ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Protocolo para la formación de microtubérculos de ñame (Dioscorea alata L.) en sistema de inmersión temporal

A protocol for yam (Dioscorea alata L.) microtuber formation in temporary immersion system

Manuel Cabrera Jova¹ , Rafael Gómez Kosky², Aymé Rayas Cabrera¹, Manuel DeFeria², Jorge López Torres ², Milagros Basail Pérez ¹, Víctor Medero Vega¹

Recibido: junio 10 de 2009 Aprobado: noviembre 10 de 2009

Resumen

Con el propósito de desarrollar un protocolo para la formación de microtubérculos en el clon de ñame Pacala Duclos (Dioscorea alata L.) en sistema de inmersión temporal, que pudiera ser usado como alternativa para la propagación de esta especie, se definieron como objetivos de trabajo determinar el efecto del tiempo y la frecuencia de inmersión, así como la influencia del volumen de medio de cultivo por planta cultivada in vitro. Con el empleo de 15 min de inmersión y una frecuencia de inmersión cada 6 horas, se alcanzaron los mejores resultados en cuanto al número de microtubérculos formados por planta. Con este tiempo y frecuencia de inmersión los microtubérculos presentaron la mayor masa fresca y seca, así como el mayor diámetro. Además, a las 18 semanas de cultivo se obtuvo el mayor número total de microtubérculos por sistema y el mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de propagación. En cuanto al volumen de medio de cultivo por planta, con 60 ml de medio de cultivo por planta in vitro se alcanzó el mayor número de microtubérculos aprovechables, los cuales presentaron el contenido más alto de materia seca. Los microtubérculos obtenidos en este tipo de sistema de inmersión temporal presentaron una masa fresca superior a 2,40 gMF, lo cual podría permitir su uso como material de plantación directo a campo.

Palabras clave: microtubérculos, tiempo y frecuencia de inmersión, volumen de medio de cultivo.

Abreviaturas: sistema de inmersión temporal (SIT), gramos de masa fresca (gMF), recipiente de inmersión temporal automatizado (RITA).

Abstract

The following working objectives were defined for developing a protocol for ´Pacala Duclos´ yam clone (Dioscorea alata L.) microtuber formation in temporary immersion systems (TIS): time effect, immersion frequency and culture medium volume influence per in vitro cultivated plant. The results led to defining that the highest performance regarding microtuber number formed per plant was achieved with a 15-minute immersion time and six-hourly immersion frequency; the microtubers presented the greatest dry and fresh weight and largest diameter at such immersion time and frequency. Furthermore, the highest total number of microtubers per system and the largest number of microtubers usable for planting (vegetal propagation) material were obtained after 18 weeks’ culture. Regarding culture medium volume per plant, the greatest amount of usable microtubers was achieved with 60 ml per in vitro plant, microtubers presenting the highest dry matter content. As microtubers obtained in this type of TIS had fresh weights higher than 2.40 gFW they could be used as direct planting material in field conditions.

Key words: microtuber, immersion and frequency time, culture medium volume

Abbreviations: temporary immersion system (TIS), grams of fresh weight (gFW), automated container for temporary immersion (RITA).

Introducción

Los incrementos en la producción de raíces y tubérculos para el año 2020 se originarán por la demanda de papa y ñame para alimento humano, además de yuca y boniato como alimento animal y para la producción de almidón (Scott et al., 2006).

Las tecnologías de producción de microtubérculos en el cultivo del ñame tienen un gran potencial como alternativa para la propagación en esta especie (Ovono et al., 2007), debido a que se pueden producir sin tener en cuenta la época del año y a que, a diferencia de las plantas in vitro, pueden ser almacenados por un periodo más prolongado de tiempo sin perder su potencial de brotación (Jasik y Mantell, 2000; Mbanaso et al., 2007).

