INTRODUCCIÓN

Las ballenas jorobadas tienen una distribución cosmopolita, con poblaciones distribuidas en las tres cuencas oceánicas: Atlántico Norte, Pacífico Norte y el hemisferio sur. Para el hemisferio sur, la Comisión Ballenera Internacional (^{International Whaling Comission, IWC}) reconoce seis sub poblaciones o stocks (IWC, 1998). La identidad de cada una de estas sub poblaciones está definida de acuerdo con su distribución en zonas de alimentación en altas latitudes y sus áreas de cría en zonas del trópico. Las conexiones migratorias existentes entre estas zonas de cría y alimentación han sido sugeridas según evidencia obtenida por estudios comparativos basados en foto identificación (v. g., ^{Acevedo et al. 2017}, ^{Flórez-González et al. 1998}, ^{Garrigue et al. 2002}, ^{Stevick et al. 2004}), análisis de ADN mitocondrial (v. g., ^{Baker et al. 1998}, ^{Olavarría et al. 2007}, ^{Félix et al. 2012}) y, recientemente, por comparación de genotipos a nivel individual (^{Steel et al. 2017}).

Se describió una conexión migratoria entre lugares de reproducción y cría en la costa Pacífica de Colombia y las zonas de alimentación alrededor de la Península Antártica (sub población o stock G) a partir de análisis genéticos (^{Caballero et al. 2000}, 2001; ^{Olavarría et al. 2007}). Cuando se compara la sub población G con otras sub poblaciones del Hemisferio Sur, se encuentra que la población que visita y se reproduce anualmente en el Pacífico Colombiano presenta una diferenciación genética significativa con respecto a las demás de esta región (Olavarría et al. 2007). Adicionalmente se ha reportado una diversidad haplotípica (h) y nucleotídica (π) relativamente altas para esta zona de reproducción (Caballero et al. 2001, Olavarría et al. 2007). La zona de reproducción del Pacífico Colombiano puede tener una importancia particular ya que se ha sugerido como un posible corredor para flujo genético en el pasado y actualmente, permitiendo el intercambio genético entre los grupos del Pacífico Norte y el Hemisferio Sur. Esto ha sido sugerido con base en la identificación de haplotipos de la región control del ADN mitocondrial que se encuentran compartidos entre la zona de reproducción del Pacífico Colombiano y las zonas de alimentación del Pacífico Norte (Caballero et al. 2001, ^{Baker y Medrano-González 2002})

Otras áreas del Pacífico Sudeste han sido reconocidas también como zonas de reproducción de la sub población G. Estas incluyen la costa de Ecuador y las Islas Galápagos en el sur y la frontera entre Panamá y Colombia en el norte (^{Félix et al. 2011}, Félix et al. 2012). Parece existir también sub estructuración o estratificación poblacional entre las localidades que constituyen esta zona de reproducción, ya que algunos haplotipos encontrados en muestras de Ecuador solo han sido previamente descritos en el Estrecho de Magallanes y no alrededor de la Península Antártica (Félix et al. 2012). Estudios moleculares en estas zonas adicionales podrán ayudar a clarificar si esta posible sub estructuración existe entre localidades de esta zona de reproducción (Félix et al. 2012), ya que estudios de foto identificación (^{Acevedo et al., 2017}) y marcaje satelital también la sugieren (^{Guzmán and Félix, 2017}).

En este trabajo presentamos resultados de comparaciones a nivel individual a partir de genotipos realizados a partir de muestras colectadas en diferentes localidades de alimentación y reproducción del Pacífico sudeste, incluyendo la costa de Ecuador, el Pacífico Colombiano y la Península Antártica.

ZONA DE ESTUDIO

Se colectaron muestras de piel de ballenas jorobadas durante la temporada de reproducción en Salinas, Ecuador, entre 2006 y 2010 (N=55), cerca de Nuquí, Golfo de Tribugá, Departamento del Choco, en la zona norte del Pacífico Colombiano entre 2015 y 2016 (N=43), en Bahía Málaga y la Isla Gorgona, Departamento del Valle del Cauca en el sur del Pacífico Colombiano (N=2), y en el Estrecho de Gerlache, en la Península Antártica, como parte de la primera expedición Colombiana a la Antártica en 2014 (N=14) (Tabla 1 y Figura 1).

