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Introducción
La inseminación artificial es una técnica que tiene como fin potencializar el mejoramiento genético en la creciente industria ovina de Colombia. En la práctica, se realizan dos inseminaciones con semen líquido fresco o refrigerado entre 8 y 12 h de intervalo, para inseminación cervical. Existen otras metodologías de inseminación, como la laparoscopia, que involucra el uso de semen criopreservado, con dosis seminales de aproximadamente 50 a 200 millones de células por mililitro. Cuando el número de individuos que se van a inseminar es alto, se requiere más de una colecta, en las que los eyaculados son sometidos a altas diluciones para ser almacenados en fresco, líquidos o congelados (1,2). Se requiere que la calidad del eyaculado por procesar sea óptima para garantizar mayor resistencia a los procesos de manipulación. Los ovinos con los mejores parámetros de calidad poseyaculación y adecuada transmisión genética de las características pueden ser usados como sementales para la creación de bancos de germoplasma, y de esta forma se garantizará la fertilidad por un número de espermatozoides con alto rango de supervivencia al procesamiento (2).
La libido de los individuos, la capacidad de recuperación entre montas y el número de hembras para servicio en un periodo corto afectan la calidad o la capacidad de las células espermáticas en los diferentes eyaculados. El tránsito en el epidídimo facilita la maduración espermática para adquirir la capacidad fertilizante, previo a un proceso de maduración final llamado capacitación (3). Las diferencias en el tiempo de tránsito epididimal proveen un mecanismo de variabilidad en la respuesta a diferentes cambios de temperatura, lo cual explica por qué los eyaculados de un mismo individuo son completamente heterogéneos y pueden variar en su calidad, dependiendo del tiempo de almacenamiento en el reservorio epididimal (3,4). Otros factores pueden afectar la calidad seminal (volumen, concentración, motilidad, normalidad, etc.), como la época del año, la edad, la raza y la frecuencia de montas; aquí se observa que las sucesivas eyaculaciones pueden alterar el volumen y la concentración espermática (2). Las razas estacionales que se encuentran en latitudes cercanas al Ecuador presentan un comportamiento reproductivo en el que no se define por completo una época reproductiva y no reproductiva (5). Por otro lado, la introducción de la especie ovina en Colombia se remonta a la época de la Conquista, lo que ha llevado a la reproducción de una raza denominada criolla, producto de una serie de cruces entre razas que le permiten ser altamente rústica y adaptada a las condiciones del medio.
Nel-Themaat et al. (6) observaron que el segundo eyaculado presenta mayor motilidad comparado con el primero, los cuales fueron colectados con un intervalo inferior a 10 min en ovinos nativos del golfo. Similares resultados fueron encontrados por Ollero et al. (3), quienes observaron que el segundo eyaculado presentó mayores valores de viabilidad, medido en función de integridad de la membrana, motilidad individual progresiva y menores resultados en la integridad del acrosoma. Todo lo anterior se relaciona de igual forma al periodo de abstinencia, la cual a los 3 días presentó los mayores valores para los parámetros evaluados (3). Otros autores reportan el efecto de la frecuencia de colecta sobre los parámetros de calidad seminal en rumiantes (7), pero en algunos casos no se registra el uso específico de algún eyaculado.
La motilidad es uno de los parámetros más usados en la evaluación de la calidad espermática; describe el estado energético de los espermatozoides (8). Es uno de los aspectos más importantes para que logre la fertilización la célula espermática; sin embargo, su evaluación sigue siendo muy subjetiva en los ensayos de rutina (9). En los últimos años se ha venido publicando el uso de sistemas computarizados para la evaluación de la motilidad espermática, y se ha realizado un arduo trabajo en la estandarización de las condiciones del sistema en ovinos (4,8,10-13). La evaluación de los parámetros de calidad en función de la cinemática espermática ha sido pobremente estudiada en las razas ovinas de lana, y su cono cimiento permitiría encontrar patrones de adaptación a las condiciones de producción en el trópico.
La estacionalidad reproductiva en ovinos es una característica común de las razas en latitudes templadas, pero se ha observado que es menos marcada en el trópico, donde se presenta reproducción durante todo el año (14). A pesar de esto, existe limitada información sobre cómo otras razas adaptadas al trópico exhiben actividad reproductiva durante todo el año (15). El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del eyaculado y la raza en 4 periodos de colecta sobre los parámetros de calidad seminal y motilidad espermática en 3 tipos raciales ovinos de lana bajo condiciones de trópico alto colombiano.