En la especie Dioscorea alata L. los microtubérculos desarrollados en medios de cultivo en estado semisólido han presentado limitaciones tanto para la producción de minitubérculos en la fase de aclimatización, como para la plantación directa en condiciones de campo (Balogun et al., 2006; Chen et al., 2007).

El empleo combinado de medios de cultivo en estado líquido y sistemas de cultivo semiautomatizados han demostrado ser eficientes en la propagación in vitro de muchas especies de plantas (Escalona, 2006; Mehrotra et al., 2007).

Los Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) basados en el contacto intermitente del medio de cultivo con los explantes, y en la renovación de la atmósfera interna del frasco de cultivo (Berthouly y Etienne, 2005), han sido utilizados por Jiménez (2005) para producir microtubérculos de papa a gran escala.

Salazar y Hoyos (2007), utilizaron los recipientes de inmersión temporal automatizados (RITA) de 1,0 L de capacidad para la multiplicación y tuberización in vitro de ñame clon “Pico de Botella”, y aunque alcanzaron mayores tasas de multiplicación y tuberización in vitro comparadas con el sistema de cultivo convencional en medio de cultivo semisólido, sólo lograron obtener 0,85 microtubérculos por planta y estos presentaron una masa fresca promedio de 0,24 gMF, probablemente debido a la capacidad de los frascos de cultivo y a la falta de manejo de los parámetros del sistema de cultivo que regulan las condiciones del mismo.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del tiempo y la frecuencia de inmersión en la formación de los microtubérculos de ñame en el Sistema de inmersión temporal, así como determinar la influencia del volumen de medio de cultivo por planta cultivada in vitro para establecer un protocolo en este tipo de sistema de cultivo.

Materiales y métodos

La investigación se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos de plantas del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (Inivit), ubicado en Santo Domingo, Villa Clara, Cuba, durante el periodo comprendido entre septiembre del 2006 y diciembre del 2008.

Material vegetal

Se emplearon como explantes segmentos nodales de ñame clon Pacala Duclos con una yema axilar en tercer subcultivo, previamente multiplicados en un medio de cultivo compuesto por las sales inorgánicas y vitaminas propuestas por Murashige y Skoog (1962) (MS), suplementadas con cisteína (20 mg.L^-1); 30,0 g.L^-1 de sacarosa y 5,0 g.L^-1 de Agar-E (Biocen).

Sistema de Inmersión Temporal (SIT)

Este tipo de sistema de cultivo estuvo compuesto por dos frascos de cultivo tipo Clearboys (Compañía Nalgene, EE.UU.) de 10,0 L de capacidad, uno para el crecimiento de los segmentos nodales y el otro como reservorio de medio de cultivo. Estos frascos de cultivo se conectaron entre sí por una manguera de silicona de seis milímetros de diámetro mediante conectores que atravesaron la tapa. En la parte interna se colocó una manguera, la cual descendió hasta el fondo en ambos recipientes. El medio de cultivo circuló de un frasco de cultivo a otro en dependencia de la apertura o cierre de dos electroválvulas de tres vías, las cuales estaban conectadas a un temporizador programable para determinar el tiempo y la frecuencia de la inmersión. A la entrada de los frascos de cultivo se colocaron filtros hidrofóbicos (0,22 µm, Midisart 2000, de la compañía Sartorius) para garantizar la esterilidad del aire. La presión del aire de 1,0 kg.cm^-2 proveniente de un compresor, fue regulada por un manómetro.

Para la formación de los microtubérculos fueron establecidas dos fases de cultivo:

En la fase de crecimiento de las plantas, a partir de los segmentos nodales, se utilizó el medio de cultivo basal MS con 30,0 g.L^-1 de sacarosa y un régimen de fotoperiodo de 16 horas luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 42,0-48,0 µmol.m^-2.s^-1 y a una temperatura de 25±2,0 °C. Los segmentos nodales para el crecimiento de las plantas fueron cultivados en el SIT, en cada uno de ellos fueron colocados 100 segmentos nodales y un volumen de 30 mL de medio de cultivo por segmento nodal, y se utilizó un tiempo de inmersión de 10 min y una frecuencia de inmersión cada 3 horas (8 inmersiones por día) según resultados previos no mostrados en este trabajo. Esta fase tuvo un periodo de duración de 6 semanas de cultivo.

