Introdução

O Brasil atualmente tem o maior rebanho comercial do mundo, sendo considerado um dos maiores produtores de carne bovina, com uma população média de 209 milhões de animais, obtendo-se desse rebanho um contingente de vacas e novilhas de 74 milhões em fase reprodutiva. Diante disso, com os avanços da genética e busca de desejáveis progressos na produtividade, a biotecnologia de sexagem tem sido otimizada e estudada, com o intuito de produzir mais com menor custo (¹).

Com isso, pode-se notar que o sexo do bezerro é um dos fatores determinantes para o desempenho do agronegócio, principalmente quando direciona-se para a produção leiteira, onde o bezerro macho tem pouco ou quase nenhum valor. Em contrapartida o bezerro macho, na bovinocultura de corte tem um valor econômico mais interessante pelo seu potencial produtivo.

Dessa forma, o uso do sêmen sexado (SS), tem evoluído em pesquisas, principalmente em escalas comerciais. Com a evolução das técnicas de sexagem, percebeu-se que espermatozóides machos (com cromossomo Y) tem diferença em 4% de DNA das células espermáticas de fêmeas (espermatozóide X possui cerca de 4% mais material genético que espermatozóide Y), além disso, a forma e a área da cabeça dos espermatozóides dos bovinos facilitam a sua separação por meio de citometria de fluxo CF (²). Diante desses dados, Lima (³) complementa a idéia de que para o uso comercial da sexagem de espermatozóides deve-se haver uma metodologia que seja compatível com o processo de congelação, reduzindo a perda de espermatozóides e fazendo com que não haja comprometimento do poder fecundante dos mesmos.

A partir desses estudos na evolução de um modelo que seja eficiente no seu processo de sexagem espermática, descobriram-se técnicas avançadas como a CF e a centrifugação por gradiente de densidade, que tem levado a alguns resultados diante da aplicação comercial. Desta forma, essas técnicas têm sido estudadas com maior clareza e objetividade com o intuito de diminuir a agressão ao espermatozóide em etapas de manipulação e classificação, exposições a laser e corantes, fazendo com que este se torne capacitado para fecundar o óvulo e resulte em boa acuidade na separação dos espermatozóides X e Y.

Recentes avanços na forma da ponteira do CF, no posicionamento das células espermáticas no momento da passagem pelo laser, assim como modificações na pressão e no tipo de coloração das células, melhoraram significativamente o processo de separação dos gametas X e Y (⁴). Deste modo, a revisão teve como objetivo apresentar a origem do sêmen sexado, requisitos e técnicas de sexagem espermática.

Històrico da sexagem espermática

Segundo Johnson e Welch (⁵), os primeiros estudos realizados procurando separar as duas populações de espermatozóides remontam à década de 20, quando foi tentado, sem sucesso, a separação dos dois tipos celulares recorrendo à centrifugação de sêmen. Em meados do século XX, foram realizados vários estudos na área de ciências biológicas, com foco no melhoramento genético. Desse modo, descobriram e identificaram os cromossomos sexuais e consideraram os espermatozóides iguais em suas características (⁴), devido a pequenas diferenças não significativas entre os espermatozóides que carregavam o cromossomo X ou o Y como tamanho, peso, densidade, velocidade, cargas elétricas de superfície, proteínas macromoleculares de superfície, efeitos de pH e pressão atmosférica (⁶). O sexo é determinado em mamíferos, através da informação cromossômica (X ou Y) transportada pelo espermatozóide. A sexagem destes proporcionou avanço nas técnicas que buscam produzir uma prole de um determinado sexo (⁴).

As primeiras espécies estudadas com intuito de pré-seleção sexual com base em separação de espermatozóides foram coelhos e suínos, em que foi utilizado o método da centrifugação por gradiente de densidade num meio composto de plasma seminal e liquido vaginal purificado de coelhos. Porém, essa pesquisa não demostro ser método prático para controlar a relação do sexo entre os descendentes dos animais em experimentação (⁷).

O intuito da aplicação comercial de sexagem de espermatozóides varia de acordo com a metodologia utilizada e a compatibilidade do processo de congelação, a fim de causar perdas mínimas de espermatozóides durante o processo e não provocar a redução do poder fecundante dos mesmos (³).