Tabla 1 Resumen de las muestras y de los perfiles de ADN de las zonas de reproducción y las zonas de alimentación de la subpoblación o stock G, que incluyen el sexo de las muestras. QC hace referencia a las muestras que cumplieron con los estándares de control de calidad y fueron incluidas en los análisis finales. 

Figura 1 Localidades de muestreo en las zonas de alimentación y de reproducción para la subpoblación G: A. Nuquí, Departamento del Chocó, Colombia (Norte de Colombia), B. Bahía Málaga y C. Isla Gorgona Departamento del Valle del Cauca, Colombia, D. Salinas, Ecuador, y E. Estrecho de Gerlache, Península Antártica. En azul, ruta migratoria. 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron biopsias de piel utilizando el rifle modificado Paxarms (^{Krützen et al. 2002}) y se colectó piel desprendida, flotando en el agua, utilizando una malla para atraparla (ver ^{Félix et al., 2012}). Las muestras fueron preservadas en etanol al 95 % y mantenidas 4 ºC hasta su análisis en el laboratorio. Se extrajo ADN total utilizando proteinasa K para digerir el tejido, seguido por un protocolo clásico de fenol-cloroformo (^{Sambrook et al. 1989}). Se genotipificaron 15 loci microsatélites siguiendo los protocolos de ^{Constantine et al. (2012)} y de ^{Steel et al. (2017)} utilizando los primers o cebadores previamente publicados: Ev1, Ev14, Ev21, Ev37, Ev94, Ev96, Ev104 (^{Valsecchi y Amos 1996}) GATA417, GATA28 (^{Palsboll et al. 1997}) rw31, rw 4-10, rw48 (^{Waldick et al. 1999}) and GT211, GT575, GT23 (^{Bérubé et al. 2000}). La identificación individual fue confirmada con sexaje molecular y secuenciación de la región control del ADN mitocondrial (mtDNA) siguiendo los protocolos de ^{Olavarría et al. (2007)}. Cada loci microsatélite fue amplificado por PCR de manera independiente y luego todos los productos de amplificación fueron combinados (multiplex) para su montaje en el secuenciador ABI 3730 xl DNA (Applied Biosystems), utilizando el marcador de peso 500LIZ™. La identificación de los alelos se realizó utilizando el programa ABI PRISM GeneMapper 4.0 (Life Technologies). Las muestras amplificadas para 10 loci o menos se consideraron de baja calidad y se eliminaron de la base de datos. Los genotipos de alta calidad fueron resueltos utilizando el programa CERVUS (^{Marshall et al. 1998}) requiriendo una coincidencia exacta de al menos ocho loci, soportado por la información del sexo y el haplotipo mitocondrial. Los valores de la probabilidad (PI) de identidad se encontraron en el rango entre 2.1 x10^-7 y 5.7 x10^-12 para el criterio de mínimo de ocho loci coincidentes. Se realizaron comparaciones de los genotipos generados utilizando dos “registros” de ADN (definiendo como “registros” una base de datos electrónica de perfiles de ADN) para individuos de ballenas jorobadas previamente identificados para la zona de reproducción de la costa Pacífica de Colombia (N = 111; 1991-1999) y la zona de alimentación alrededor de la Península Antártica (N = 70; 1989-1999) mantenidas por el South Pacific Whale Research Consortium (Steel et al. 2017) y, por un acuerdo de colaboración, también se compararon con un archivo de 508 muestras individuales colectadas en la Península Antártica en años recientes (2010-2016; ^{Pallin 2018}). Adicionalmente, y con el fin de confirmar los patrones de estructura poblacional previamente descritos para la subpoblación del Pacífico sudeste, dicha estructura poblacional fue evaluada con el programa STRUCTURE^® v. 2.3 (^{Pritchard, et al. 2000}) que asigna individuos a grupos utilizando un modelo Bayesiano que minimiza el desequilibrio de ligamiento y las desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg. Se corrió el modelo de panmixia con correlación de frecuencias alélicas para estimar el número más probable de grupos genéticos (K) en la muestra (length burn-in period: 10 000; MCMC: 100 000). Este programa evalúa diferentes valores de K utilizando diversos modelos de ancestría. Se corrieron diez réplicas en STRUCTURE y los resultados fueron visualizados en el programa Structure Harvester (^{Earl and vonHoldt, 2012}). En este análisis se incluyeron 254 muestras de la Península Antártica, de Colombia y de Ecuador y para realizar comparaciones se incluyó un grupo de muestras de Brasil (n=50) (Cypriano-Sousa et al., 2016) y del Pacífico Sur (Nueva Caledonia, n = 50; Polinesia Francesa y Samoa Americana, n = 100; Tonga, n= 50) (Steel et al. 2017)

