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Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras - INVEMAR

versión impresa ISSN 0122-9761

Bol. Invest. Mar. Cost. vol.47 no.1 Santa Marta ene./jun. 2018

https://doi.org/10.25268/bimc.invemar.2018.47.1.743 

NOTA

Amplificación cruzada de microsatélites en dos especies de haemúlidos (Haemulon aurolineatum y Haemulon steindachneri)

Paula E. Pabón Quintero1  0000-0003-1800-9073

José Julián Tavera2  0000-0003-4517-9238

Ana María Millán-Márquez2  0000-0001-8975-1115

Arturo Acero P1  0000-0002-6637-9901

1 Instituto de Estudios en Ciencias del Mar, Cecimar, Universidad Nacional de Colombia sede Caribe, Calle 25 No. 2-55, Playa Salguero, Santa Marta, Colombia. Playa Salguero, Santa Marta, Colombia.pepabonq@unaledu.co, aacerop@unal.edu.co.

2 Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Biología. Calle 13 # 100-00. Cali, Colombia. jose.tavera@correounivalle.edu.co, millan.ana@correounivalle.edu.co


RESUMEN

Las investigaciones genético-poblacionales en peces marinos han permitido estudiar los patrones de dispersión y la conectividad entre los hábitats. Dentro de esos estudios una herramienta importante son los marcadores moleculares tipo microsatélite. La amplificación cruzada de microsatélites es un método que consiste en usar cebadores diseñados para una especie en otra especie filogenéticamente cercana. Debido a la necesidad de realizar estudios de genética de poblaciones en especies de importancia pesquera se evaluaron y diseñaron cebadores para las especies Haemulon aurolineatum y Haemulon steindachneri. Se recolectaron muestras producto de la pesca artesanal en Barú-Colombia. Se estandarizó la amplificación de 12 microsatélites de los cuales 10 loci para H. aurolineatum y 9 loci para H. steindachneri fueron polimórficos. Se considera que los cebadores implementados en este estudio son útiles para futuros estudios de flujo génico en estas especies.

PALABRAS CLAVE: Haemulidae; Roncos; Cebadores; Polimorfismo; Genética de poblaciones

ABSTRACT

Genetic-population studies in marine fish have allowed to study patterns of dispersal and connectivity between habitats. One important tool in population genetics is the use of microsatellite molecular markers. Cross-amplification of microsatellite is a method that consists in using primers designed for one species in a different one but phylogenetically related. Because of the importance of genetic studies of populations in artisanal fisheries species, primers were evaluated and designed for the species Haemulon aurolineatum and Haemulon steindachneri. Samples were collected from the artisanal fisheries in Baru-Colombia. Amplification was standardized for 12 microsatellites which ten were polymorphic for H. aurolineatum and nine for H. steindachneri. It is considered that the primers implemented in this study are useful for future studies of gene flow in these species.

KEYWORDS: Haemulidae; Grunts; Primers; Polymorphism; Population genetics

Los estudios de variación genética entre poblaciones de peces marinos han permitido dilucidar aspectos de su dispersión y de la conectividad entre los hábitats en los que se distribuyen. Los marcadores moleculares son una herramienta de gran importancia para identificar dicha variabilidad genética, entre ellos los microsatélites, secuencias de repeticiones en tándem de ADN nuclear, han sido ampliamente utilizados. por su alto polimorfismo, herencia mendeliana y codominancia (Selkoe y Toonen, 2006). Para el uso de microsatélites es necesario realizar su aislamiento, lo cual es un proceso largo, dispendioso y costoso, por lo que para diversas investigaciones es preferible probar cebadores diseñados para especies filogenéticamente cercanas, teniendo en cuenta que las regiones flanqueantes a los microsatélites pueden ser altamente conservadas entre especies pertenecientes a un mismo género o familia (Rico et al, 1996; Barbará et al, 2007). Este proceso se denomina amplificación cruzada, pero no siempre resulta exitoso, pues depende de factores como el nivel de polimorfismo, la unidad de repetición de los cebadores, y la cercanía filogenética de las especies en que es implementado. En algunas ocasiones, microsatélites específicos al ser probados en otra especie del mismo género o familia no presentan el mismo nivel de polimorfismo, son monomórficos o presentan problemas de amplificación (Landínez-García et al, 2009; Muñoz et al, 2011; Fresneda-Rodríguez et al., 2013; Almanza et al, 2016).