Por tanto, a utilização de diferentes maneiras de sexagem faz com que os espermatozóides e o DNA destes sofram danos irreversíveis, comprometendo a eficiência no processo de fertilização e produção de embriões (⁸). Dessa forma, há uma preocupação com os danos causados aos espermatozóides devido à manipulação excessiva, uso de corantes e posterior incubação, além de alterações advindas dos processos de classificação e centrifugação, levando com esses fatores a uma diminuição das taxas de gestação, que terminam sendo menores, em geral, quando do uso da inseminação artificial (IA) com SS em relação à inseminação artificial com sêmen convencional SC (⁸).

Vantagens e desvantagens da utilização do sêmen sexado

Em estudos comparando o SS com o SC, demonstrou-se que o primeiro tem obtido resultados de taxa de prenhez inferiores ao último. Justifica-se a queda da fertilidade do SS devido à redução da viabilidade espermática produto dos processos da sexagem, a criopreservação no nitrogênio líquido e a baixa concentração espermática na dose inseminante em relação ao sêmen não sexado. Desta forma, diante da disponibilização de sêmen de empresas deste ramo, cabe ao produtor avaliar o custo benefício dessa tecnologia (⁶). A necessidade de pré-determinar o sexo dos bezerros é de interesse de muitos produtores de leite, visto que se necessita de novilhas de reposição em seus próprios rebanhos, assim como a valorização três vezes maior em dinheiro de novilhas leiteiras quando comparadas aos filhotes machos (⁹).

O emprego da biotecnologia de sexagem de sêmen otimizou a produtividade, permitindo um avanço genético rápido com a seleção de animais com sexo desejado, adquirindo uma produção maior com menor custo (¹). Na produção de bovinos tem-se avaliado o potencial desta técnica, devido a fatores limitantes à sua aplicação como o custo extra da dose de SS, a variação na fertilidade do SS em relação ao SC e a precisão da definição do sexo do produto (¹⁰).

Na pecuária de leite e corte, o valor econômico da seleção de sexo é de grande importância, o que faz a produtividade de um sistema ser favorecido pela progênie de um dos sexos. Devido a isso, em programas de melhoramento genético animal houve um aprimoramento e difusão de biotecnologias de reprodução, aumento daeficiência dos sistemas de produção, o que beneficiou o surgimento das técnicas de seleção de sexo baseada na separação de espermatozóides portadores de cromossomos X e Y e embriões pré-implantados, em espécies de interesse zootécnico (¹¹).

Existem várias vantagens para o uso do SS na produção de bovinos, mas observam-se limitações as quais restringem a utilização desta tecnologia. Segundo Seidel e Schenk (¹²), citados por Dalton (¹³), a diminuição nas taxas de concepção quando a inseminação é feita com SS pode se dever a lesão ao espermatozóide durante o processo de coloração antes da CF; exposição do espermatozóide ao raio laser forte durante a separação e centrifugação para concentrar os espermatozóides antes dacolocação nas palhetas.

Para Mocé et al. (¹⁴), a redução na fertilidade com uso do SS se deve ao fato de que ainda não se consegue saber se a amostra de sêmen de um touro é capaz de resistir ao processo de sexagem e ainda manter uma fertilidade aceitável antes de se fazer a separação, congelamento e descongelamento e, que no uso da técnica de CF ocorrem alterações na membrana espermática que aceleram o processo de reação acrossômica no espermatozóide após a criopreservação (pré-capacitação), acarretando em uma diminuição da sobrevida do espermatozóide sexado no genital da fêmea.

Mocé et al. (¹⁴), encontraram que para minimizar os problemas de aceleração da capacitação e reação acrossomal, deve-se realizar mudanças no processo de sexagem e no processo de congelamento, o que pode resultar em aumento da fertilidade do SS. Dentre essas mudanças, existe o efeito da alta diluição, osmolaridade dos tampões, temperaturas de coloração e separação, efeitos de intensidade do laser, tempo e força de centrifugação para concentrar espermatozóides sexados, diluente de congelação, taxa de refrigeração, intervalo entre refrigeração e criopreservação (¹⁵).

Através da utilização da criopreservação, tem-se um aumento na utilização do sêmen à longa distância, maximizando assim sua aplicação em outras biotécnias da reprodução. Assim, a partir do uso da técnica utilizada para separação espermática, a criopreservação necessita de mudanças nos protocolos usados para IA com o intuito de maximizar a viabilidade do sêmen aumentando a taxa de prenhez. Como solução para aumentar a taxa de prenhez, deve-se utilizar o sêmen sexado o mais próximo o possível do local de fertilização, assim como no momento mais próximo possível da ovulação (¹⁴).