En la fase de formación de los microtubérculos se utilizó el medio de cultivo basal MS con 100 g.L^-1 de sacarosa, y se cultivó en la oscuridad a temperatura de 23±2,0 °C. Cada SIT tenía 100 plantas in vitro y se colocó un volumen de 30 mL de medio de cultivo por planta in vitro, para un volumen total de 3000 mL de medio de cultivo (excepto en el experimento donde se realizó ese estudio). Esta fase se desarrolló durante un periodo de 18 semanas de cultivo.

Efecto del tiempo de inmersión en la formación de los microtubérculos

Con el objetivo de evaluar el efecto del tiempo de inmersión en la fase de formación de los microtubérculos de ñame se evaluaron cuatro tiempos de inmersión: 10,0, 15,0, 20,0 y 25,0 min cada 3 horas (8 inmersiones por día).

Efecto de la frecuencia de inmersión en la formación de los microtubérculos

Con el objetivo de evaluar el efecto de la frecuencia de inmersión en la fase de formación de los microtubérculos de ñame se estudiaron 4 frecuencias de inmersión, cada 3,0; 6,0; 12,0 y 24 horas por día, con el mejor tiempo de inmersión obtenido como resultado en las variables del experimento anterior.

Influencia del volumen del medio de cultivo por planta cultivada in vitro en la formación de los microtubérculos

Este experimento se desarrolló con el objetivo de determinar el efecto del volumen de medio de cultivo en la fase de formación de los microtubérculos. Para el desarrollo del experimento se evaluó el efecto de cuatro volúmenes 15, 30, 60 y 90 mL de medio de cultivo por planta cultivada in vitro.

Se utilizó el mejor tiempo y frecuencia de inmersión obtenidos como resultado para las variables evaluadas en los experimentos anteriores.

Al finalizar la fase de formación de los microtubérculos (18 semanas de cultivo), se seleccionaron al azar 50 plantas por tratamiento, y al momento de la cosecha se contó el número de microtubérculos formados por planta, se determinó la masa fresca (gMF) y la masa seca (gMS) de los microtubérculos en una balanza analítica (Sartorius); antes de determinar la masa seca, los microtubérculos fueron colocados en una estufa (SUTJESKA) a 70 °C durante 48 horas, también se midió el diámetro de los microtubérculos (mm) con un pie de rey.

Además, se contó por tratamiento el número total de microtubérculos formados por frasco de cultivo, el número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de propagación (aquellos que presentaron una masa fresca superior a 0,5 gMF, un diámetro superior a los 5,0 mm y no mostraron apariencia acuosa). Se tomó una muestra de 15 microtubérculos aprovechables en cada una de las repeticiones por tratamiento, y se le determinó el contenido de materia seca (%) al multiplicar la masa seca de los mismos por 100 y dividir entre la masa fresca.

Los datos relativos al número de microtubérculos formados por planta, masa fresca, masa seca y diámetro de los microtubérculos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no paramétrica de Kruskall Wallis.

La comparación de las medias del número de microtubérculos total aprovechables, y el contenido de materia seca se realizaron por un análisis de varianza simple y se empleó la prueba de Tukey.

Resultados y discusión

Efecto del tiempo de inmersión en la formación de los microtubérculos

El tiempo de inmersión en el SIT influyó de forma significativa en la formación de los microtubérculos. Con un tiempo de inmersión de 15 min se alcanzaron los mejores resultados para las variables evaluadas, con diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos (tabla 1).