Materiales y métodos
Ubicación
La presente investigación se realizó en el Centro Agropecuario Marengo de la Universidad Nacional de Colombia (CAM), en las instalaciones del Centro de Investigación Desarrollo Tecnológico y Extensión Ovina (Cidteo). El CAM se encuentra ubicado en el departamento de Cundinamarca, municipio de Mosquera, vía a Facatativá. Tiene una latitud norte de 4° 42' y 74° 12' de longitud oeste. La precipitación promedio es de 803,025 mm año, con una temperatura media de 13,6 °C a 2543 m s. n. m. y una humedad relativa de 81,57 %.
Unidades experimentales
El semen fue colectado de 12 machos reproductores pertenecientes a 3 razas, distribuidos de la siguiente forma: 4 criollos, 4 romney marsh y 4 hampshire, entre los 2 y los 5 años, con adecuado estado de salud (previamente evaluado, basados en un examen físico y sanitario), alimentados con una dieta que garantizó el consumo de energía diario recomendado. Se adicionaba suplementación con silo (100 g/animal/d) y concentrado (150 g/animal/d).
Colecta del semen y evaluación
La colecta se realizó usando vagina artificial, bajo el protocolo aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, de la Universidad Nacional de Colombia (CB-074-2014). Los machos se encontraron en las mismas condiciones de colecta, con un acostumbramiento previo al inicio del trabajo de 30 días. Fueron colectados individualmente y cada eyaculado fue separado como eyaculado 1 y eyaculado 2. Se determinó el volumen espermático en un tubo aforado. Previo a la evaluación microscópica, se realizaron diluciones consecutivas con el fin de obtener una concentración final de 40 X 106 SPZ/ml, para facilitar el rango operacional del sistema computarizado, garantizando un coeficiente de variación mínimo. El medio de mantenimiento espermático llamado medio fosfato-HEPES-sucrosa fue compuesto por sacarosa 10 %, HEPES 1 %, sodio-fosfato monobásico 0,5 M y EG TA 100 mm (16), a una temperatura de 37 °C. Las características espermáticas microscópicas se evaluaron mediante el uso de un sistema computarizado de análisis seminal (IVOS; Hamilton Thorne Research, Beverly, MA), bajo la configuración Ovino Viadent 10X NH CM040GE, que captura 31 fotogramas por segundo, y evalúa la motilidad progresiva, la motilidad total, la concentración espermática, los parámetros de cinemática, la normalidad morfológica y la viabilidad. Una muestra de 3 fue cargada en una de las cámaras Leja ® de 4 cámaras, con una profundidad de 20 µm. Para cada muestra, se evaluaron en promedio 5 campos ubicados en el retículo central de la cámara, y se contaron en promedio 340 células por muestra.
Los valores de cinemática determinados para cada espermatozoide representan la velocidad del movimiento, la amplitud de la trayectoria de la cabeza del espermatozoide y la frecuencia del cambio de dirección de la cabeza (tabla 1) (17).
Fuente: Mortimer ST. CASA-Practical aspects andrology lab corner. J Andrology. 2000;21:515-24.
Tabla 1 Parámetros de cinética espermática
La opción Viadent se implementó para determinar la viabilidad espermática mediante una tinción de bizbenzimida trihidrocloruro (Hoeschst 33259, 5 ug/ml) que penetra únicamente las membranas dañadas. La opción Viadent usa luz visible (luz azul de emisión de diodo) para determinar el número de células no viables. La evaluación de la normalidad morfológica se basó en la posición de la cola y la presencia de gota citoplasmática; se clasifican como anormalidades (cola enrollada: CT; cola doblada: BT; gota citoplasmática distal: DCD; gota citoplasmática proximal: PCD), con una valoración en porcentaje.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de medidas repetidas en el tiempo en el paquete estadístico SAS (9.3.1, 2016) empleando el método Proc Mixed; las variables respuesta fueron sucesivamente las características de calidad seminal (volumen, concentración, motilidad masal, motilidad total, motilidad progresiva, morfología, viabilidad) y las variables de cinemática evaluadas por el sistema computarizado. Los efectos sobre el modelo fueron el eyaculado (primero y segundo), la raza (criolla, romney marsh y hampshire) y el muestreo. La estructura del análisis dependió del BIC (criterio de selección: el menor valor) y cada variable fue analizada de forma individual según dicho criterio.