Dessa forma, várias técnicas de sexagem continuam a ser testadas, entretanto nenhuma ainda conseguiu reunir os dois critérios essenciais: sexagem com precisão e manutenção da fertilidade dos espermatozóides (¹⁶).

Para a utilização em larga escala de SS torna-se claro que ainda existem alguns detalhes que precisam ser aperfeiçoados na técnica como: tempo de separação, viabilidade e número de espermatozóides por dose inseminante, diluidores específicos para permitir o transporte e preservação do SS, além do custo da dose inseminante (¹⁷).

Características estruturais do sêmen sexado criopreservado

As características estruturais do espermatozóide estão voltadas para o sucesso da concepção. Para que uma célula espermática seja considerada qualitativamente viável e potencialmente fértil, é necessário que possua morfologia, atividade metabólica e membranas plasmáticas normais, ademais de DNA intactos (¹⁸). Freitas (¹⁹), realizou avaliação morfológica do SS após a criopreservação, pela técnica de epifluorescência, onde foram utilizados associações dos corantes Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio (para demarcar as células com ruptura de membrana) e sondas fluorescentes, e verificou a integridade de membrana plasmática, acrossomal e a função mitocondrial (Figura 1).

Quando o sêmen é depositado no útero, ocorrem modificações na célula espermática (²⁰), que induz a reação acrossômica e hiperativação do espermatozóide, possibilitando sua entrada no ovócito (²¹).

A base molecular do processo de capacitação espermática é a remoção de colesterol e alteração da distribuição dos fosfolipídios de membrana que resultam na abertura dos canais de Ca++. Modificações semelhantes podem acontecer na crioinjúria levando à ocorrência de uma capacitação espermática antecipada, o que não é desejável por diminuir a longevidade do espermatozóide. Logo, o alto potencial de membrana mitocondrial encontrado no sêmen de animais tratados com o diluente TRIS pareceu indicar que estes espermatozóides podem ter iniciado a capacitação espermática prematura (¹⁹).

No trabalho desenvolvido por Mocé et al. (¹⁴), verificare que o processo de sexagem induz mudanças na membrana do sêmen o que acelera o processo da capacitação e da reação acrossômica dos espermatozóides após a criopreservação.

Avaliando os índices de prenhez, quando utilizadas doses na mesma concentração para os SS e não-sexado, fresco e congelado, a fertilidade do SS foi inferior ao SC em várias espécies (²²), indicando que danos devido à sexagem também foram expressos com baixas taxas de prenhez (²³). Do mesmo modo, altas percentagens de degeneração embrionárias foram observadas em novilhas superovuladas quando foi realizada a inseminação com SS (53%), comparado com o SC (24%) (²⁴).

Produção leiteira

Na pecuária de leite a qual têm como característica ter raças especializadas, a manutenção de gestações e o nascimento de animais do sexo masculino são um dos fatores de diminuição da produtividade e aumento dos custos de produção (²⁵).

De maneira geral, segundo Maillard et al. (²⁶), o objetivo da sexagem de espermatozóides é evitar o desperdício de animais. Trata-se principalmente na atividade leiteira, de evitar o nascimento de machos, que são sacrificados, representando custos econômicos e éticos. A cada ano, a eutanásia de 600 mil bezerros machos recém-nascidos custa o equivalente a 42 milhões de euros para os pecuaristas britânicos.

As vacas de maior potencial genético poderiam ser inseminadas com sêmen X, de maneira que pudessem produzir fêmeas para a renovação de plantel, enquanto as outras seriam inseminadas com sêmen não triado, mais barato, ou com sêmen Y de raça de corte (tudo dependerá do custo da palheta do sêmen sexada, da existência de bom mercado para a venda de machos cruzados, e etc.) (²⁶).

Figura 1 Integridade das membranas e função mitocondrial dos espermatozóides após serem corados 

Entretanto, según Weigel (²⁷), os países que utilizam doses de SS em seus rebanhos leiteiros essas estimativas não têm se concretizado devido a dois fatores, primeiro, a sexagem por CF, que é a técnica disponível comercialmente, atende apenas 0,5% da demanda diária de doses do mercado; é segundo, a taxa de prenhez a campo está em torno de 20-40% e 55-60% utilizando SS e SC, respectivamente.