Con un tiempo de inmersión de 15 min. se obtuvo a las 18 semanas de cultivo el mayor número total de microtubérculos por SIT y el mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación con diferencias significativas respecto al resto de los tiempos de inmersión evaluados (figura 1). Los microtubérculos aprovechables formados en el tiempo de inmersión de 15 min. presentaron, además, el mayor contenido de materia seca con diferencias estadísticas significativas en comparación con los formados en el resto de los tiempos de inmersión (figura 2).

Como no fue posible encontrar referencias respecto al efecto del tiempo de inmersión en el SIT sobre la formación de microtubérculos de ñame, los resultados se discuten con los logrados por investigadores como Teisson y Alvard (1999) y Pérez (2001), quienes evaluaron varios tiempos de inmersión en la producción de microtubérculos de papa en SIT. Teisson y Alvard (1999), en el sistema de cultivo tipo RITA, obtuvieron los mejores resultados con un tiempo de inmersión de 60 min. Mientras, Pérez (2001), en el SIT conformado por frasco de cultivo de 3500 mL de capacidad obtuvo con 2 min de inmersión las mejores respuestas en la formación de los microtubérculos para las variables evaluadas: número de microtubérculos por frasco de cultivo, peso freso y diámetro de los mismos. Según estos investigadores, con ese tiempo de inmersión se logró en cada uno de los sistemas de cultivo en función de los requerimientos de las plantas un ambiente gaseoso favorable para el proceso de tuberización, debido a que fue posible mantener en el interior del frasco de cultivo una concentración de oxígeno y dióxido de carbono cercana a la concentración atmosférica, y se logró remover completamente la acumulación de etileno de la atmósfera interna del mismo. Estas condiciones de cultivo que favorecieron el proceso de microtuberización en el cultivo de la papa se debieron haber presentado durante la formación de microtubérculos de ñame en el SIT con un tiempo de inmersión de 15 min.

En la formación de los microtubérculos, cuando se empleó en el SIT la frecuencia de inmersión cada 6 horas, se obtuvieron los mejores resultados para las variables evaluadas, con diferencias significativas respecto al resto de las frecuencias de inmersión (tabla 2).

McAlister et al. (2005) y Mehrotra et al. (2007) han descrito que la frecuencia de inmersión influye en la renovación de la atmósfera interna del frasco de cultivo, así como en la disponibilidad y asimilación por el material vegetal del medio de cultivo, según el estado de desarrollo del mismo. Por lo anterior, se hace necesario determinar la frecuencia de inmersión según la fase de cultivo para satisfacer los requerimientos del material vegetal (Escalona, 2006).

Con relación al número total de microtubérculos formados por SIT, y al número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación, también se obtuvieron con una frecuencia de inmersión cada 6 horas los mejores resultados, con diferencias significativas respecto al resto de las frecuencias de inmersión evaluadas (figura 3). Los microtubérculos aprovechables formados con una frecuencia de inmersión cada 6 horas presentaron, además, el mayor contenido de materia seca con diferencias estadísticas significativas en comparación con los formados en otras frecuencias de inmersión (figura 4).

Los mejores resultados en la formación de los microtubérculos con una frecuencia de inmersión cada 6 horas en el SIT se deben a que con esta frecuencia se logró una mejor renovación en la composición de los gases que conforman la atmósfera interna del frasco de cultivo, y una disponibilidad de nutrientes en función de los requerimientos de las plantas cultivadas in vitro para la tuberización, más eficaz en comparación con las frecuencias de inmersión cada 3, 12 y 24 horas. Según Piao et al. (2003), el frecuente contacto del medio de cultivo con las plantas de papa indujo, luego de finalizada la inmersión, un incremento en la producción de dióxido de carbono, un aumento en la formación de microtubérculos hiperhidratados, así como una mayor actividad de enzimas relacionadas con el estrés oxidativo, lo cual provocó una menor asimilación de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo. Este estrés pudo haber ocurrido en las plantas de ñame cultivadas en una frecuencia de inmersión cada 3 horas, y haber sido la causa por la cual se presentaron resultados inferiores respecto a la frecuencia de inmersión cada 6 horas, en la cual se obtuvieron los microtubérculos de mayor calidad. En comparación con las frecuencias de inmersión cada 12 y 24 horas, al estar las plantas in vitro en contacto con el medio de cultivo cada 6 horas, tuvieron mayores posibilidades de asimilar los nutrientes de éste, y acumular mayor cantidad de sustancias de reservas, lo que se ve reflejado en los más altos valores para la masa fresca, seca y porcentaje de materia seca de los microtubérculos.