RESULTADOS

Ciento catorce muestras fueron obtenidas a partir de biopsias remotas o de piel desprendida en tres localidades del Pacífico sudeste y de la Península Antártica. Se buscó obtener perfiles genéticos de estas muestras para realizar comparaciones con los genotipos de los registros de ADN del South Pacific Whale Research Consortium, que incluyen 16 loci microsatélite, haplotipos de ADN mitocondrial y sexo (^{Steel et al. 2017}). Para todas las muestras se logró determinar el sexo y el haplotipo mitocondrial, información utilizada para poder aclarar recapturas potenciales (Tabla 1). De los 15 microsatélites utilizados, uno (EV21) no amplificó apropiadamente y no fue incluido en los análisis. Cuatro muestras, todas de Ecuador, no amplificaron para lograr el mínimo de calidad requerida de 10 loci para análisis y no fueron incluidas en la base de datos.

Las comparaciones realizadas con el resto de los 110 genotipos revelaron nueve coincidencias (matches) dentro de las localidades, tres en Ecuador, dos en Colombia y cuatro en la Península Antártica. (Table 1). Todas estas recapturas se dieron dentro de una misma temporada de campo con la excepción de un individuo, que fue muestreado en Ecuador en 2009 y nuevamente en 2010. Luego de eliminar estas recapturas dentro de cada localidad, los 101 genotipos restantes fueron comparados con individuos muestreados en 181 Colombia (N = 111) y la Península Antártica (N = 70) 20 años antes, y con un catálogo genético contemporáneo de la Península Antártica (Pallin et al. 2017, N = 510; 2010 - 2016) (Tabla 2). Considerando el sobrelapamiento especial y temporal entre 10 individuos muestreados en la Península Antártica incluidos en este estudio y en el catálogo de Pallin et al. (2018), estas dos bases de datos fueron comparadas primero y luego se unieron para realizar comparaciones posteriores con otras colectas temporales y espaciales. Se identificaron dos recapturas; un individuo muestreado en 2013 y nuevamente en 2015 y una muestra obtenida en 2015 y nuevamente en 2016. Luego de quitar dichas recapturas, un total de 518 individuos se definieron en la colección contemporánea de genotipos de la Península Antártica. Al comparar estos genotipos con los perfiles de los 70 individuos colectados 20 años antes, se encontraron dos recapturas en la misma región con un espacio temporal de 18 años, una hembra muestreada en 1997 y nuevamente en el 2015 (Tabla 3). Por el contrario, no se encontró ninguna recaptura al comparar las bases de datos de genotipos obtenidos en años recientes en las localidades de la zona de reproducción (Colombia 2015-2017 y Ecuador 2006-2010) ni con el catálogo de genotipos de años anteriores (Colombia 1991-1999) (Tabla 3). Una comparación de genotipos entre las localidades de la zona de reproducción y las de alimentación reveló cinco recapturas (Tabla 3), una previamente reportada por et al. (2017), tres entre la base de datos de Colombia 1991-1999 y la base de datos de la Península Antártica 2010-2016 y una entre Ecuador y la Península Antártica 2010-2016 (Tabla 3).

