INTRODUCCIÓN
Muchos de los procesos fisiológicos requieren la actividad normal de la glándula tiroides y sus hormonas tiroideas (HT), por ejemplo, el crecimiento, la actividad reproductiva, el crecimiento de pelo y lana (1. Debido a lo anterior, y a que son muchas las funciones desempeñadas por estas hormonas, su síntesis es continua; se divide en tres etapas fundamentales: acumulación o fijación del yoduro del plasma, yodación de la tirosina y proteólisis de la tiroglobulina 2. Las HT principales son: la tiroxina (T4), triyodotironina (T3), sus fracciones libres (T4L, T3L), la rT3 y la calcitonina, todas bajo el control hipotalámico e hipofisario de la hormona liberadora de la tirotropina (TRH) y la hormona estimulantes de la tiroides (TSH, del inglés Thyroid-Stimulating Hormone)1-3. La T4 se considera la prohormona, y es deiodada en la periferia de los tejidos a T3, que es el metabolito más activo 1,2,4-6; más del 99 % de las HT circulan en sangre unidas a proteínas 2,7,8.
La actividad metabólica de casi todos los tejidos del cuerpo se incrementa por las HT, y su mecanismo de acción se da directamente en el núcleo 1-3. Dichas hormonas están implicadas en el metabolismo basal; el metabolismo energético 1,2,8-12; el desarrollo y maduración del cerebro 1,4,8); el aumento de la frecuencia cardiaca y la fuerza de contracción 2,5,11; la termogénesis y el desarrollo fetal; el crecimiento en asocio con la hormona del crecimiento (GH, del inglés Growing Hormone)1,8, y la insulina y los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF, del inglés Insuline-like Growth Factors)2,8. El funcionamiento y mantenimiento de la inmunidad pasiva también requieren las HT (13). El metabolismo de estas se da por inactivación y conjugación, principalmente en hígado, riñones y músculo esquelético 2,8,11,14.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se obtuvieron muestras de sangre en estado de ayuno de 48 ovinos menores de 7 meses de edad (25 machos y 23 hembras), de las razas rommy march, dorset y sus cruces, criadas en el municipio de Marulanda, Caldas, a una temperatura promedio de 14 °C, en un sistema pastoril de ladera y con consumo voluntario de gramíneas, principalmente kikuyo (Pennisetum clandestinum) y sal mineralizada al 6 %. La toma de las muestras de sangre se realizó en las horas de la mañana mediante venopunción en la yugular, luego de un ayuno de 12 h. Se refrigeraron las muestras mientras se llevaban al laboratorio; luego se centrifugaron a 3500 r. p. m. en una centrífuga (Thermo de serie IEC CL31 Multispeed) durante 15 min; posteriormente, fue extraído el suero; este se conservó a -30 °C hasta su análisis.
Para la determinación del T4 libre se utilizó la prueba de inmunoensayo enzimático competitivo (Accubind T4L, MonobindInc(c)). Los sueros fueron colocados en contacto con una fase sólida que contenía anticuerpos contra la T4 a la cual se le agregó el conjugado compuesto por T4 libre unido a peroxidasa de rábano (HRP). Luego de una hora de incubación a temperatura ambiente, se hizo un lavado para liberar aquellas moléculas no unidas y se agregó el substrato formado por una mezcla de tetrametil bencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno disuelto en buffer de acetato, con una incubación de 15 min, tiempo al cabo del cual se detuvo la reacción al agregarle una solución de ácido clorhídrico 1N. La lectura se hizo en un equipo lector de micro ELISA (TitertekMultiscan(tm)) a una absorbancia de 450 nm. Las absorbancias obtenidas de los estándares se graficaron junto con las concentraciones, y de la curva de calibración se obtuvieron las concentraciones de T4 libre de las respectivas muestras.
Para la determinación de las concentraciones de TSH, se utilizó una prueba de inmunoensayo enzimático colorimétrico tipo sándwich, utilizada para la cuantificación del TSH de origen humano (Accubind TSH-MonobindInc(r)). A una placa de 96 pozos que tenía unidos anticuerpos monoclonales contra la TSH en una interacción estreptavidina-biotina se le agregó una alícuota de suero obtenido de ovinos jóvenes, y una alícuota de conjugado compuesta de un anticuerpo policlonal contra la TSH unido a la peroxidasa de rábano. Se incubó dos horas a temperatura ambiente, tiempo al cabo del cual se lavó la placa con una solución de fosfatos para eliminar todas aquellas moléculas no unidas, y se agregó el substrato formado por una mezcla de TMB y de peróxido de hidrógeno.