El género Haemulon, perteneciente a la familia Haemulidae, es de gran importancia ecológica y económica en los arrecifes del Nuevo Mundo (Rocha et al., 2008). Ha sido empleado como modelo para analizar hipótesis evolutivas, de especiación y generación de diversidad en el Caribe (Rocha et al., 2008; Tavera et al., 2012, 2018). Sus especies presentan una amplia distribución geográfica y habitan ambientes contrastantes (Tavera et al., 2012). Entre los haemúlidos, dos especies representativas son Haemulon aurolineatum y H. steindachneri, las cuales son un objetivo importante en la pesca artesanal en el Caribe sur.

Hasta el momento se han diseñado 11 pares de cebadores (Williams et al., 2004), los cuales se estandarizaron y fueron utilizados como una herramienta en el análisis genético poblacional de H. flavolineatum (Purcell et al, 2006). El objetivo de este estudio fue diseñar cebadores para ocho secuencias de microsatélites de H. aurolineatum previamente registradas en GenBank por Turner et al. (2005) y estandarizar las condiciones de amplificación de los cebadores diseñados por Williams et al. (2004) en las especies H. aurolineatum y H. steindachneri. La implementación deInstituto de Investigaciones Marinas y Costeras los microsatélites registrados en el presente estudio permite responder, con gran resolución, preguntas relacionadas con la diversidad y estructura genética de las dos especies, utilizando una estrategia más rápida y económica que la de aislar los microsatélites de forma especíica.

En abril de 2016 se recolectaron individuos de H. aurolineatum (n=30) y H. steindachneri (n=30) en las faenas de pesca realizadas por los pescadores artesanales, en Barú-Colombia (10°12'37''N, 75°34'45''W). La extracción y puriicación del ADN se realizó mediante el protocolo de extracción de Salting-out propuesto por Alhjanabi y Martínez (1997). La calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se cuantificó por medio del Nanodrop 2000 (Termo Scientific, EE. UU.).

El diseño de los cebadores para las secuencias Hau034, Hau075, Hau183, Hau220, Hau315, Hau417, Hau462 y Hau474 se realizó con en el programa Geneious 9.0 (Drummond et al., 2010) (Tabla 1). Además de los oligonucleótidos anteriores se seleccionaron seis pares de cebadores diseñados por Williams et al. (2004) para H. flavolineatum, teniendo en cuenta el nivel de polimorismo y la composición de la unidad de repetición. A los cebadores forward de cada microsatélite durante la PCR se hibridizó la secuencia universal M13 con fluorocromos (PET, NED, VIC y FAM) en el extremo 5' para la genotipificación (Schuelke, 2000).

Tabla 1 Características de los microsatélites estandarizados. Rep: Motivo de repetición %G-C: Porcentaje de Guanina-Citosina. TA: Temperatura alineamiento en °C. Los superíndices al lado de cada locus indican la amplificación cruzada específica. A Haemulon aurolineatum; B Haemulon steindachneri. 

La estandarización de las condiciones adecuadas de amplificación por PCR (Polymerase Chain Reaction) de los microsatélites se realizó usando un termociclador Proflex (Life Tecnologies). El programa de PCR estuvo basado en las condiciones requeridas para la hibridación del cebador universal M13; un ciclo a 94°C por 2 min; 30 ciclos de 94°C por 15 s, TA:48- 60°C por 15 s, 72°C por 45 s, 94°C por 15 s; 8 ciclos de 53°C por 5 s, 72°C por 45 s; un ciclo de 72°C por 15 min y un ciclo a 15°C por 15 min. Las concentraciones finales de cada reactivo fueron 1X Buffer BD, 0.3mM de dNTPs, 1.5mM de MgCl2, 0.25 μM de Cebador M13 (NED, VIC, PET o FAM), 0.25/μM de cebador-reverse, 0.06 de cebador-forward, 1U de Taq polimerasa. Los microsatélites Hf AAC37 y HfAAC3 requirieron una mezcla de 1X de Buffer BD, 0.3mM de dNTPs, 2.5mM de MgCl2, 0.16 μM de Cebador M13 + (NED, VIC, PET o FAM), 0.16/μM de Cebador-R, 0.04 de cebador-F, 0.5U/μl de Taq polimerasa. El volumen final de la reacción fue 10 μl. La verificación de las amplificaciones se realizó por medio de electroforesis en gel de agarosa a 2.5%. Los productos de PCR obtenidos de dichas pruebas fueron analizados por medio de electroforesis capilar en el secuenciador ABI3130 y la genotipificación se realizó con el programa Geneious 9.0 (Drummond et al., 2010).