En la formación de los microtubérculos se alcanzaron los mejores resultados al emplear un volumen de 60 ó 90 mL de medio de cultivo por planta cultivada in vitro en el SIT, sin diferencias significativas entre ellos para las variables evaluadas, excepto para la masa seca de los microtubérculos, en la cual se presentaron diferencias significativas entre ambos. Las plantas cultivadas en estos volúmenes de medio de cultivo presentaron diferencias significativas respecto a los demás volúmenes empleados (tabla 3).

En cuanto al mayor número de microtubérculos formados por frasco de cultivo de inmersión temporal, con un volumen de 60 ó 90 mL de medio de cultivo por planta in vitro se obtuvieron los mejores resultados a las 18 semanas de cultivo sin diferencias significativas entre ellos, pero sí con respecto al resto de los volúmenes de medio de cultivo por planta in vitro evaluados. El mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación se alcanzó con 60 mL de medio de cultivo por planta in vitro cultivada en el SIT, con diferencias significativas respecto al resto de los volúmenes de medio de cultivo evaluados (figura 5).

Los microtubérculos aprovechables obtenidos con el empleo de un volumen de 60,0 mL de medio de cultivo por planta in vitro presentaron el mayor contenido de materia seca con diferencias significativas respecto al resto de los volúmenes evaluados por planta in vitro (figura 6).

La formación de los microtubérculos y la calidad de los mismos en el SIT estuvieron influenciados por el efecto del volumen de medio de cultivo por planta in vitro. Con 60 y 90 mL de medio de cultivo se les propició a las plantas mayor disponibilidad de nutrientes para la tuberización en comparación con los volúmenes de 15 y 30 ml de medio de cultivo por planta, aspecto que se reflejó en los más altos valores de masa fresca logrados en los microtubérculos formados con 60 y 90 mL de medio de cultivo por planta in vitro. Además, al disponerse de un mayor volumen total de medio de cultivo, existió más posibilidad de que un mayor número de yemas axilares recibieran el estímulo inductor para la formación de los microtubérculos. Las afectaciones provocadas con 90 mL de medio de cultivo por planta in vitro, en cuanto a una menor masa seca de los microtubérculos y al número de microtubérculos aprovechables, pudo estar relacionada a más del 50% de los microtubérculos formados en el SIT con este volumen de medio de cultivo permanecieron mayor tiempo de contacto con el mismo, en comparación con el volumen de 60 mL de medio de cultivo por planta in vitro. Martre et al. (2001) y Piao et al. (2003) refirieron que un prolongado tiempo de contacto del medio de cultivo con el material vegetal puede crear estrés en el material vegetal, lo cual se reflejó en menor masa seca y porcentaje de contenido de materia seca en comparación con el volumen de 60 mL de medio de cultivo por planta in vitro.