Tabla 2 Bases de datos utilizadas en las comparaciones realizadas. 

Tabla 3 Recapturas individuales a partir de genotipos dentro y entre muestreos en la región. El número sobre la diagonal representa las recapturas entre años, dentro de la misma localidad. El número debajo de la diagonal representa recapturas entre las zonas de alimentación y reproducción. * representa una recaptura previamente descrita. 

El análisis de estructura genética confirmó que todas las muestras analizadas pertenecían a una misma población (K=3) (Figura 2), confirmando la conectividad genética existente entre las zonas de alimentación alrededor de la Península Antártica y las zonas de reproducción, y mostrando diferenciación genética al realizar comparaciones con grupos de otras áreas del Hemisferio Sur (Pacífico Sur y Brasil), soportando lo previamente establecido por otros autores (Cypriano-Sousa et al. 2016; ^{Steel et al. 2017}).

Figure 2 Diagrama de barras del programa Structure mostrando las probabilidades de asignación (K=3) para cada individuo M. novaeangliae de diversas localidades genotipificado AP = Península Antártica, CO = Colombia, EC = Ecuador, SP = Pacífico Sur y BR= Brasil. 

DISCUSION

En este trabajo presentamos resultados de genotipificación individual y recapturas en muestras de ballenas jorobadas de diversas localidades de las zonas de reproducción del Pacífico Este y sus zonas de alimentación alrededor de la Península Antártica. Este es el primer trabajo presentando resultados sobre el uso de marcadores moleculares nucleares (microsatélites) para esta subpoblación o stock, ya que los trabajos anteriores sobre genética poblacional de estos grupos se habían enfocado en análisis de secuencias de la región control del ADN mitocondrial (Caballero et al. 2002, ^{Olavarría et al. 2007}). Estos resultados confirman conocimiento previo sobre la conectividad genética existente entre los grupos que se alimentan en la zona del estrecho de Gerlache en la Península Antártica y sus zonas de reproducción en la costa de Ecuador y el Pacífico Colombiano.

En este estudio se presenta información sobre recapturas genéticas individuales encontradas entre estas dos regiones. La mayoría de las recapturas encontradas en nuestros análisis fueron recapturas dentro de cada una las localidades de muestreo, pero hubo algunas interesantes para la misma localidad en años diferentes, tanto en zonas de alimentación como en zonas de reproducción, apoyando los datos presentados por ^{Steel et al., (2017)}.

Adicionalmente, el encontrar recapturas entre zonas de reproducción y alimentación para muestras tomadas con una diferencia temporal de 20 años proporciona información inicial sobre la longevidad de estos animales y confirma la filopatría y la fuerte conexión migratoria existente entre estas áreas para el stock G. Así mismo, el no haber encontrado recapturas para muestras colectadas en diferentes localidades dentro de la zona de reproducción (Ecuador y el norte del Pacífico Colombiano vs sur del Pacífico Colombiano), parece soportar la hipótesis sobre estratificación poblacional dentro de las áreas de esta zona de reproducción (^{Félix et al., 2012}, Guzmán and Félix, 2016). Estudios futuros deberán incluir muestras adicionales de estas áreas, así como muestras de animales que se alimentan en el Estrecho de Magallanes y que se reproducen potencialmente en Panamá y Costa Rica (^{Acevedo et al. 2017}).

Análisis adicionales permitirán realizar la identificación de recapturas potenciales cuando estos datos sean comparados con registros de ADN para el Pacífico Sur y subpoblaciones adyacentes (e.g., Brasil, ^{Cypriano-Souza et al. 2016}) y ayudarán a informar sobre potencial migración entre Hemisferios cuando se puedan hacer comparaciones con muestras obtenidas de grupos del Pacífico Norte.