Para detectar posibles errores de genotipificación (presencia de alelos nulos) se usó el programa Micro Checker (Van Oosterhout et al, 2004) con 1000 simulaciones Bootstrap con un nivel de confianza de 95%. Se estimó la desviación del equilibrio Hardy Weinberg (EHW) por medio de la prueba exacta de Raymond y Rousset (1995a) implementado en el programa GENEPOP v4.2 con 1000 interacciones de Monte Carlo MCMC. El desequilibrio de ligamiento se estimó con el test de probabilidad de Fisher (Raymond y Rousset, 1995b) en el programa GENEPOP v4.2 (Rousset, 2008) con 1000 interacciones MCMC y empleando la corrección de Bonferroni.

De 14 loci analizados, 10 amplificaron en ambas especies. No fue posible amplificar los loci HfAAC41-A, Hau034 y Hau075. Se presentó un alto grado de polimorfismo, en promedio 15 alelos por locus en Haemulon aurolineatum y 21 alelos por locus en Haemulon steindachneri (Fig. 1). El locus HfAAC10-C fue monomórfico en H. steindachneri. En H. aurolineatum no se hallaron loci desviados significativamente del equilibrio Hardy Weinberg, ni se evidenció presencia de alelos nulos, o tartamudeo en la genotipificación (Figura 1b). En H. steindachneri se encontró un desvío significativo del EHW por déficit de heterocigotos en los loci Hau220, Hau474, y HfAAC54-A, este último presentó alelos nulos (Fig. 1b). En H. aurolineatum se detectó desequilibrio de ligamiento entre los pares de loci Hau315 - HAAC54-C (valor de p =0.000); Hau220 - HAAC3-B (valor de p =0.000); y HfAAC10-C -Hau474 (valor dep =0.000), mientras que en H. steindachneri no se halló desequilibrio de ligamiento (valor de p > 0.05).

Figura 1 Resultados de amplificación cruzada en Haemulon aurolineatum y Haemulon steindachneri. a) Número de alelos por locus: Entre paréntesis en cada barra ámbito de tamaño de los alelos en pares de bases (pb). b) Heterocigosidad: Dentro de cada barra valor de p. *Denota desvío significativo del Equilibrio Hardy Weinberg después de la corrección de Bonferroni. 

Este estudio es el primero en probar la amplificación cruzada en la especie Haemulon steindachneri y aporta información para el uso de microsatélites en H. aurolineatum. Los microsatélites propuestos por Williams et al. (2004) fueron en su mayoría altamente polimórficos. Sin embargo, debido a la complejidad en el tipo de repetición del microsatélite se pueden presentar problemas de alelos nulos, como en HfAAC54 en H. steindachneri, aunque ese loci no presentó alelos nulos ni en H. aurolineatum ni en H. flavolineatum (Williams et al., 2004).

Por lo anterior se considera que los microsatélites aislados por Williams et al. (2004) y por Turner et al. (2005) pueden ser utilizados de manera exitosa en estudios de genética de poblaciones de Haemulon aurolineatum y Haemulon steindachneri. Los microsatélites, por su alto grado de polimorfismo, son una herramienta de alta resolución para resolver preguntas de variabilidad genética en éstas especies de importancia pesquera en el Caribe colombiano.

AGRADECIMIENTOS

El presente estudio se realizó con la financiación de la Fundación para Promoción de la Investigación y la Tecnología-FPIT del Banco de la República de Colombia- Proyecto No. 3854, de Colciencias- Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores- Convocatoria 645 de 2014, y del Instituto de Estudios en Ciencias del Mar- Cecimar de la Universidad Nacional de Colombia- Sede Caribe (UNC). Se hace un agradecimiento especial al Laboratorio de Ictiología Marina de la Universidad del Valle y sus integrantes, por su apoyo en la estancia de investigación. Al investigador Juan David González por su apoyo en la toma de muestras y a los profesores de la UNC Néstor Campos, Sven Zea y Edna Márquez por sus sugerencias en la elaboración del proyecto. Esta publicación forma parte del trabajo de grado de la primera autora para optar por el título de Maestría en Ciencias- Línea Biología Marina de la Universidad Nacional de Colombia sede Caribe.

REFERENCIAS

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Recibido: 24 de Abril de 2017; Aprobado: 02 de Abril de 2018

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