1 Berthouly, M.., Etienne, H. 2005. Temporary immersion systems: a new concept for use liquid medium in mass propagation. En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 165-195.        [ Links ]

2 Chakrabarty, D., Dewir, Y.H., Hahn, E.J., Datta, S., Paek, K.Y. 2006. The dynamics of nutrient utilization and growth of apple root stock ‘M9 EMLA’ in temporary versus continuous immersion bioreactors. Plant Growth Regulation 43: 184-189.        [ Links ]

3 Chen, F.Y., Wang, D., Gao, X., Wang, L. 2007. The effect of plant growth regulators and sucrose on the micropropagation of Dioscorea nipponica makino. Plant Growth Regulation 26: 38-45.        [ Links ]

4 Donnelly, J., Coleman, D.K.W., Coleman, S. 2003. Potato microtuber production and peformance: A Review. Amer J of Potato Res 80: 103-115.        [ Links ]

5 Escalona, M. 2006. Temporary immersion beats traditional techniques on all fronts. Prophyta annual, 48-50.        [ Links ]

6 Jasik, J., Mantell, S.H. 2000. Effect of jasmonic acid and its methylester on in vitro microtuberization of three food yam (Dioscorea) species. Plant Cell Reports 19: 863-867.        [ Links ]

7 Jiménez, E. 2005. Mass propagation of tropical crops in temporary immersion systems. En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 197-211.        [ Links ]

8 Martre, P., Lacan, D., Just, D., Teison, C. 2001. Physiological effects of temporary immersion on Hevea brasiliensis callus. Plant Cell Tissue and Organ Culture 67: 25-35.        [ Links ]

9 Mbanaso, E.N.A., Chukwu, L.I., Opara, M.U.A. 2007. In vitro basal and nodal microtuberization in yam shoot cultures (Discorea rotundata Poir, cv. Obiaoturugo) under nutritional stress conditions. African Journal of Biotechnology 6 (21): 2444-2446.        [ Links ]

10 McAlister, B., Finnie, J., Watt, M.P., Blakeway, F. 2005. Use of the temporary immersion bioreactor system (RITA®) for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests (SA). En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 425–442.        [ Links ]

11 Mehrotra, S., Manoj, G., Arun, K., Bhartendu, M. 2007. Efficiency of liquid culture systems over conventional micropropagation: A progress towards commercialization. African Journal of Biotechnology 6 (13): 1484-1492.        [ Links ]

12 Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.        [ Links ]

13 Ovono, P. O., Kevers, C., Dommes, J. 2007. Axillary proliferation and tuberization of Dioscorea cayenensis-D. rotundata complex. Plant Cell Tissue and Organ Culture 91: 107-114.        [ Links ]

14 Pérez, N., De Feria, M., Jiménez, E., Capote, A., Chávez, M., Quiala, E. 2001. Empleo de Sistemas de Inmersión Temporal para la producción a gran escala de tubérculos in vitro de Solanum tuberosum L. var. Atlantic y estudio de su comportamiento en el campo. Revista Biotecnología Vegetal 1 (1): 11-17.        [ Links ]

15 Piao, X. C., Chakrabarty, D., Hahn, E. J., Paek, K. Y. 2003. A simple method for mass production of potato microtubers using a bioreactor system. Current Science 84 (8): 1129-1132.        [ Links ]

16 Salazar, D., Hoyos, S. 2007. Multiplicación y tuberización in vitro de ñame (Dioscorea alata L.) en sistema de inmersión temporal. Rev Fac Nal Agr Medellín 60 (2): 3907-3921.        [ Links ]

17 Scott, G., Rosegrant, M., Ringler, C. 2006. Roots and tubers for the 21st Century: Trends, projections, and policy options. Food, Agriculture and the Environment Discussion 31. Washington, DC: International Food Policy Research Institute (IFPRI) and International Potato Center (CIP).        [ Links ]

18 Takayama, S., Akita, M. 2005. Practical aspects of bioreactor application in mass propagation of plants. En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 61-78.        [ Links ]

19 Teisson, C., Alvard, D. 1999. In vitro production of potato microtubers in liquid medium using temporary immersion. Potato Research 42: 499-504.        [ Links ]

20 Zobayed, S. M. A. 2005. Ventilation in micropropagation. En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 143-182.        [ Links ]