Resultados
Parámetros de calidad seminal
El promedio de volumen espermático, motilidad total, motilidad progresiva, concentración, viabilidad y morfología espermática del primer y segundo eyaculado para cada una de las razas se resume en la tabla 2. El volumen y la viabilidad presentaron diferencias estadísticas; fueron mayores en todos los casos en el primer eyaculado comparado con el segundo eyaculado, independientemente de la raza. Para el caso de la concentración espermática, se observó que en el primer eyaculado fue significativamente mayor al segundo eyaculado, y a través del tiempo se presentaron cambios significativos en la concentración. No hubo diferencias significativas (p > 0,05) en el porcentaje de motilidad total y motilidad progresiva para el primer y segundo eyaculado, al igual que no se observó efecto de la raza para estas variables.
Tabla 2 Parámetros de calidad seminal de dos eyaculados consecutivos en machos criollo, romney marsh y hampshire. Los valores se presentan en medias, EEM y valor de p para el efecto raza y eyaculado
En el caso de la normalidad morfológica espermática (figura 1), se observó que la interacción raza-tiempo fue significativa (p = 0,0086); se encontró que la raza criolla es superior en la mayoría de los muestreos. En el segundo eyaculado hubo una disminución de la normalidad morfológica en general de las tres razas, probablemente relacionado con una disminución en la libido de los animales, ya que los muestreos generaron presión sobre estos al tener periodos de abstinencia cortos. En su totalidad, la normalidad morfológica de los eyaculados evaluados para las tres razas estuvo dentro de los estándares esperados para ser clasificados como eyaculados satisfactorios; este valor fue >70%, como lo reporta Kasimanickam et al. (1).
Cinemática espermática
La definición de cinemática es la variación geométrica en el tiempo de los aspectos del movimiento (18). Los parámetros de ALH, LIN, STR y VAP no presentaron diferencias entre el primer y segundo eyaculado, pero se observó un efecto significativo (p < 0,05) de la raza y el tiempo para estas variables (figura 2).
Figura 2 Promedio y EEM para las variables cinemáticas de ALH, LIN, STR y VAP en relación con el tiempo y la raza
La amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH) es una variable medida en función de la distancia total que recorre la cabeza durante determinada trayectoria. Un valor muy alto se relaciona con trayectorias irregulares como las que se observan en eyaculados con espermatozoides hiperactivos, superando un valor de 7 µm (17). El promedio de ALH para todas las muestras analizadas fue de 4,90 µm. Se considera que el valor límite para espermatozoides hiperactivo en ovinos ha sido previamente establecido con un ALH > 7 µm y una linealidad < 45 % (19). Este hecho no hace referencia a un movimiento hiperactivo, pero sí a un movimiento más amplio que permitiría tener un recorrido mayor en la trayectoria de la célula. Los parámetros VSL y WOB presentan un efecto significativo para raza, eyaculado y tiempo. En general, VSL y WOB presentan mayores valores en el eyaculado 2. Se resume en la tabla 3.
La variable BFC hace referencia al número de veces que la cabeza del espermatozoide cruza de dirección y está relacionado con el movimiento en ondas del flagelo (17). En las condiciones del presente experimento no se observó efecto significativo del tiempo, eyaculado o raza, ni se presentaron interacciones entre estos factores, al igual que en los valores de la variable VCL.
Discusión
La estimación de los parámetros de calidad comúnmente usados en las evaluaciones de rutina ha sido blanco de controversia por su pobre relación con la habilidad fertilizante del eyaculado (3). Sin embargo, la integración de un sistema objetivo de evaluación, junto con la implementación de tinciones fluorescentes que determinan la integridad de la membrana, puede ser un criterio más relevante para determinar el potencial fértil de un eyaculado (8,17). La valoración de los parámetros de cinemática es el reflejo de la capacidad del espermatozoide para migrar a través del tracto genital femenino e interactuar con el oocito en la fertilización (20); una característica que a futuro puede representar una herramienta sistemática útil para la predicción de la calidad seminal de un eyaculado, ya sea para su implementación en inseminación artificial en fresco, o procesos de criopreservación, y que en la actualidad sirve para clasificar los eyaculados en porcentajes de subpoblaciones que tienen alta relación con la fertilidad (4,21).
