demostrado que la cepa 2362 de B. sphaericus presenta alta efectividad tóxica en los géneros Anopheles, Culex y Psorophora, y para algunas especies del género Aedes; mientras que en las especies Ae. aegypti y Ae. albopictus no encontraron efectividad (18-25).

Davidson et ál. (26) reportaron que B. sphaericus es efectivo contra especies de los géneros Anopheles y Culex, y menos efectivo contra especies del género Aedes; además, presenta actividad tóxica y alta persistencia en aguas contaminadas (21). Vilarinhos et ál. (27) demostraron que B. sphaericus-2362 es efectivo contra larvas de Ae. aegypti a concentraciones de 1580 ppb, y Melo et ál. (28) encontraron una mortalidad del 70% en Ae. aegypti en una concentración de 1 g/L de B. sphaericus. Las ventajas que presenta B. sphaericus son las siguientes: baja toxicidad ambiental dada la alta especificidad de sus toxinas, altos niveles de eficacia y persistencia en el ambiente (14). La actividad tóxica de B. sphaericus sobre larvas de mosquitos ha sido ampliamente estudiada en el mundo (23, 24, 27, 29-45).

En Colombia se han realizado varios estudios sobre actividad tóxica de Griselesf B. sphaericus en formulación líquida sobre larvas de mosquitos Cx. quinquefasciatus, Ae. taeniorhynchus y An. albimanus bajo condiciones de campo en Buenaventura (46), y en sumideros de Cali se ha utilizado VectoMax para el control de larvas de mosquitos (47). En Medellín se realizó una investigación para la introducción de genes de B. thuringiensis dentro de B. sphaericus con la finalidad de aumentar la efectividad de esta última contra larvas de mosquitos (48).

La presente investigación procura contribuir a la comprensión de alternativas para el control de mosquitos, que sean amigables con el medio ambiente y que tengan alto potencial para minimizar el uso de insecticidas químicos.

Se realizaron recolecciones de adultos y larvas de Cx. quinquefasciatus en la vereda San Antonio en Villavicencio, Meta (4° 07' 38,21"N;73° 31' 09,34"W, elevación 341 m) y en el embalse del Muña en Sibaté, Cundinamarca (4° 31' 0,2'' N; 74° 15' 05''W, elevación 2568 m), y se trasladaron al laboratorio de Entomología del Instituto Nacional de Salud para su mantenimiento y colonización. Se realizaron observaciones de los especímenes bajo estereomicroscopio, y para la determinación taxonómica de la especie se utilizaron las claves taxonómicas de Cova-García et ál. (49).

Las colonias An. albimanus utilizadas en los ensayos se originaron de colecciones realizadas en Barranquilla y Cartagena en 1978, establecidas y mantenidas en el Laboratorio de Entomología del Instituto Nacional de Salud, y determinadas con las claves taxonómicas de Cova-García y Sutil (50).

Se utilizó una cámara climática Sherer con las siguientes condiciones ambientales: temperatura 28 ± 2 °C, humedad relativa 62 ± 5%, y fotoperiodo 12:12 h (luz/oscuridad) para el mantenimiento de las colonias de ambas especies, tanto larvas como adultos. Los adultos se mantuvieron dentro de jaulas Gerber (polipropileno y angeo fino 30x30x30 cm, provistas de una manga de muselina para introducir los mosquitos) y se les proporcionó glucosa al 30% en motas de algodón. Para la alimentación de las hembras con sangre se les colocó dentro de la misma jaula un ratón (Mus musculus, colonia ICR, Bioterio de Producción del Instituto Nacional de Salud) anestesiado con pentotal sódico (10 mg/kg de peso del animal) cada tercer día y por una hora. Para la oviposición se les proporcionó un recipiente de plástico (1000 ml) con 500 ml de agua destilada. Las posturas fueron transferidas a bandejas plásticas (ancho 22 x 22 cm y alto 10 cm) para la cría de larvas las cuales se alimentaron con rodentina pulverizada.

Los bioensayos fueron realizados en el Laboratorio de Entomología del Instituto Nacional de Salud de Bogotá con base en la cantidad del ingrediente activo (B. sphaericus) contenido en el producto granulado; se preparó un litro de solución stock (500 ppm) y a partir de esta solución se prepararon las diluciones para los bioensayos. En larvas del cuarto estadio de An. albimanus se ensayaron once concentraciones (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 y 500 ppm), y en larvas del cuarto estadio de Cx. quinquefasciatus se ensayaron ocho concentraciones (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 ppm). Para ensayar cada concentración se utilizaron cuatro recipientes plásticos (6 cm alto x 8 cm diámetro); en tres recipientes se vertieron 100 ml de la concentración correspondiente y se colocaron 20 en cada uno, y en el recipiente control se vertieron 100 ml de agua destilada y 20 larvas. Luego, los recipientes con los ensayos se llevaron a la cámara Sherer con las mismas condiciones ambientales anotadas anteriormente. Las larvas tratadas se revisaron a las 24 y 48 horas, se registró el número de larvas muertas y se determinó el porcentaje de mortalidad causada por el biolarvicida.