Gracias a la presencia de la enzima en el complejo inmune previamente formado, se generó oxígeno a partir de peróxido de hidrógeno, el cual, al actuar sobre la TMB, generó un cambio de color cuya intensidad es proporcional a la concentración de la hormona; para detener la reacción enzimática luego de un periodo de incubación de 15 min se agregó ácido clorhídrico 1N, y posteriormente se procedió a hacer la lectura en un fotómetro lector de micro-ELISA (TitertekMultiscan(tm)) a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados obtenidos de los estándares se graficaron frente a sus concentraciones, lo cual generó una curva de calibración en la que se pudieron obtener las concentraciones de cada uno de los sueros probados. Los kit para T4 y TSH fueron validados para su uso en muestras de ovinos, en el laboratorio, utilizando sueros y plasma sanguíneo, con lo cual se obtuvieron buenas curvas de paralelismo. En la validación se trabajó con 50 muestras por triplicado en mediciones intradia e interdia, con lo que se obtuvo un coeficiente de variación de 8 y 9 %, respectivamente. Los resultados fueron analizados por medio de Anova simple; se obtuvo el cálculo del promedio, la desviación estándar y el rango, el mínimo y el máximo para la cuantificación de TSH y T4 libre en cada uno de los grupos determinados (hembras jóvenes frente a machos jóvenes). Se evaluaron las diferencias sobre los distintos grupos por medio de un análisis de varianza usando el programa Statgraphics Plus 5.1; se aceptaba diferencia estadísticamente significativa cuando p < 0,05.
RESULTADOS
La TSH de las ovejas machos menores de 7 meses registraron valores (μUI/ml) de promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de 0,09; 0,0; 0,57; 0,15, respectivamente, mientras que las ovejas hembras menores de 7 meses registraron valores (μUI/ml) de 0,34; 0,0; 0,57; 0,15, respectivamente. El p valor del test F fue de 0,147 (p ≥ 0,05), por lo cual no hay diferencia estadísticamente significativa, con una confiabilidad del 95 % para la TSH en ovinos jóvenes con respecto al género. La T4L de los ovinos machos menores de 7 meses registró valores (ng/dl) de promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de 0,66; 0,31; 1,17; 0,24, respectivamente, mientras que las ovejas hembras menores de 7 meses registran valores (ng/dl) de 0,44; 0,13; 0,73; 0,21, respectivamente. El p valor del test F fue de 0,04 (< 0,05), por lo cual hay diferencia estadísticamente significativa, con una confidencia del 95 % para la T4L en ovinos jóvenes con respecto a la edad.
DISCUSIÓN
Experimentos realizados en animales han evidenciado que las variaciones en la secreción de HT pueden ser influenciadas por variables como género y edad, ya que hembras tanto castradas como enteras presentan mayores concentraciones de T4 si se comparan con machos enteros y castrados. Igualmente, tales estudios demuestran que los animales de menor edad presentan concentraciones más altas de T4 que los animales adultos y viejos (1,8.
La TSH es el regulador más importante de la HT, y esta a su vez es regulada por la retroalimentación negativa de las HT 2,8,11,15; es por esto por lo que los ajustes para mantener la cantidad normal de la hormona libre ocurren con rapidez mediante una disminución de la velocidad del metabolismo o con una estimulación para que se produzcan HT a través de la liberación de TSH y TRH.
Sin embargo, algunos factores que ocurren en las hembras como la preñez pueden afectar estas concentraciones 2,8,11, pues hacia el final de la gestación se ve una disminución de las concentraciones de las HT debido a una competencia por la afinidad de yodo y el metabolismo materno 2,8. Además, los estrógenos que aumentan al final de esta etapa incrementan la síntesis de TBG (del inglés Thyroid Binding Globulin) hepático, el cual liga más T4 y T3 del suero, lo que produce una baja transitora de hormonas libres que a la vez acrecienta la síntesis de HT 2,8,11. En los ovinos machos adultos, la T4 influye en la síntesis de testosterona mediante el control de la hexosemonofosfatasa, que proporciona una fuente de energía para la esteroidogénesis 3,16. Por otro lado, autores han justificado que los esteroides sexuales como los estrógenos reducen el catabolismo de TBG, mientras que los andrógenos inhiben en la zona hepática la síntesis de TBG y la secreción de TSH por la pituitaria; por tal motivo, esto altera las concentraciones de T4 total en la zona del plasma 2,8.
En cuanto al desarrollo y el crecimiento, las concentraciones de T3 se relacionan con mayor crecimiento en corderos 13. No obstante, se debe tener en cuenta el papel que desempeña la GH y la insulina en estos procesos para demostrar la verdadera influencia de las HT en los procesos de crecimiento y engorde 17.