Este estudio compara el primer y segundo eyaculado de tres razas ovinas de lana, en condiciones de trópico alto colombiano con relación al volumen, motilidad total, motilidad progresiva, concentración, viabilidad y morfología, en 4 periodos de colecta con un intervalo de abstinencia de 3 días. Se observó en función de la motilidad progresiva y la motilidad total que no hubo cambios significativos entre eyaculados, a pesar de ser mayores los valores de motilidad en el primer eyaculado. Lo anterior contradice los resultados publicados por Abadjieva et al. (20), que observaron la existencia de una clara tendencia a presentar mayores valores en el segundo eyaculado para motilidad total (p < 0,05), teniendo en cuenta la estacionalidad reproductiva en machos de la raza bulgarian milk. Similares resultados observaron Ollero et al. (3), que evaluaron la diferencia entre el primer, segundo y tercer eyaculado en estación reproductiva de machos de la raza rasa aragonesa, en los que es superior la motilidad en el segundo eyaculado comparado con los demás. Los efectos de tener una adecuada motilidad se observan en procesos de criopreservación del semen, al presentar mayor motilidad posdescongelación (6). Es probable que el comportamiento de la motilidad se relacione con un sistema de adaptación a las condiciones del medio en el que las tres razas evaluadas (criollo, romney marsh y hampshire) se encuentran, ya que no se ha reportado estacionalidad reproductiva en las condiciones de trópico bajo, en las cuales se realizó el estudio. A su vez, las condiciones climáticas del experimento fueron óptimas en cuanto a la disponibilidad de alimento.
La viabilidad evaluada como integridad de membrana fue significativamente mayor en el primer eyaculado comparado con el segundo, independientemente de la raza o el periodo de colecta. Este resultado difiere con lo observado por el estudio de Ollero et al. (3), probablemente debido a las diferencias experimentales, ya que en dicho estudio fue en condiciones de estacionalidad reproductiva en el hemisferio norte. Lo anterior refleja que el primer eyaculado es probablemente mejor en función de la viabilidad.
Tradicionalmente, la concentración espermática y el volumen seminal se consideran parámetros de importancia para la mayoría de los estudios de inseminación artificial (22,23). La concentración y el volumen disminuyeron de forma significativa entre el primer y segundo eyaculado, resultado similar a lo reportado por otros autores en ovinos (2,3,6). Este fenómeno se considera como un proceso fisiológico normal, resultado de la eyaculación consecutiva, en relación con la función del reservorio espermático, con posible efecto racial como lo describen Stellflug y Berardinelli (24). Por otro lado, la concentración tiene una connotación negativa sobre la normalidad morfológica en dosis seminales (23). Lo anterior se explica por una disminución en la capacidad endógena del plasma seminal para eliminar la producción de radicales libres alrededor de cada espermatozoide eyaculado, lo que afecta la funcionalidad de las células, y esta varía entre cada eyaculado (25).
El conocimiento de los parámetros de cinemática espermática para las razas que se encuentran en condiciones de trópico es indispensable para identificar los diferentes elementos que pueden explicar su adaptabilidad al medio. Los parámetros cinemáticos van a cambiar dependiendo del medio en el que se encuentren las células espermáticas, como observaron Mortimer y Maxwell (26) al comparar los parámetros cinemáticos en plasma seminal, medio PBS (búfer fosfato salino) y ASP (plasma seminal artificial). Por lo tanto, las diferencias en la disponibilidad de plasma seminal en un eyaculado entre razas posiblemente afectan las variables de movimiento celular in vivo. El medio de evaluación seminal de este estudio era un medio enriquecido para el mantenimiento de las células espermáticas que busca no afectar su fisiología (16). Adicionalmente, durante el proceso de evaluación se garantizaron las mismas condiciones de evaluación y se implementaron los elementos recomendados por el fabricante (Hamilton-Thorne) para la evaluación espermática.