Nos Estados Unidos, resultados de um teste de campo compararam as taxas de prenhez, conseguidas com espermatozóides sexados por CF, em rebanhos com baixa, média e alta eficiência reprodutiva. A taxa média de prenhez utilizando doses de SC foi de 58%, enquanto que utilizando sêmen com espermatozóides sexados nesses rebanhos as taxas de gestação foram 21%, 37% e 35%, respectivamente.

Por sua parte, na Finlândia, outro teste de campo comparou as taxas de prenhez conseguidas com espermatozóides sexados por CF (foram utilizadas 157 doses) e com SC (foram utilizadas 149 doses). A taxa média de prenhez utilizando doses de SC foi de 46%, enquanto que utilizando sêmen com espermatozóides sexados nesses rebanhos a taxa de gestação foi 21%, respectivamente. Assim nasceram mais bezerras após a IA com SC (33 bezerras) do que como SS (27 bezerras) (²⁸).

Considerando esses resultados, tornase evidente que os espermatozóides sexados por CF comprometem a taxa de prenhez, pelo menos atualmente, e estratégias para a aplicação comercial in vivo desse sêmen deveriam ter como foco caminhos para se obter benefício efetivo incluindo idade a primeira parição, frente ao custo de utilização (²⁷).

Requisitos da técnica de sexagem espermática

A tentativa de separar espermatozóides bovinos em frações de espermatozóides portadores de cromossomo sexual X e portadores do cromossomo sexual Y tem sido estudo de inúmeros cientistas de reprodução durante décadas (¹¹). Em busca de uma técnica eficiente de separação espermática, Batista et al. (²⁹) definiu os seguintes requisitos, que seja inofensiva às funções dos espermatozóides; ser eficiente, todas ou a maioria das células devem ser sexadas e com reduzido descarte e perda de espermatozóides durante o processo deve ser o menor possível; tenha acuidade próxima de 100%; seja reproduzível; ser simples e rápida, ou seja, permita avaliar alto número de amostras em pouco tempo; e que seja barata o suficiente para se difundir no mercado. Nos últimos anos, a evolução de algumas técnicas permitiu avanços significativos em algumas dessas condições, contudo, nenhum método conseguiu reunir todas as condições necessárias para sua utilização na prática.

Métodos de sexagem espermática baseados nas diferenças físicas

Técnicas usadas para detectar e/ou separar espermatozóides portadores do X e do Y, baseadas nas suas diferenças físicas (tabela 1).

Fonte: adaptado de Pegoraro LM, Hossepian VF. Selección del sexo em mamíferos. En: Biotecnología de la reproducción. Buenos Aires: Reprobiotec; 2001. p. 317-351.

Tabela 1 Técnica baseada em diferenças físicas 

Citometria de fluxo

Nos últimos anos, uma técnica desenvolvida pelo Laboratório de Livermore, denominada sexagem espermática por quantificação do DNA usando a CF, foi utilizada em maior frequência (⁴⁵). No final da década de 60, utilizou-se o CF com o intuito de acelerar a mensuração do DNA das células através de várias propostas, inclusive estudos com câncer. Na reprodução, utilizou-se esse método para avaliar alterações espermáticas frente a danos genéticos (⁵).

A CF tem custo elevado e de utilização restrita, pois gasta aproximadamente 30 minutos para sexar 1 dose de sêmen, não sendo até o momento viável sua utilização comercial. A utilização da CF para produção do SS bovino tem mostrado eficiência no resultado do sexo escolhido dos bezerros. No uso deste sêmen tem-se observado melhorias na programação das populações do rebanho, maior ganho direcionado para produção de leite e carne, além de facilidade na reposição de matrizes, assim como ganhos genéticos com redução no tempo na seleção de plantéis, desconsiderando a análise do custo econômico desse sêmen frente à finalidade para qual será utilizado (⁴⁶).

A capacidade de pré-selecionar o sexo da prole de animais importantes para o desenvolvimento da produção animal tem um impacto de grande importância para a economia. A principal diferença entre espermatozóides X e Y advém da quantidade de DNA dos mesmos.

Assim, através de estudos com chinchilas e ratos silvestres, a técnica de CF foi utilizada para medir informações nos cromossomos dos espermatozóides X e Y e determinar a razão sexual da prole nascida (⁴).