El test Probit se realizó según McCullagh y Nelder (51), y la evaluación de la significancia estadística de los parámetros del modelo Probit se hizo siguiendo a Cox y Hinkley (52). Las concentraciones letal 50 y letal 95, y sus respectivos intervalos de confianza al nivel del 95% se determinaron según Hosmer y Lemeshow (53).

En la tabla 1 se observa que el porcentaje de mortalidad en larvas de cuarto instar de las dos colonias An. albimanus fue bajo a las 24 y a las 48 horas, en concentraciones desde 20 hasta 200 ppm la mortalidad estuvo por debajo del 50%, mientras que a 500 ppm la mortalidad estuvo entre el 86,7 y el 100%.

En la tabla 2 se observa que el porcentaje de mortalidad en larvas de cuarto instar de las dos colonias Cx. quinquefasciatus por efecto del producto granulado de B. sphaericus estuvo entre el 18,3 y 80% de mortalidad a las 24 horas; mientras que a las 48 horas, en concentraciones desde 2 ppm hasta 10 ppm la mortalidad estuvo entre el 73,3 y el 100%.

La tabla 3 muestra valores altos en el error estándar para el parámetro (S0, lo cual demuestra alta variabilidad en los datos. Sin embargo, el test de significancia para el parámetro (S1 permite determinar que el producto granulado de B. sphaericus tuvo efecto estadísticamente significativo sobre la mortalidad de las larvas de An. albimanus en las colonias Barranquilla y Cartagena, y sobre las larvas de Cx. quinquefasciatus en las colonias Sibaté y Villavicencio, dado que los valores de P fueron menores a 0,05.

En la tabla 4 se aprecia que las CL50 y CL95 presentaron valores más bajos para larvas de An. albimanus colonia Barranquilla comparados con la colonia Cartagena; mientras que para larvas de C. quinquefasciatus las CL50 y CL95 presentaron valores más altos en larvas de la colonia Villavicencio comparados con la colonia Sibaté.

En un primer ensayo se probaron concentraciones entre 5 y 200 ppm del producto granulado B. sphaericus, y a las 24 horas se observó que todas las larvas de Cx. quinquefasciatus habían muerto y todas las larvas de An. albimanus permanecían vivas. Por esta razón, fue necesario ajustar las concentraciones diez veces menores para Cx. quinquefasciatus y subir las concentraciones para An. albimanus. Al respecto, Singh y Prakash (54) utilizaron concentraciones diferentes para evaluar B. sphaericus en larvas de An. stephensi y Cx. quinquefasciatus. Tal como se observa en las tablas 1, 2 y 4; las larvas de Cx. quinquefasciatus fueron más sensibles a concentraciones bajas entre 8 y 12 ppm del producto granulado de B. sphaericus comparadas con las larvas de An. albimanus las cuales mostraron alta toxicidad a concentraciones altas (500 ppm). Estos resultados son acordes con lo reportado por varios autores (18, 20, 26-28, 44, 55, 56), quienes observaron similar acción larvicida de B. sphaericus 2362 y otras cepas, sobre larvas de Cx. quinquefasciatus comparadas con larvas de otras especies de mosquitos.

En el presente trabajo se encontraron valores de CL₉₅ entre 6,4 y 7,3 ppm del producto granulado de B. sphaericus para larvas de Cx. quinquefasciatus; mientras que en larvas de An. albimanus se encontró una CL₉₅ entre 450,5 y 466,7 ppm. Similar tendencia encontraron Vilarinhos et ál. (27) para larvas de Cx. quinquefasciatus con CL₉₀ = 2,15 ppb de B. sphaericus 2362; mientras que en larvas de An. albimanus encontraron una CL₉₀ = 38 ppb; estas observaciones confirman la tendencia diferente de toxicidad de los productos de B. sphaericus en las dos especies de mosquitos.

Los resultados de este estudio muestran que las CL₅₀ y CL₉₅ presentan valores ligeramente más altos para larvas de An. albimanus colonia Cartagena comparados con la colonia Barranquilla; lo mismo se observó en larvas de Cx. quinquefasciatus colonia Villavicencio comparados con la colonia Sibaté. Lo anterior sugiere que la susceptibilidad de las larvas al producto granulado de B. sphaericus varía según la procedencia regional del mosquito.

A la Universidad de La Salle, a la Universidad Santo Tomás y al Instituto Nacional de Salud por la financiación de la investigación.

A la doctora Luz Marina Rondón Poveda, por su asesoría en la parte estadística.

Al auxiliar de laboratorio John Muñoz, del Instituto Nacional de Salud, por su colaboración en el mantenimiento de las colonias de mosquitos.

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