Los valores de cinemática observados en el presente estudio difieren completamente de los valores reportados por Abadjieva et al. (20), que para la raza bulgarian milk (raza sintética) fueron inferiores; pero en el caso de las razas puras evaluadas por Kasimanickam et al. (27), los valores estuvieron más acordes con los obtenidos en este estudio. Con respecto a los estudios realizados en la raza rasa aragonesa, se observa que los parámetros de cinemática del presente estudio son mayores para las diferentes velocidades comparadas con lo hallado por Palacín et al. (8), quienes a su vez reportan valores inferiores de motilidad progresiva (49%), que es un reflejo de la velocidad y linealidad con la que avanzan los espermatozoides a través de un medio.
Los valores de la velocidad (VCL, VSL y VAP) son medidos en unidades de distancia (µm/s). El VSL es siempre el valor de velocidad más bajo para cualquier espermatozoide y generalmente los valores son muy similares al VAP. En el caso en el que la cabeza presenta un movimiento lineal y regular, con muy poco movimiento lateral, el VAP es similar al VSL. En casos contrarios en los que hay mucho movimiento lateral, el VAP puede ser mucho más grande, disminuyendo el valor de STR del movimiento (17). En este estudio se observó que la raza criolla presentó mayores valores para VSL y VAP comparado con la raza romney marsh, lo que podría sugerir la capacidad de las células para recorrer mayor distancia en menor tiempo.
Por otro lado, se ha reportado la importancia de variables como la viabilidad y la velocidad curvilínea (VCL) como predictores de la fertilidad en ovinos (21), relacio nado con las tres subpoblaciones espermáticas descritas para esta especie, según el patrón de cinemática que presentan (lenta, no lineal; rápida, lineal; rápida, no lineal) (28). También se ha comprobado que los espermatozoides de ovinos con alta fertilidad presentan mayores valores de viabilidad, VCL y VSL que los de ovinos de baja fertilidad (29). Lo anterior está asociado a la necesidad de las células espermáticas de penetrar la mucosa viscosa del oviducto para lograr la fertilización. La presencia de espermatozoides con motilidad vigorosa (VCL) y viabilidad pueden incrementar la probabilidad de un mayor número de espermatozoides para fertilizar (4).
El eyaculado mamífero es muy heterogéneo y contiene subpoblaciones espermáticas con importantes di ferencias en sus características cinemáticas (30), o en procesos como apoptóticos, capacitados y reaccionados (acrosoma), procesos que involucran cambios en la membrana plasmática (28). Tales condiciones pueden explicar la presencia de diferentes patrones de motilidad (cinemática) que caracterizan a las subpoblaciones espermáticas, y cambios en la proporción de estas poblaciones pueden afectar el éxito en el proceso de fertilización como se ha descrito en ovinos (4), en venado rojo ibérico (31), humano (32), entre otras especies. Desde hace dos décadas el estudio de las subpoblaciones ha tenido relación con la fertilidad (33).
Los sistemas de análisis computarizado (CASA) permiten la diferenciación de espermatozoides individuales de acuerdo con sus características de motilidad, y son uno de los métodos más confiables para el estudio de subpoblaciones espermáticas (30). La evaluación cinemática permite a cada espermatozoide por individual ser asignado dentro de una subpoblación específica de acuerdo con las trayectorias obtenidas para el análisis de cada muestra (30), pero no existe una prueba incluida en los análisis de calidad que complemente dicha información. Para poder llegar a estas pruebas, es importante conocer la fisiología de las células y el efecto de la raza y el ambiente sobre las características del eyaculado. De hecho, las subpoblaciones pueden actuar como marcadores de una buena o mala calidad del eyaculado (34,35).
Conclusiones
En el presente estudio se observan diferencias entre el primer y segundo eyaculado para las variables de volumen, concentración y viabilidad independientemente de la raza evaluada. Para el caso de la normalidad morfológica, el segundo eyaculado presenta mejores porcentajes de células normales con respecto al primer eyaculado, lo que representa un efecto significativo de la raza, en el que la raza criolla es superior en normalidad morfológica. En cuanto a la cinemática, las variables de VSL y WOB fueron superiores en el segundo eyaculado, además de tener un efecto significativo de raza. Por otro lado, las variables relacionadas a la velocidad y progresividad en la motilidad de las células (ALH, VAP, STR, LIN) no presentaron diferencias entre eyaculados, pero sí se observó que la raza criolla presenta valores mayores de forma significativa, lo que posiblemente indicaría que los espermatozoides de la raza criolla tienen la capacidad de recorrer mayores distancias en menor tiempo, comparados con los de otras razas.