A utilização do método possibilitou a mensuração da quantidade individual de DNA de cada célula espermática pela fluorescência emitida por um corante (Hoechst 33342) que se liga ao DNA. Devido a uma diferença na quantidade de DNA, os espermatozóides X, após serem expostos a esse corante fluorescente, apresentam um brilho maior do que os espermatozóides Y. Após isso, os espermatozóides passam numa fila única que contém um separador com campo elétrico e são direcionados para um tubo de coleta a partir da diferença de cargas elétricas positivas ou negativas (13) (figura 2).

Fonte: Garner D. Sex-sorting mammalian sperm: Concept to application in animals. J Androl. 2001;22(4):519-26.

Figura 2 Esquema do processo da sexagem do espermatozóide pelo citômetro de fluxo 

A velocidade de separação dos espermatozóides X e Y é relativamente lenta - aproximadamente 3000 a 4000 células por minuto para cada sexo. Os espermatozóides são conduzidos através do aparelho em velocidades que se aproximam aos 90 km/h e a pressão de 50 psi ao deixar o "nozzle". Esta alta pressão e suas seqüelas comprometeriam a viabilidade e a motilidade do espermatozóide, deste modo, reduzindo a fertilidade (⁴⁷). A diminuição da pressão durante o processo de separação de 50 para próximo dos 40 psi aumentou a sobrevivência dos gametas após o "sorting" mantendo a precisão na separação dos espermatozóides carreadores do cromossomo X ou Y (⁴⁸,⁴⁹).

Através da separação dos espermatozóides pela CF, pôde se observar a efetividade do processo, alcançando uma pureza de 90% do sexo desejado (⁵,⁵⁰).

Segundo Oses (⁵¹), um resultado satisfatório na CF, para separação de duas populações de espermatozóides, depende de uma boa qualidade e concentração espermática, correlacionado com boas percentagens de motilidade espermática no ejaculado. Com o intuito da produção de SS criopreservado, as células espermáticas são expostas a processos físicos e químicos: diluição, incubação, coloração, passagem pelo CF, exposição a laser, pressão, centrifugação e criopreservação (⁵²), o que pode afetar a capacidade de sobrevivência e potencial de fertilização dos espermatozóides (¹¹).

Na utilização da sexagem pela técnica de CF com posterior criopreservação, o ejaculado a ser utilizado deve conter motilidade mínima de 60% e vigor 3 numa escala de 0 a 5, e morfologia > 75% de espermatozóides normais, além de avaliação morfométrica e da estrutura da cromatina dos espermatozóides (¹¹).

Estudos realizados por Zhang et al. (⁵³), mostraram que até o desenvolvimento embrionário do estágio de blastocisto não houve mudança quanto ao processo de separação por CF e coloração de DNA, entretanto as variações entre touros ao processo de sexagem foram observadas para taxa de clivagem e formação de blastocisto.

Segundo Garner (²³), apesar do uso do SS com baixa quantidade de espermatozóides e com diminuição da viabilidade espermática pós sexagem, a CF, tem sido empregado em diversos estudos, principalmente por a acuidade da sexagem pode chegar a atingir 95%. Entretanto, como toda nova técnica, o processo de sexa-gem por CF ainda tem limitações, devido à técnica utilizar um longo tempo para produzir uma quantidade suficiente de espermatozóides (54) o que encarece o processo, tornando-os com baixa longevidade de espermatozóides frescos e criopreservados (¹⁴).

Conclusões

O sêmen sexado tem demonstrado efetividade no seu uso desde que seja manipulado de forma organizada e correta, com pessoal capacitado e depositado no momento mais próximo da ovulação para garantir uma fertilização mais eficiente. Mostra-se que as técnicas de sexagem têm evoluído nos seus testes, tanto na acuidade na separação espermática como no processo de pureza. Assim, diversos aspectos relacionados à técnica de sexagem de células espermáticas viáveis ainda necessitam ser elucidados, como redução dos custos associada ao aumento da produção destas células com alto poder fecundante, a variação individual na fertilidade dos reprodutores doadores de sêmen para a sexagem e aspectos técnicos como a exposição à centrifugação, corantes e raios laser, de forma a diminuir esse avanço na capacitação e reação acrossômica do espermatozóide sexado.